La disección y la inmunotinción de imaginal discos de Drosophila melanogaster

Resumen

Las estructuras adultas de Drosophila se derivan de estructuras en forma de saco llamadas discos imaginales. El análisis de estos discos proporciona información sobre muchos procesos de desarrollo, incluida la determinación de tejidos, el establecimiento de límites de compartimentos, la proliferación celular, la especificación del destino celular y la polaridad celular plana. Este protocolo se utiliza para preparar discos imaginales para microscopía óptica/fluorescente.

Resumen

Una parte importante del desarrollo post-embrionario en la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se lleva a cabo dentro de un conjunto de estructuras en forma de saco llamadas discos imaginales. Estos discos dan lugar a un alto porcentaje de estructuras adultas que se encuentran dentro de la mosca adulta. Aquí se describe un protocolo que ha sido optimizada para recuperar estos discos y prepararlos para el análisis con anticuerpos, marcadores transcripcionales y trampas de proteína. Este procedimiento es el más adecuado para los tejidos finos como los discos imaginales, pero se puede modificar fácilmente para su uso con tejidos más gruesos, como el cerebro y el adulto ovario larval. El protocolo escrito y video que acompaña guiarán el lector / espectador a través de la disección de las larvas de tercer estadio, la fijación de tejido, y el tratamiento de los discos imaginales con anticuerpos. El protocolo se puede utilizar para diseccionar discos imaginales de larvas jóvenes primero y segundo instar también. La ventaja de este protocolo es que es relativamente corto y tiene seres optimizado para la preservación de la alta calidad del tejido diseccionado. Otra ventaja es que el procedimiento de fijación que se emplea funciona bien con el abrumador número de anticuerpos que reconocen proteínas de Drosophila. En nuestra experiencia, hay un número muy pequeño de anticuerpos sensibles que no funcionan bien con este procedimiento. En estas situaciones, el remedio parece ser el uso de un cóctel de fijación alternativo sin dejar de seguir las pautas que hemos establecidos para los pasos de disección e incubaciones de anticuerpos.

Introducción

Durante más de un siglo la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, ha sido un sistema principal para estudiar el desarrollo, comportamiento y fisiología. Desarrollo en la mosca se puede dividir en dos grandes etapas: embrionarias y post-embrionarias con gran parte de la toma lugar dentro de este último epitelios monocapa llamadas discos imaginales ^1-3. Dibujos de los discos imaginales se publicaron por primera vez en 1864 por August Weismann como parte de su amplia monografía sobre el desarrollo del insecto ^1. Estos discos comienzan su desarrollo durante la embriogénesis, se modelan durante las etapas larvales, sobrevivir a la histolysis masiva de las primeras etapas de pupa, y en última instancia, dar lugar a un alto porcentaje de estructuras adultas que se encuentran dentro de la mosca adulta ^1-14. Durante el desarrollo larvario cada disco hace varias decisiones críticas con respecto a la suerte, forma y tamaño. Dentro de la primera y segunda etapas larvales, los discos tienen la tarea de adoptar un destino primario, establisHing límites de compartimento, la adopción de la forma correcta y generar el número necesario de células ^15-16. Durante el tercer estadio larval y la etapa pre-pupa temprano, los discos imaginales continúan dividiéndose y se modelan como células adoptan sus destinos terminales ^16.

