En vivo de imágenes de Dauer-específica neuronal Remodelación en C. elegans

Resumen

Después de la exposición a factores estresantes ambientales específicos, el nematodo Caenorhabditis elegans experimenta una amplia plasticidad fenotípica para entrar en una etapa juvenil 'dauer' resistente al estrés. Presentamos métodos para la inducción controlada y la obtención de imágenes de la neuroplasticidad durante el dauer.

Resumen

Los mecanismos que controlan el estrés inducido por la plasticidad fenotípica en animales son frecuentemente complejos y difíciles de estudiar in vivo. Un ejemplo clásico de la plasticidad inducida por el estrés es la etapa dauer de C. elegans. Dauers son una etapa larval de desarrollo alternativo formado bajo condiciones de bajas concentraciones de los alimentos bacteriana y altas concentraciones de una feromona Dauer. Dauers muestran amplia plasticidad del desarrollo y del comportamiento. Por ejemplo, un conjunto de cuatro cuadrantes interior-labial (IL2Q), las neuronas se someten a una amplia remodelación reversible durante la formación de Dauer. Utilizando la entrada vías ambientales de regulación Dauer bien conocido, un método previamente establecido para la producción de feromona Dauer crudo a partir de cultivos de nematodos líquido a gran escala se demuestra. Con este método, una concentración de 50.000 - 75.000 nemátodos / ml de cultivo líquido es suficiente para producir una muy potente feromona Dauer crudo. La potencia feromona crudo es determined mediante un bioensayo de respuesta a la dosis. Por último, se describen los métodos utilizados para in vivo time-lapse de los IL2Qs durante la formación de dauer.

Introducción

Plasticidad fenotípica, incluyendo la plasticidad del desarrollo y del comportamiento, es importante para las adaptaciones a las condiciones ambientales adversas y se considera una fuerza impulsora en la evolución ^1. C. elegans es un organismo modelo utilizado con frecuencia para estudios en el desarrollo y la neurobiología. En condiciones ideales, C. elegans se desarrolla a través de cuatro estadios larvarios antes de entrar en la etapa reproductiva de adultos. Sin embargo, en condiciones de baja disponibilidad de alimentos y las altas densidades de población, C. elegans puede someterse a un interruptor de desarrollo y entrar en una de larga duración y resistente a la tensión etapa Dauer ^2. Dauers muestran varias diferencias morfológicas y de comportamiento de los no dauers que probablemente median esta resistencia al estrés. Las señales ambientales y los mecanismos genéticos que regulan la entrada dauer han sido ampliamente descrito ^{3, 4, 5, 6, 7.} Sin embargo, los mecanismos moleculares que controlan los cambios fenotípicos individuales que ocurren ddauer formación urante son menos conocidos.

El examen de los fenotipos dauer específica requiere la producción de animales dauer. Esto se puede lograr de tres maneras: 1) Levantar partir de un cultivo de C. hambre elegans, 2) uso de la formación de dauer constitutiva (daf-c) mutantes, 3) Inducción de la formación de dauer través de feromona purificado. Es relativamente sencillo para recoger dauers de una placa estándar NGM con una C. población elegans que ha agotado su suministro de alimentos-bacteriana. En nuestras manos, una placa estándar NGM originalmente se siembra con 50 l de OP50 Escherichia coli, se dejó crecer durante 3 días y posteriormente inoculadas con 3 - 4 adultos hermafroditas se mantuvo a 25 ° C, se agotará el suministro de alimentos dentro de una semana y producir varios miles dauers dentro de 3 días adicionales (además de numerosos no dauers hambre). Sin embargo, este método es insatisfactorio para examinar procesos que ocurren durante la muda en dauer. Es difícil determinar cuál de los varios miles de animales en un plato típico hambriento están entrando en dauer. Además, el uso de una placa de hambre no ofrece ninguna posibilidad para la sincronización. El uso de mutantes daf-c permite la sincronización y la generación fiable de dauers. Sin embargo, no hay garantía de que una mutación particular daf-c no afectará a otros fenotipos-dauer específica solo o en combinación con mutaciones adicionales.

