Las estructuras adultas de Drosophila se derivan de estructuras en forma de saco llamadas discos imaginales. El análisis de estos discos proporciona información sobre muchos procesos de desarrollo, incluida la determinación de tejidos, el establecimiento de límites de compartimentos, la proliferación celular, la especificación del destino celular y la polaridad celular plana. Este protocolo se utiliza para preparar discos imaginales para microscopía óptica/fluorescente.
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Artículo de método
La disección y la inmunotinción de imaginal discos de Drosophila melanogaster
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Resumen
Resumen
Una parte importante del desarrollo post-embrionario en la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se lleva a cabo dentro de un conjunto de estructuras en forma de saco llamadas discos imaginales. Estos discos dan lugar a un alto porcentaje de estructuras adultas que se encuentran dentro de la mosca adulta. Aquí se describe un protocolo que ha sido optimizada para recuperar estos discos y prepararlos para el análisis con anticuerpos, marcadores transcripcionales y trampas de proteína. Este procedimiento es el más adecuado para los tejidos finos como los discos imaginales, pero se puede modificar fácilmente para su uso con tejidos más gruesos, como el cerebro y el adulto ovario larval. El protocolo escrito y video que acompaña guiarán el lector / espectador a través de la disección de las larvas de tercer estadio, la fijación de tejido, y el tratamiento de los discos imaginales con anticuerpos. El protocolo se puede utilizar para diseccionar discos imaginales de larvas jóvenes primero y segundo instar también. La ventaja de este protocolo es que es relativamente corto y tiene seres optimizado para la preservación de la alta calidad del tejido diseccionado. Otra ventaja es que el procedimiento de fijación que se emplea funciona bien con el abrumador número de anticuerpos que reconocen proteínas de Drosophila. En nuestra experiencia, hay un número muy pequeño de anticuerpos sensibles que no funcionan bien con este procedimiento. En estas situaciones, el remedio parece ser el uso de un cóctel de fijación alternativo sin dejar de seguir las pautas que hemos establecidos para los pasos de disección e incubaciones de anticuerpos.
Introducción
Durante más de un siglo la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, ha sido un sistema principal para estudiar el desarrollo, comportamiento y fisiología. Desarrollo en la mosca se puede dividir en dos grandes etapas: embrionarias y post-embrionarias con gran parte de la toma lugar dentro de este último epitelios monocapa llamadas discos imaginales 1-3. Dibujos de los discos imaginales se publicaron por primera vez en 1864 por August Weismann como parte de su amplia monografía sobre el desarrollo del insecto 1. Estos discos comienzan su desarrollo durante la embriogénesis, se modelan durante las etapas larvales, so....
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Protocolo
1 Preparación de larvas
- Llene un 35 mm placa de Petri con tampón de disección.
- Coloque las larvas en placa de Petri y les permiten nadar alrededor durante unos minutos (paso de auto-limpieza).
- Transferencia de las larvas a una piscina de tampón de disección en una placa de disección a base de silicona. Esta piscina debe estar en un borde de la placa. La placa de disección consiste en una solución de silicona que ha sido vertido y endurecido dentro de una placa de Petri de vidrio.
- Usando una pipeta pasteur-, colocar un mayor número de tampón de disección en el medio de la placa de disección.
- Utilizando # 5 pinzas, tra....
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Resultados
El método que se ha descrito anteriormente de forma fiable produce material de alta calidad para el análisis con sondas in situ, reporteros transcripcionales, trampas de proteínas y anticuerpos. En la Figura 1 mostramos ojo-antena, genitales, ala, haltera y piernas discos que se recuperan de forma rutinaria con este método. Estos discos han sido tratados con un fluoróforo-faloidina conjugada, que se une a la actina F y por lo tanto describe cada célula. Si el tejido ha sido fijado correctamente.......
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Discusión
Aunque este procedimiento se ha centrado en gran medida en el aislamiento y el tratamiento posterior de los discos de ojo de antenal, es susceptible de ser utilizado para aislar y analizar el ala, haltere, la pierna y discos genitales (Figura 4). La única modificación necesaria del protocolo para el aislamiento de estos discos (en comparación con el disco de ojos antenal) es el método de disección gruesa (sección 2 del protocolo). El primer tramo (T1) par torácica se encuentra en la parte anterior de la.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a Donald Ready y Kevin Moisés para enseñar JPK el procedimiento de disección disco imaginal originales. También queremos agradecer a Bonnie Weasner para el disco genital en la Figura 1B y el ojo de disco en la Figura 2A, Brandon Weasner para la Figura 3, el Stock Center Bloomington Drosophila para las manchas de moscas y el Banco hibridoma Estudios del Desarrollo de anticuerpos. CMS ha sido apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) GCMS Training Grant (T32-GM007757), el Frank W. Putnam Becas de Investigación, y el Robert Briggs Beca de Investigación. JPK es apoyado ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sylgard 184 Kit de Elastómero de Silicona | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5 KG | Se utiliza para crear la base de la placa de disección |
| Pryex Placa de Petri de vidrio 150 x 20 mm | Dow Corning | 3160-152CO | Utilice la cubierta para la placa de disección |
| #5 Pinzas de disección | Ted Pella | 525 | Las pinzas deben mantenerse muy afiladas |
| 9 pozos de vidrio | de reloj Vendedores Voluntarios | Se utiliza para la fijación de complejos de discos imaginales | |
| Matraz Erlenmeyer de 50 ml | Varios proveedores Barra | ||
| agitación pequeña | Varios proveedores | Lo suficientemente pequeño como para caber en el matraz Erlenmeyer | |
| 50 ml Tubos cónicos Varios | proveedores | ||
| Tubos de microfuga de 1,5 ml | Varios proveedores | Claro u oscuro según la aplicación | |
| Estante | de microfugaVarios Proveedores | ||
| Rotador de Sobremesa | Varios Proveedores | 100 μ l volumen no debe salpicar a baja | |
| temperatura Paraformaldehído | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Sirve como fijador |
| Fosfato de sodio monobásico | Sigma Chemical Co | S-3139 | Se utiliza para hacer tampones de disección y lavado |
| Fosfato de sodio Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Se utiliza para hacer tampones de disección y lavado |
| Lisina | Acros Organics | 125221000 | Utilizado en la solución fijadora |
| Periodato de sodio | Sigma Chemical Co | S-1878 | Utilizado en la solución fijadora |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Se utiliza para perforar discos imaginales |
| Hidróxido de sodio | EM Science | SX0593-3 | Se utiliza para disolver paraformaldehído |
| 100% normal Suero de cabra | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Sirve como solución de bloqueo |
| Anticuerpos primarios | Varios proveedores | Diluir en suero de cabra al 10% según las indicaciones del fabricante | |
| Anticuerpos secundarios | Varios proveedores | Diluir en suero de cabra al 10% según las indicaciones del fabricante | |
| Sondas moleculares | Vectashield | H-1000 | Evita el blanqueo de las muestras |
| Portaobjetos de microscopio | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Cubreobjetos de vidrio 18 x 18 mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Varios proveedores | Evita que los portaobjetos de vidrio se adhieran a la base de silicona | |
| Panit Brush 000 | Varios proveedores | Úselo para bajar suavemente el cubreobjetos sobre las muestras |
Referencias
- Weismann, A. Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria. Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).
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Reimpresiones y permisos