Durante la historia temprana de la biología del desarrollo de Drosophila, discos imaginales se estudiaron casi exclusivamente en el contexto del desarrollo normal y en los pocos casos en los que una pérdida o mutante de ganancia de función era viable. El uso de rayos X para inducir la recombinación mitótica permitido para las mutaciones letales para ser analizada en clones de células dentro de los tejidos de larvas y adultos. Este método ha sido mejorado por la introducción de métodos transgénicos para analizar la pérdida y ganancia de función de las mutaciones en ambos tejidos de larvas y adultos. El número de anticuerpos, reporteros transcripcionales y trampas de proteína para describir el paisaje molecular de tipo salvaje y mutantes tejidos es también constndo RT crecimiento. El uso de estos marcadores moleculares para analizar la pérdida y ganancia de función de clones de células mutante ha hecho cada vez más factible obtener una comprensión en tiempo real de cómo las células mutantes se desvían de sus primos de tipo salvaje durante el desarrollo. Para aprovechar adecuadamente estas herramientas y reactivos que es fundamental contar con los preparativos de la alta calidad de los discos imaginales que se pueden ver, fotografiados y analizados. El objetivo de este manuscrito es proporcionar un protocolo optimizado para el aislamiento y la preparación del complejo de disco ojo antenal (Figura 1A). También puede ser utilizado con éxito para aislar una amplia variedad de discos adicionales, incluyendo los que dan lugar a las alas, haleteres, piernas T1-T3 y los genitales (Figura 1B-E). Este procedimiento, con modificaciones menores, se ha utilizado para aislar los discos imaginales de Drosophila durante casi ochenta años.

Como se describió anteriormente, ya que la mayoría de los genes se expresan durante multiple etapas de desarrollo y en una multitud de tejidos, a menudo es imposible estudiar los efectos que tienen los mutantes nulos en todo el ojo como el animal muere mucho antes de la etapa de larva de tercer instar. Cuatro métodos han hecho el estudio de los tejidos más desarrollados, como la retina significativamente más manejable. El primero es el método flipasa (FLP) / flipasa Recombinación Target (FRT) de generar clones de células mutantes dentro de un tipo de tejido de otro modo salvaje ^17-19. En este caso, el tejido mutante se identifica por la ausencia de un marcador visual tal como la proteína fluorescente verde (GFP) y puede ser comparado con el tejido circundante de tipo salvaje en la que está presente GFP (Figura 2D). El segundo es el método "flp-out" en el que un transgén se expresa en una población de células ^20. En este caso, los clones de células se identifican por la presencia de GFP y se compararon con el tejido circundante de tipo salvaje que carece del reportero GFP (Figura2E). El tercero es el Análisis Mosaico con una técnica de marcador celular reprimible (MARCM), que combina elementos de los sistemas de expresión de FLP-Salida ²¹ clon mutante FLP / FRT y. Con este método un transgén puede ser expresado dentro de una población de células que son simultáneamente mutante para un locus genético individual. Como clones flp-out, MARCM clones se identifican por la presencia de GFP y se comparan con el tejido circundante de tipo salvaje que carece del marcador de GFP (Figura 2F). Y por último, los genes y las construcciones de ARNi se pueden expresar dentro de los tejidos imaginales bajo el control de constructos específicos promotor GAL4. Estos cuatro métodos han aumentado el interés en el estudio de los discos imaginales desde clones mutantes o patrones o sobre-expresión se pueden comparar directamente con los tejidos de tipo natural adyacente. El método descrito en este procedimiento ha sido desarrollado para que los investigadores que estudian el desarrollo post-embrionario de los tejidos adultos en Drosophila,especialmente las derivadas de la disco-ojo antenal, podrán obtener tejido de alta calidad para el análisis. Aunque los investigadores individuales han hecho ligeras modificaciones, el núcleo de este procedimiento (que se describe aquí) se ha mantenido prácticamente inalterada. Desde la obtención de tejido de alta calidad es fundamental para el estudio de los discos imaginales Esperamos que este protocolo escrito y video que acompaña servirán como recurso didáctico valioso.

Protocolo

1 Preparación de larvas

1. Llene un 35 mm placa de Petri con tampón de disección.
2. Coloque las larvas en placa de Petri y les permiten nadar alrededor durante unos minutos (paso de auto-limpieza).
3. Transferencia de las larvas a una piscina de tampón de disección en una placa de disección a base de silicona. Esta piscina debe estar en un borde de la placa. La placa de disección consiste en una solución de silicona que ha sido vertido y endurecido dentro de una placa de Petri de vidrio.
4. Usando una pipeta pasteur-, colocar un mayor número de tampón de disección en el medio de la placa de disección.
5. Utilizando # 5 pinzas, transferir una sola larva limpiado desde la pequeña piscina de la piscina más grande de tampón de disección.

