En vivo de imágenes de Dauer-específica neuronal Remodelación en C. elegans

Resumen

Después de la exposición a factores estresantes ambientales específicos, el nematodo Caenorhabditis elegans experimenta una amplia plasticidad fenotípica para entrar en una etapa juvenil 'dauer' resistente al estrés. Presentamos métodos para la inducción controlada y la obtención de imágenes de la neuroplasticidad durante el dauer.

Resumen

Los mecanismos que controlan el estrés inducido por la plasticidad fenotípica en animales son frecuentemente complejos y difíciles de estudiar in vivo. Un ejemplo clásico de la plasticidad inducida por el estrés es la etapa dauer de C. elegans. Dauers son una etapa larval de desarrollo alternativo formado bajo condiciones de bajas concentraciones de los alimentos bacteriana y altas concentraciones de una feromona Dauer. Dauers muestran amplia plasticidad del desarrollo y del comportamiento. Por ejemplo, un conjunto de cuatro cuadrantes interior-labial (IL2Q), las neuronas se someten a una amplia remodelación reversible durante la formación de Dauer. Utilizando la entrada vías ambientales de regulación Dauer bien conocido, un método previamente establecido para la producción de feromona Dauer crudo a partir de cultivos de nematodos líquido a gran escala se demuestra. Con este método, una concentración de 50.000 - 75.000 nemátodos / ml de cultivo líquido es suficiente para producir una muy potente feromona Dauer crudo. La potencia feromona crudo es determined mediante un bioensayo de respuesta a la dosis. Por último, se describen los métodos utilizados para in vivo time-lapse de los IL2Qs durante la formación de dauer.

Introducción

Plasticidad fenotípica, incluyendo la plasticidad del desarrollo y del comportamiento, es importante para las adaptaciones a las condiciones ambientales adversas y se considera una fuerza impulsora en la evolución ^1. C. elegans es un organismo modelo utilizado con frecuencia para estudios en el desarrollo y la neurobiología. En condiciones ideales, C. elegans se desarrolla a través de cuatro estadios larvarios antes de entrar en la etapa reproductiva de adultos. Sin embargo, en condiciones de baja disponibilidad de alimentos y las altas densidades de población, C. elegans puede someterse a un interruptor de desarrollo y entrar en....

Protocolo

1. crudo Dauer Pheromone Producción

1. Crecer OP50 E. coli a partir de una sola colonia O / N a 37 ° C mientras se agita en 100 ml de caldo LB a 200 rpm. NOTA: Este cultivo O / N se puede hacer con antelación y se almacena a 4 ° C.
2. Crecer N2 C. elegans en junio 15 a 20 cm placas de Petri con agar NGM (ver receta en la Tabla 1) se sembró con 50 l de E. OP50 coli hasta que las bacterias se ha consumido casi por ^19.
3. Hacer 5x 250 ml de S medios (Ver receta en la Tabla 1) en 1 L matraces Erlenmeyer de ^19. NOTA: Esta solución se puede hacer con antelación.
4. Cultivar una cultura d....

Resultados

La producción de resultados de feromonas dauer crudo en un líquido amarillo (Figura 1) que es tanto el calor como el frío estable. Alícuotas de feromona crudo se almacenan a -20 ° C indefinidamente sin pérdida evidente de la actividad. Después de la producción de feromona, un único bioensayo dosis-respuesta es suficiente para una estimación aproximada de la potencia. Sin embargo, para la mayoría de los experimentos es necesario repetir el bioensayo 2 - 3 veces y tomar un promedio de cada experimento. Lo.......

Discusión

Un examen de la neuroplasticidad-dauer específicos y otros cambios morfológicos dauer asociada requiere controlado y formación fiable de dauers ya sea a través de la mutación genética (es decir, mutantes, daf-c) o por la exposición de los animales de tipo salvaje de la feromona. Mientras que el uso de una mutación genética para inducir dauers es conveniente, puede confundir los resultados. Por lo tanto, los datos recogidos con mutaciones daf-c deben confirmarse posteriormente con animales de tipo salva.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
N2 C. elegans Bristol cepa	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	A petición del laboratorio
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	A petición del laboratorio
JK2868 qIs56[Plag-2:: gfp] V			Genética de Caenorhabditis
OP50 E. coli			Genética de Caenorhabditis
Placas de Petri	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Varios		3 g de NaCl, 17 g de agar, 2,5 g de peptona en 975 ml H2O esterilizado en autoclave enfriado a 55° C seguido de 1 ml de 5 mg/ml de colesterol en etanol, 25 ml de tampón 1 M KPO4 (pH 6,0), 1 ml de 1 M de CaCl2, 1 ml de 1 M de MgSO4
S	Varios		medios S consisten en una solución basal de S (1,46 g de NaCl, 0,25 g de K2HPO4, 1,5 g de KH2PO4, 0,25 ml de colesterol de 5 mg/ml en etanol y H2O a 250 ml. Autoclave). A la solución basal S añadir 2,5 ml de citrato de potasio pH 6,0 (2 g de ácido cítrico monohidratado, 29,4 g de citrato tripotásico monohidratado, H2O a 100 ml, esterilizado en autoclave), 2,5 ml de solución de metales traza (1,86 g de EDTA disódico, 0,69 g de FeSO4  y toro; 7 H2O, 0,2 g MnCl2&toro; 4 H2O, 0,29 g ZnSO4  y toro; 7 H2O, 0,025 g CuSO4  y toro; 5 H2O, H2O a 1 L. Esterilizado en autoclave y almacenado en la oscuridad), 0,75 ml de 1 M de CaCl2 y 0,75 ml de 1 M de MgSO4.
Placas de feromonas Dauer para el ensayo dosis-respuesta	Various		Mix 0,085 g Agar noble, 0,5 ml de NaCl 0,513 M y 5 µ l de 5 mg/ml de colesterol disuelto en etanol en cada uno de los 6 tubos de cultivo de 15 ml. Agregue suficiente feromona cruda a cada tubo para crear un rango de concentraciones. Añadir H2O para llevar el volumen a 4.725 ml. Hervir sobre un mechero Bunsen hasta que el agar se disuelva y luego enfriar a 55 °C. Agregar 125 µ l 1 M de tampón KPO4 (pH 6,0), 50 &; l 0,1 M CaCl2, 50 y micro; l 0,1 M MgSO4 y 50 µ 5 mg/ml de sulfato de estreptomicina en cada tubo. Vierta el contenido de cada tubo en una placa de Petri de 35 mm de diámetro. Deje que el agar se solidifique a temperatura ambiente durante la noche (si es más largo, guárdelo en un recipiente cerrado para evitar un secado excesivo).
Perlas de microesferas de 0,1 micras	Polysciences Inc.	00876-15
Tampón M9	Varios		Mezcla 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O a 1 litro. Esterilización en autoclave

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