Obtener imágenes de microscopía electrónica de transmisión de alta calidad es un desafío, especialmente en el caso de las células vegetales, que tienen abundantes vacuolas grandes llenas de agua y espacios aireados. La congelación a alta presión en tándem y la sustitución rápida por congelación reducen en gran medida el tiempo de preparación de las muestras de plantas para TEM, al tiempo que producen muestras con una excelente conservación ultraestructural.
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Artículo de método
Tandem congelación de alta presión y la rápida congelación de sustitución de tejidos vegetales para Microscopía Electrónica de Transmisión
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Resumen
Resumen
Dado que el microscopio electrónico de transmisión de 1940 (TEM) ha estado proporcionando los biólogos con imágenes ultra-alta resolución de los materiales biológicos. Sin embargo, debido a los protocolos laboriosos y lentos que también exigen experiencia en la preparación de las muestras libres de artefactos, TEM no se considera una técnica fácil de usar. Preparación de la muestra tradicional para TEM utiliza fijadores químicos para preservar las estructuras celulares. Congelación de alta presión es la criofijación de muestras biológicas bajo altas presiones para producir velocidades de enfriamiento muy rápidas, restringiendo así la formación de hielo, que es perjudicial para la integridad de la ultraestructura celular. Congelación de alta presión y la sustitución de congelación son actualmente los métodos de elección para la producción de la morfología de la más alta calidad en las secciones de resina para TEM. Estos métodos reducen al mínimo los artefactos normalmente asociados con el procesamiento convencional para TEM de secciones delgadas. Después de criofijación el agua congelada en la muestra se sustituye con el líquidodisolvente orgánico a bajas temperaturas, un proceso llamado sustitución de congelación. Sustitución Freeze se lleva a cabo normalmente durante varios días en dedicado, equipos costosos. Una reciente innovación permite que el proceso se completará en tres horas, en lugar de los habituales dos días. Esto es seguido por varios días más de preparación de la muestra que incluye la infiltración y la incrustación en resinas epoxi antes de seccionar. Aquí se presenta un protocolo que combina la congelación de alta presión y la sustitución de congelación rápida que permite la fijación de la muestra planta para llevar a cabo en cuestión de horas. El protocolo puede adaptarse fácilmente para trabajar con otros tejidos u organismos. Los tejidos vegetales son de especial preocupación debido a la presencia de espacios aireados y vacuolas llenas de agua que impiden la congelación sin hielo de agua. Además, el proceso de fijación química es especialmente larga en las plantas debido a las paredes celulares que impiden la penetración de los productos químicos a lo profundo dentro de los tejidos. Los tejidos de plantas son, por lo tanto particcialmente difícil, pero este protocolo es confiable y produce muestras de la más alta calidad.
Introducción
Nuestro conocimiento de la ultraestructura de células proviene principalmente de microscopía electrónica, que puede resolver detalles en el intervalo de unos pocos nanómetros 1. A pesar de ser tan poderoso en la resolución TEM no se considera fácil de usar, como preparación de la muestra requiere mucho tiempo y protocolos laboriosas, y exige cierta experiencia del practicante. Fijación tradicional de las muestras ha combinado el uso de aldehídos y tetróxido de osmio antes del procesamiento adicional que incluye la deshidratación, incrustación de resina y luego en seccionar para producir secciones ultra-delgada que se tiñen con metales pesados. Sin embargo,....
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Protocolo
NOTA: El procedimiento QFS requiere extremo cuidado y precaución por el usuario y le prestamos atencion a estas precauciones de seguridad aquí como precauciones y notas en su caso.
1.Preparación para HPF Run
- Antes de comenzar la preparación de muestras, encienda el congelador de alta presión siguiendo las instrucciones del fabricante.
NOTA: La unidad HPF utilizada en este protocolo es una unidad compacta Wohlwend 02 (Figura 1), y se tarda aproximadamente una a una hora y media de procedimiento de puesta en marcha antes de HPF se ejecuta puede comenzar.- Encender el Wohlwend compacto de alta presi....
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Resultados
Los resultados presentados a continuación han sido obtenidos utilizando un Wohlwend compacto 02 para HPF (Figura 1A). Una gran ventaja de este instrumento es la facilidad de uso de los portadores de muestra y sus titulares. Si se utilizan otros instrumentos, McDonald recomienda que dos usuarios deben llevar a cabo la preparación de la muestra y HPF, una preparación de las muestras, mientras que el otro hace la congelación y traslado al FS crioviales 9. Sin embargo, la Wohlwend espécimen trans.......
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Discusión
El éxito del protocolo que se presenta aquí depende en gran medida del usuario. En primer lugar, se requiere una preparación avanzada para asegurar que todos los materiales necesarios son fácilmente disponibles y en cantidad suficiente para completar toda una carrera HPF-QFS. En segundo lugar, el usuario debe trabajar con rapidez, moviéndose desde el paso-a-paso de una manera eficiente que minimiza la manipulación de la muestra, minimizando de este modo los cambios en el estado nativo del tejido. Una vez que las muestra.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
La bondad y la generosidad del Dr. Kent McDonald de la Universidad de Berkeley son muy apreciadas. Damos las gracias a un revisor anónimo de sugerencias muy útiles. El laboratorio de Burch-Smith es apoyado por fondos de puesta en marcha de la Universidad de Tennessee.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Máquina de congelación de alta presión Wohlwend HPF Compact 02 Technotrade | International, Inc | HPF02 | Con osciloscopio integrado para mostrar las curvas de congelación y presión; Se requiere PC (no incluido) para la pantalla de los parámetros de congelación |
| Soporte para soportes de probetas de aluminio DN 3 x 0,5 mm | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Portamuestras, P=1.000, DN 3 x 0,5 aluminio, tipo A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Portadores de probetas, P=1.000, DN 3 x 0,5 aluminio, tipo B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Almacenamiento Dewar 20,5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Gráfico | ||
| Levadura | Cuanto más viejo, mejor, para evitar la producción excesiva de gas (CO2) | ||
| Palillos de | |||
| Registrador de datos de termopar EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | La batería de repuesto se compra por separado |
| Sonda de temperatura | Electrónica Microscopy Sciences | 34505 | |
| Bloque calefactor 12/13 mm | |||
| Agitador rotativo | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Punzón de hojas - Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Cera dental rosa | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 72660 | |
| Viales criogénicos 2 ml | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 61802-02 | |
| Metanol | |||
| Secador | |||
| Hielo | |||
| Nitrógeno | |||
| Acetona | |||
| Pinzas | Varios pares |
Referencias
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).
- Studer, D., Hennecke, H., Muller, M.
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Reimpresiones y permisos