2. Grueso Disección de larvas

1. Mientras que la larva está todavía dentro de la gran piscina de búfer disección estrechar la larva con las pinzas. Un par de fórceps se debe utilizar para agarrar los ganchos de la boca mientras que el otro par de pinzas se utiliza para mantener la animal todavía (agarrar la larva suavemente a un tercio la longitud del cuerpo).
2. Mantener estable el par de pinzas que contienen la cutícula cerca de los ganchos de la boca mientras se tira rápidamente el resto del cuerpo de distancia con el segundo par de pinzas.
3. Cuando la larva comienza a desgarrar usted se sentirá una leve liberación de la tensión. Suelte la larva de las pinzas y permitir las "entrañas" de la larva a derramarse. Esto permite que los discos imaginales a permanecer en su conformación normal y les impide que se deforme.
4. Con un par de pinzas agarrar los ganchos de la boca de nuevo para sujetar el extremo frontal de la larva en su lugar. Usando el otro par de fórceps extirpar la sección inferior 2/3 de las larvas incluyendo las agallas interiores. Nota: un complejo que contiene los ganchos de la boca, los discos de ojos antenal, hemisferios cerebrales, ganglio ventral, las glándulas salivales, algunos discos de la pierna, y la cutícula que recubre permanecerán.
5. Con un par de pinzas eliminar suavemente la cutícula suprayacente, glándulas salivales, los discos y las piernasotro tejido. Nota: sólo el tejido que debe permanecer es los ganchos de la boca, los discos de ojos antenal, hemisferios cerebrales, y el ganglio ventral (Figura 3).
6. Repita los pasos 2.1 a 2.5 con larvas adicional durante 15-20 min. Nota: Los discos imaginales que permanecen en tampón de disección durante períodos de tiempo más largos tienden a degradarse y, finalmente, aparecen como menos de ejemplares ideales para ser fotografiados. Así, después de un máximo de 20 min todos los tejidos disecados deben ser transferidos a la fijador PLP (ver más abajo).