La presencia de una feromona dauer se implicó por primera vez por Cassada y Russell y más tarde demostró por Golden y Riddle. La feromona dauer desde entonces se ha caracterizado químicamente ^{2, 8, 9, 10.} La feromona purificada consiste en una mezcla compleja de ascarosides, que en diferentes formas a regular los procesos conductuales y de desarrollo ^{9, 11.} Uso de un extracto de feromona dauer crudo permite inducción fiable controlada de dauers sincronizados en un fondo de tipo salvaje.

El sistema nervioso y las células gliales asociadas se someten a la remodelación durante dauer larva formación ^{12, 13, 14.} Algunos de estos cambios son irreversibles, tales como la remodelación de las células de la glia durante dauer ^{13, 14.} Sin embargo otros eventos de remodelación son reversibles en un retorno a la favorable condiciones ambientales. Por ejemplo, un conjunto de cuatro neuronas IL2Q se someten a la remodelación neuronal rápida y reversible durante la formación de dauer incluyendo: arborización dendrítica, un interruptor de una sola dendríticas a las neuronas y los axones multidendritic remodelación ^12. Los métodos de la presente memoria permiten la formación de imágenes in vivo fiable de la neuroplasticidad inducida por estrés en un organismo modelo. Los métodos presentados para la producción y las pruebas de feromona dauer crudo se describen anteriormente y compilados a partir de varias fuentes de ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocolo

1. crudo Dauer Pheromone Producción

1. Crecer OP50 E. coli a partir de una sola colonia O / N a 37 ° C mientras se agita en 100 ml de caldo LB a 200 rpm. NOTA: Este cultivo O / N se puede hacer con antelación y se almacena a 4 ° C.
2. Crecer N2 C. elegans en junio 15 a 20 cm placas de Petri con agar NGM (ver receta en la Tabla 1) se sembró con 50 l de E. OP50 coli hasta que las bacterias se ha consumido casi por ^19.
3. Hacer 5x 250 ml de S medios (Ver receta en la Tabla 1) en 1 L matraces Erlenmeyer de ^19. NOTA: Esta solución se puede hacer con antelación.
4. Cultivar una cultura de OP50 E. coli en 4 L de caldo LB O / N mediante la inoculación con 1 ml de OP50 en E. coli y agitación a 37 ° C durante 16 horas.
5. Lavar los nematodos de las placas (paso 1,2) con 1 ml de solución de S basal (ver receta en la Tabla 1) y nematodos de transferencia 4-5 placas en cada uno de 4 1 matraces Erlenmeyer de L con los medios de comunicación S preparado en la etapa 1.3 (4 5 placaspara cada matraz) ^19.
6. Centrifugar la OP50 desde el paso 1.4 a 650 xg durante 10 min y retirar el sobrenadante. Resuspender cada sedimento bacteriano en 10 ml de solución de S basal. Transfiera la misma cantidad de bacterias resuspendidas a cada frasco de nematodos.
7. Colocar los matraces en un agitador orbital a temperatura ambiente (20 - 25 ° C) y 100 - 150 rpm durante 4 - 5 días hasta que la solución comienza a limpiar, lo que indica un agotamiento de los alimentos.
8. Una vez que el alimento se agota, crecer otro cultivo O / N de OP50 E. coli en 4x 1 L de caldo LB. Centrifugar las bacterias a 650 xg durante 10 min y añadir una pastilla de un frasco a cada uno de los matraces S de medios con nematodos. Devolver los frascos S de medios a la agitación, como en el paso 1.7, de 3-4 días hasta que la comida se agota de nuevo.
9. Tome un ~ 1 ml alícuota de solución de cada matraz y estimar la concentración de nematodos por sub-muestreo de 1 l de cada alícuota de 1 ml y contando el número de nematodos. NOTA: Lapoblación de nematodos debe ser 50 000 - 75 000 nematodos / ml. A esta concentración la mayoría de los nematodos son dauers.
10. Deseche todos los frascos contaminados. NOTA: La contaminación se manifiesta con frecuencia como hifas fúngicas visto durante el paso 1.9.
11. Nematodos centrifugar a 4000 xg durante 10 min a 4 ° C. Deseche el sedimento nematodo y retener el sobrenadante. Como alternativa, vea la discusión para el uso de estos animales para hacer una feromona de baja potencia.
12. Filtrar el sobrenadante a través de # 1 papel filtro Whatman. NOTA: Un frasco de vacío acelerará este proceso.
13. Filtrar aún más el sobrenadante a través de 0,45 micras unidades de filtración de vacío estéril. NOTA: El filtrado se puede mantener O / N a 4 ° C o proceder a 1,14.
14. Añadir el filtrado a un vaso de precipitados de 2 l con una barra de agitación. Coloque en una campana extractora en una placa calefactora revuelo. Llevar a ebullición mientras se agita y se evapora hasta aproximadamente 200 ml. Transfiera la solución a un vaso de 500 ml. Continuar la ebullición hasta aproximadamente 50 ml son left. NOTA: Se debe tener cuidado durante este paso, ya que es posible que la solución a hervir. El color de la final de 50 ml es un marrón oscuro. En cualquier momento durante el proceso de cocción, el calor puede ser apagado y el filtrado almacena O / N a temperatura ambiente o 4 ° C.
15. Dejar enfriar y centrifugar durante 5 min a 1000 x g. Verter el sobrenadante a un vaso de 100 ml y desechar el sedimento.
16. Hervir el sobrenadante a una corteza de color marrón. Retire del fuego y romper la corteza con una espátula. Añadir suficiente etanol prueba 200 para cubrir la corteza. Cubrir el vaso con Parafilm y dejar que repose O / N a temperatura ambiente. Verter el etanol en un vaso de precipitados limpio y poner a un lado. Añadir etanol fresco para cubrir la corteza. Repita extracciones O / N 3 veces. Reunir las fracciones.
17. Utilice una bomba de vacío para secar los extractos de etanol. Si una bomba de vacío no está disponible, añadir el extracto de etanol a un vaso de precipitados limpio y cálido a 50 ° C mientras se agita en una campana de humos. NOTA: Una vez que el etanol se ha evaporado un residuo pegajoso de lde color marrón de vuelo debe permanecer. Si se utiliza calentamiento, se debe tener cuidado para no quemar la solución por calentamiento durante demasiado tiempo.
18. Disolver residuo en 10 ml de agua destilada estéril. Filtro esterilizar esta solución con un filtro de jeringa de 0,22 micras y se almacenan a -20 ° C en alícuotas de 1 ml. NOTA: 1 ml de agua se utiliza para disolver el residuo por cada 100 ml del cultivo de nematodos líquido original. Por ejemplo, si uno de los matraces de cultivo líquido se descarta debido a la contaminación, a continuación, ajustar la cantidad de agua utilizada para disolver el residuo.

2. Determinación de Pheromone Respuesta a la dosis

1. Prepare feromona Dauer haciendo 6x 5 ml de medio NGM con agar Noble, sin peptona, y se suplementó con 50 mg / ml de sulfato de estreptomicina y una gama de feromona Dauer (véase la receta en la Tabla 1) ^{4, 19.} Mezclar componentes en un 13x100 mm tubo de cultivo de vidrio, hervir sobre un mechero Bunsen, y luego verter en placas de Petri de 3 cm.
2. Pesar amtubo icrocentrifuge. Añadir 1 ml de cultivo O / N del E. coli OP50 al tubo y centrifugar a ~ 17.000 xg en un tubo de microcentrífuga. Retire todo el sobrenadante. Pesar el tubo de nuevo y determinar el peso de la pella bacteriana. Resuspender el sedimento con tampón M9 (ver receta en la Tabla 1) para una concentración final de 4% ^(w / _v). Alícuota de 10 l de la suspensión bacteriana en el centro de cada placa de feromona ^4. Placas Tienda O / N a temperatura ambiente.
3. Escoja 10-15 grávidas N2 hermafroditas de tipo salvaje un día después de la muda hasta la edad adulta en las placas de feromonas ^4. Almacenar las placas a 25 ° C durante 3 - 4 horas.
4. Escoger de todos los adultos hermafroditas. Anote el número de huevos puestos por cada placa. Sellar las placas con Parafilm y volver a 25 ° C durante 3 días ^17.
5. Cuente el porcentaje de dauers (Figura 2). Nota: Para ambos métodos es importante tener en cuenta que dauers (y en menor extienda de campaña no dauers) trepará por las paredes y en la tapa de platos de Petri. Por tanto, es importante examinar todas las superficies del plato para los nematodos.
6. Ajustar los datos a una curva dosis-respuesta y calcular la concentración EC ₉₀ de feromona (feromona suficiente para inducir 90% de los animales para formar dauers) como se muestra en la Figura 3 Nota:. Normalmente utilizamos un modelo de regresión logística para estimar la CE ₉₀ , pero diferentes paquetes de software estadísticos pueden tener métodos alternativos que producen estimaciones similares.

