C. elegans usualmente se cultivan en placas de agar sólido o en cultivos líquidos sembradas con E. coli. Para evitar subproductos bacterianos de confusión estudios toxicológicos y nutricionales, se utilizó un medio líquido axénicos, CEHR, para crecer y sincronizar un gran número de gusanos para una gama de aplicaciones posteriores.
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Artículo de método
El cultivo Caenorhabditis elegans En axénico Liquid Media y Creación de transgénicos Worms por bombardeo de micropartículas
En este artículo
Resumen
Resumen
En este protocolo, se presentan los materiales necesarios y el procedimiento para las C modificado. Correos Legans habituación y reproducción de medios (mCeHR). Además, los pasos para exponer y aclimatación C. elegans cultivadas en E. coli para axénicos medios líquidos se describen. Finalmente, los experimentos posteriores que utilizan axénicos C. elegans ilustran los beneficios de este procedimiento. La capacidad de analizar y determinar C. requerimiento de nutrientes elegans fue ilustrado por la creciente N2 gusanos de tipo salvaje en medios líquidos axénicos con concentraciones variables hemo. Este procedimiento puede ser replicado con otros nutrientes para determinar la concentración óptima para el crecimiento y el desarrollo gusano o, para determinar los efectos toxicológicos de los tratamientos farmacológicos. Los efectos de las concentraciones de hemo variadas en el crecimiento de los gusanos de tipo salvaje se determinaron a través de la observación microscópica cualitativa y cuantificando tl número de gusanos que crecieron en cada concentración de hemo. Además, el efecto de las concentraciones de nutrientes variadas puede ensayarse mediante la utilización de gusanos que expresan sensores fluorescentes que responden a los cambios en el nutriente de interés. Además, un gran número de gusanos fueron producidos fácilmente para la generación de transgénicos C. elegans utilizando bombardeo con micropartículas.
Introducción
El nematodo del suelo, el Caenorhabditis elegans, un organismo modelo de gran alcance usada en numerosos estudios de la genética a la toxicología. Como resultado de su tamaño de 1 mm, tiempo de generación rápida de cuatro días facilidad de cultivo, y un gran número de progenie, estos nematodos se han utilizado en un número de genéticos y farmacológicos pantallas 1, 2. Los investigadores se aprovechan de este gusano para identificar moléculas y vías conservadas en sistemas de vertebrados. Estas vías incluyen señales de muerte celular, vías de envejecimiento y el metabolismo, y el sistema nervioso 3-6. Además, la transparencia de C. e....
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Protocolo
1. Las cepas de gusano
- Obtener C. elegans de tipo salvaje cepas Bristol N2 desde el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) y mantenerlos en NGM placas sembradas con E. coli cepa OP50 7. Nota: gusano transgénico cepas IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) utilizados fueron generados a lo descrito previamente 11. IQ6011 puede ser solicitado al autor correspondiente.
2. Preparación de modificación C. elegans Habitation y Reproducción Medio (mCeHR)
Preparar medios líquidos mCeHR como se describe a con....
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Resultados
El cultivo de C. elegans en axénicos ayudas medio líquido en la determinación de los nutrientes que son requeridos por los gusanos, sin la interferencia de los metabolitos secundarios producidos por E. coli. Gusanos Wildtype N2 aclimatarse a los medios mCeHR plazo de tres generaciones y muestran un crecimiento similar a los gusanos que crecen en placas bacterianas NGM. De hecho, estos gusanos se convierten en hembras grávidas dentro de 4 días, en comparación con 3,5 días para los gusanos crecen en bact.......
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Discusión
En este protocolo se presenta un mCeHR modificado axénico medios líquidos que permite un rápido C. generación elegans con la producción de un gran número de gusanos. Este medio presenta diversas ventajas como los gusanos se cultivan sin contaminar E. coli o subproductos bacterianos y pueden ser explotados en los estudios nutricionales y toxicológicos. El uso de E. coli u otras bacterias en estos estudios tiene varios inconvenientes. Por ejemplo, el crecimiento de las bacterias puede c.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay que compiten intereses financieros o de conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de la HealthGrants DK85035 y DK074797 (IH).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| MgCl2• 6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Citrato de sodio | Sigma | S-4641 | |
| Citrato de potasio monohidratado | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2• 2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2• 4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2• 6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2• 2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosina 5 -monofosfato, sal sódica | Sigma | A-1752 | |
| Citidina 5 -fosfato | Sigma | C-1006 | |
| Guanosina 2' - y 3' -monofosfato | Sigma | G-8002 | |
| Uridina 5 -fosfato, sal disódica | Sigma | U-6375 | |
| Timina | Sigma | T0376 | |
| N-acetilglucosamina | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanina | Fisher | S25648 | |
| Ácido p-aminobenzoico | Sigma | A-9878 | |
| Biotina | Sigma | B-4639 | |
| Cianocobalamina (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinato (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacina | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamida | Sigma | N-3376 | |
| Panteteína | Sigma | P-2125 | |
| Pantotenato (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Ácido Pteroilglutámico (Ácido Fólico) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Piridoxal 5'-fosfato | Sigma | P-3657 | |
| Piridoxamina 2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Piridoxina HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavina 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Tiamina HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Ácido tióctico | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Citrato diácido de colina | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucosa | Sigma | G-7520 | |
| Hidrolizado enzimático de lactoalbúmina | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Cloruro de Hemin | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, sal sódica | Sigma | H-3784 | |
| Colesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Aminoácidos No Esenciales | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Solución de Aminoácidos | Invitrogen | 11130-051 | |
| Ácido nalidíxico sal sódica | Sigma | N4382 | |
| Clorhidrato de tetraciclina | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Sistema de administración BioRad | 165-2257 | ||
| Partículas de oro (Au Powder) | Sistemas de materiales ferroelectrónicos | 6420 2504, JZP01010KM | |
| o | |||
| partículas de oro 1.0 μ m | BioRad | 165-2263 |
Referencias
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans....
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Reimpresiones y permisos