3. fijación y la tinción de tejido con anticuerpos

1. El uso de un Pipetman P-200, transfiera los tejidos disecados a un vidrio de reloj que contiene frío paraformaldehído-lisina-Periodato (PLP) fijador. Límite de volumen de tampón de disección transferido a 50 l para minimizar la dilución de PLP. Asegúrese de cortar la punta con una cuchilla de afeitar de manera que la abertura de la punta es lo suficientemente grande para dar cabida a los tejidos disecados. Con un par de pinzas ouna aguja de tungsteno asegurar que los tejidos disecados están completamente sumergidos en orden para la fijación adecuada que se produzca. Incubar los tejidos disecados en fijador PLP frío durante 45 min. Esta incubación puede tener lugar a temperatura ambiente sin agitación.
2. El uso de un Pipetman P-200, transferir los tejidos disecados a tampón de lavado (RT) utilizando otra punta amarilla cortar durante 45 min. Límite de volumen PLP transferido a 50 l para reducir al mínimo la dilución del tampón de lavado. Nota: todos los tejidos disecados deben estar totalmente sumergidos.
3. Transferencia de 20-30 conjuntos de tejido diseccionado a 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Nota: si los números más grandes de los complejos de disco de ojo de antenal se combinan dentro del tubo, hay una posibilidad de que el tejido en la parte inferior del tubo no quedará correctamente expuesto a los anticuerpos. Para obtener resultados óptimos no más de 20-30 complejos de disco antenal oculares deben estar presentes dentro de un único tubo. El tejido diseccionado se depositan en el fondo del tubo de microcentrífuga. Pasos Por lo tanto, en posteriores use una Pipetman de quitar y reemplazar el tampón de lavado, solución de bloqueo, y los anticuerpos.
4. Retire tampón de lavado y reemplazar con 100 l de solución de bloqueo: 10% de suero normal de cabra en tampón de lavado. Incubar a temperatura ambiente con rotación suave en una parte superior de los rotadores mesa para 10 min.
5. Eliminar la solución de bloqueo y reemplazar con 100 l de anticuerpos primarios que se han diluido apropiadamente en 10% de suero normal de cabra. Incubar a temperatura ambiente con rotación suave durante 16 horas.
6. Retire anticuerpos primarios y reemplazar con 750 l de tampón de lavado. Colocar los tubos en un nutator y permitir a nutate a TA durante 10 min. Nota: El anticuerpo primario se puede guardar (almacenar a 4 ° C) y volver a utilizar más adelante. La reutilización de anticuerpos múltiples veces puede ayudar en la reducción de la unión no específica.
7. Permitir cabezas a asentarse en el fondo del tubo, a continuación, eliminar el tampón de lavado y se añaden 100 l de anticuerpos secundarios que han sido diluidos apropiadamente en 10% de suero normal. Incubar a temperatura ambiente con rotación suave para 2̵1; 4 hr.
8. Retire soluciones de anticuerpos secundarios de tejidos y reemplazar con 500 l de tampón de lavado. Permitir que el tejido se depositan en el fondo del tubo.
9. El uso de un P-200 y una punta amarilla corte, transferir todos los tejidos disecados a una piscina de tampón de lavado que se ha colocado en el plato de disección. Mientras que proceder con el siguiente paso de la disección fina, el tejido se incuba en el tampón de lavado. Esto ayuda a eliminar el exceso de anticuerpos secundarios.

4. Fine Disección de Eye-antenal discos Complejos y montaje en portaobjetos

1. Utilice un par de fórceps para estrechar la cutícula por los ganchos de la boca con el lado ventral del complejo hacia abajo. Con un segundo par de pinzas quitar los dos lóbulos cerebrales mediante el cierre de los segundos fórceps en el espacio entre los discos del cerebro y del ojo (Figura 3, flecha roja) y rápidamente tirando del cerebro lejos de los ganchos de la boca.
2. Sin dejar de aferrarse a los ganchos de la boca, pellizcarel tejido lo más cerca posible a la conexión entre la sección de antenal del disco de ojos antenal y los ganchos de la boca (Figura 3, flecha azul). Nota: los complejos de disco antenal ojos deben estar libres de todo el tejido (Figura 1A). Continúe hasta que todo el tejido deseado deseada que puede ser colocado en portaobjetos ha sido diseccionado. Este protocolo se puede adaptar para aislar ala, haltere, la pierna y discos imaginales genitales (Figura 1B-E).
3. Añadir dos pequeños trozos de papel de seda (tamaño del cubreobjetos) aproximadamente 3 pulg. De distancia en el plato de disección. Coloque una lámina de vidrio sobre el plato - los dos trozos de papel de seda deben estar bajo los términos de la diapositiva. Esto evitará que la corredera se pegue a la base de silicona del plato de disección.
4. El uso de un P-20 con una punta sin cortar, añadir 9 l de un agente anti-blanqueamiento a la mitad del portaobjetos de microscopio de vidrio. Esto evita la decoloración de los tejidos cuando se ve con fluorescenteluz.
5. Usando la misma punta sin cortar, recoger todos los discos de ojos antenal y añadirlos a la gota de reactivo anti-blanqueo. Minimizar la cantidad de tampón de lavado que se lleva sobre. Trate de limitar la cantidad de tampón de lavado a 10 l o menos.
6. Use un par de pinzas para separar y extender los discos de ojos antenal dentro de la gota de reactivo anti-blanqueo. Permitir que los discos se incuben en el reactivo anti-blanqueo por varios minutos. Nota: Los discos se volverán claros como el tejido absorbe el reactivo anti-blanqueo.
7. El uso de un pincel fino baje suavemente un cubreobjetos sobre la muestra. Esto evita la formación de burbujas de aire.
8. Tienda desliza a -20 ° C hasta el momento de ver los discos imaginales ojo-antenales u otros que utilizan la luz o microscopía de fluorescencia.