3. imágenes en vivo de Dauer IL2 Neuronas

1. Preparar platos de feromonas dauer como en el protocolo 2 utilizando el valor EC ₉₀ determinada en el paso 2.6.
2. Inducir dauers utilizando los métodos en el protocolo 2 con una cepa con un reportero transgén integrado IL2 (myIs13 [P _klp-6 :: GFP], myIs14 [P _klp-6 :: GFP], myIs16 [P _klp-6 :: tdTomato] o qIs56 [P _desfase-2 :: GFP]) ^{12, 20, 21.} NOTA: Si se utiliza q Is56, expresión de GFP no será visible en los IL2Qs hasta varias horas en el muda Dauer y algunos de los eventos iniciales de remodelación no serán visibles. Además, mientras que la señal fluorescente del P _lag-2 :: GFP transgén es en última instancia, más brillante en los IL2s durante dauer que los _KLP-6 reporteros fluorescentes P, el P _lag-2 :: GFP transgén también expresa débilmente en los músculos de la cabeza que puede enmascarar las ramas finas IL2.
3. Después de la puesta de huevos, retire los adultos hermafroditas, sellar las placas con Parafilm y se incuba durante 34 horas a 25 ° C ^17. NOTA: La longitud de tiempo para la muda Dauer varía ligeramente entre los individuos. El período más rápido de la arborización dendrítica comienza 4-5 horas después del inicio de la muda dauer (39-44h después de la puesta de huevos a 25 ° C) ^12.
4. El día antes de formación de imágenes, conforman una solución de 10% ^(w / _v) de agarosa en tampón M9 con feromona Dauer a la concentración CE _90. Alícuota de aproximadamente 100 l de agarosa en un portaobjetos de microscopio y de forma rápida, pero suavemente, coloque otra diapositiva en la parte superior para crear una superficie plana de agarosa. Después de la agarosa se ha solidificado, envuelva las diapositivas en papel film y guardar en una cámara de humedad (caja de puntas de pipeta con toallas de papel húmedas).
5. Tras el período de incubación 34 horas, examinar las placas de feromonas para nematodos que han dejado de bombeo de la faringe. Diapositivas separadas de tal manera que sólo una superficie de una diapositiva tiene agarosa en él. Elija uno o más nematodos en una almohadilla de agarosa al 10% y 1 μ l de 0,1 micras perlas de poliestireno ^22. NOTA: Con una población bien sincronizado, la mayoría de los nematodos en el plato va a ingresar en la muda de L2d a dauer. Sin embargo, puede haber variación entre ias personas. Por tanto, es importante tener en cuenta características adicionales (oclusión de estoma, la remodelación de la faringe) para estimar la cantidad de tiempo que los animales hayan estado dentro de la muda Dauer (ver resultados representativos, por ejemplo).
6. Determine la orientación (izquierda / derecha, dorsal / ventral) del nematodo. Captura imágenes Z-stack de un dendrita IL2Q a 100 aumentos con la intensidad de la fluorescencia bajo posible cada 15 minutos o cuando sea necesario para el experimento específico. Continuar la captura de imágenes hasta que el nematodo se ha separado de la cutícula L2d y la inmovilización es imposible o si el animal se recupera de Dauer (faringe comienza a bombear). Cuando no la formación de imágenes de forma activa, coloque el portaobjetos en una cámara húmeda. NOTA: Nosotros usamos un microscopio de epifluorescencia con un contraste de interferencia diferencial escenario y motorizado (DIC) óptica.