Resultados

El método que se ha descrito anteriormente de forma fiable produce material de alta calidad para el análisis con sondas in situ, reporteros transcripcionales, trampas de proteínas y anticuerpos. En la Figura 1 mostramos ojo-antena, genitales, ala, haltera y piernas discos que se recuperan de forma rutinaria con este método. Estos discos han sido tratados con un fluoróforo-faloidina conjugada, que se une a la actina F y por lo tanto describe cada célula. Si el tejido ha sido fijado correctamente...

Discusión

Aunque este procedimiento se ha centrado en gran medida en el aislamiento y el tratamiento posterior de los discos de ojo de antenal, es susceptible de ser utilizado para aislar y analizar el ala, haltere, la pierna y discos genitales (Figura 4). La única modificación necesaria del protocolo para el aislamiento de estos discos (en comparación con el disco de ojos antenal) es el método de disección gruesa (sección 2 del protocolo). El primer tramo (T1) par torácica se encuentra en la parte anterior de la...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sylgard 184 Kit de Elastómero de Silicona	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5 KG	Se utiliza para crear la base de la placa de disección
Pryex Placa de Petri de vidrio 150 x 20 mm	Dow Corning	3160-152CO	Utilice la cubierta para la placa de disección
#5 Pinzas de disección	Ted Pella	525	Las pinzas deben mantenerse muy afiladas
9 pozos de vidrio	de reloj Vendedores Voluntarios		Se utiliza para la fijación de complejos de discos imaginales
Matraz Erlenmeyer de 50 ml	Varios proveedores Barra
agitación pequeña	Varios proveedores		Lo suficientemente pequeño como para caber en el matraz Erlenmeyer
50 ml Tubos cónicos Varios	proveedores
Tubos de microfuga de 1,5 ml	Varios proveedores		Claro u oscuro según la aplicación
Estante	de microfugaVarios Proveedores
Rotador de Sobremesa	Varios Proveedores		100 μ l volumen no debe salpicar a baja
temperatura Paraformaldehído	Macron Chemicals	2-26555-1	Sirve como fijador
Fosfato de sodio monobásico	Sigma Chemical Co	S-3139	Se utiliza para hacer tampones de disección y lavado
Fosfato de sodio Dibasic	Sigma Chemical Co	71636	Se utiliza para hacer tampones de disección y lavado
Lisina	Acros Organics	125221000	Utilizado en la solución fijadora
Periodato de sodio	Sigma Chemical Co	S-1878	Utilizado en la solución fijadora
Triton X-100	EMD Chemicals	MTX1568-1	Se utiliza para perforar discos imaginales
Hidróxido de sodio	EM Science	SX0593-3	Se utiliza para disolver paraformaldehído
100% normal Suero de cabra	Jackson Laboratories	005-000-121	Sirve como solución de bloqueo
Anticuerpos primarios	Varios proveedores		Diluir en suero de cabra al 10% según las indicaciones del fabricante
Anticuerpos secundarios	Varios proveedores		Diluir en suero de cabra al 10% según las indicaciones del fabricante
Sondas moleculares	Vectashield	H-1000	Evita el blanqueo de las muestras
Portaobjetos de microscopio	Fischer Scientific	48312-003
Cubreobjetos de vidrio 18 x 18 mm	Fischer Scientific	12-542A
Kimwipe Tissue	Varios proveedores		Evita que los portaobjetos de vidrio se adhieran a la base de silicona
Panit Brush 000	Varios proveedores		Úselo para bajar suavemente el cubreobjetos sobre las muestras