Resultados

La producción de resultados de feromonas dauer crudo en un líquido amarillo (Figura 1) que es tanto el calor como el frío estable. Alícuotas de feromona crudo se almacenan a -20 ° C indefinidamente sin pérdida evidente de la actividad. Después de la producción de feromona, un único bioensayo dosis-respuesta es suficiente para una estimación aproximada de la potencia. Sin embargo, para la mayoría de los experimentos es necesario repetir el bioensayo 2 - 3 veces y tomar un promedio de cada experimento. Lo...

Discusión

Un examen de la neuroplasticidad-dauer específicos y otros cambios morfológicos dauer asociada requiere controlado y formación fiable de dauers ya sea a través de la mutación genética (es decir, mutantes, daf-c) o por la exposición de los animales de tipo salvaje de la feromona. Mientras que el uso de una mutación genética para inducir dauers es conveniente, puede confundir los resultados. Por lo tanto, los datos recogidos con mutaciones daf-c deben confirmarse posteriormente con animales de tipo salva...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
N2 C. elegans Bristol cepa	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	A petición del laboratorio
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	A petición del laboratorio
JK2868 qIs56[Plag-2:: gfp] V			Genética de Caenorhabditis
OP50 E. coli			Genética de Caenorhabditis
Placas de Petri	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Varios		3 g de NaCl, 17 g de agar, 2,5 g de peptona en 975 ml H2O esterilizado en autoclave enfriado a 55° C seguido de 1 ml de 5 mg/ml de colesterol en etanol, 25 ml de tampón 1 M KPO4 (pH 6,0), 1 ml de 1 M de CaCl2, 1 ml de 1 M de MgSO4
S	Varios		medios S consisten en una solución basal de S (1,46 g de NaCl, 0,25 g de K2HPO4, 1,5 g de KH2PO4, 0,25 ml de colesterol de 5 mg/ml en etanol y H2O a 250 ml. Autoclave). A la solución basal S añadir 2,5 ml de citrato de potasio pH 6,0 (2 g de ácido cítrico monohidratado, 29,4 g de citrato tripotásico monohidratado, H2O a 100 ml, esterilizado en autoclave), 2,5 ml de solución de metales traza (1,86 g de EDTA disódico, 0,69 g de FeSO4  y toro; 7 H2O, 0,2 g MnCl2&toro; 4 H2O, 0,29 g ZnSO4  y toro; 7 H2O, 0,025 g CuSO4  y toro; 5 H2O, H2O a 1 L. Esterilizado en autoclave y almacenado en la oscuridad), 0,75 ml de 1 M de CaCl2 y 0,75 ml de 1 M de MgSO4.
Placas de feromonas Dauer para el ensayo dosis-respuesta	Various		Mix 0,085 g Agar noble, 0,5 ml de NaCl 0,513 M y 5 µ l de 5 mg/ml de colesterol disuelto en etanol en cada uno de los 6 tubos de cultivo de 15 ml. Agregue suficiente feromona cruda a cada tubo para crear un rango de concentraciones. Añadir H2O para llevar el volumen a 4.725 ml. Hervir sobre un mechero Bunsen hasta que el agar se disuelva y luego enfriar a 55 °C. Agregar 125 µ l 1 M de tampón KPO4 (pH 6,0), 50 &; l 0,1 M CaCl2, 50 y micro; l 0,1 M MgSO4 y 50 µ 5 mg/ml de sulfato de estreptomicina en cada tubo. Vierta el contenido de cada tubo en una placa de Petri de 35 mm de diámetro. Deje que el agar se solidifique a temperatura ambiente durante la noche (si es más largo, guárdelo en un recipiente cerrado para evitar un secado excesivo).
Perlas de microesferas de 0,1 micras	Polysciences Inc.	00876-15
Tampón M9	Varios		Mezcla 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O a 1 litro. Esterilización en autoclave

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