Artículo de método

Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

DOI:

10.3791/51845

⸱

9 de octubre de 2014

 ,  , 
1Division of Hematology/Oncology, Department of Medicine, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University Feinberg School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Se ha demostrado que la regulación alternativa del empalme contribuye a la transición epitelio-mesenquimal (EMT), un programa celular esencial en diversos procesos fisiológicos y patológicos. Aquí describimos un método que utiliza un modelo de EMT inducible para la detección de empalme alternativo durante EMT.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El empalme alternativo desempeña un papel crítico en la transición epitelio-mesenquimal (EMT), un programa celular esencial que ocurre en varios procesos fisiológicos y patológicos. En este trabajo describimos una estrategia para detectar el splicing alternativo durante la EMT utilizando un modelo de EMT inducible mediante la expresión del represor de transcripción Twist. La EMT se controla mediante cambios en la morfología celular, la pérdida de la localización de la E-cadherina en las uniones célula-célula y la expresión conmutada de los marcadores de EMT, como la pérdida de los marcadores epiteliales E-cadherina y γ-catenina y la ganancia de los marcadores mesenquimales N-cadherina y vimentina. Utilizando conjuntos de cebadores específicos de isoformas, el empalme alternativo de los ARNm interesados se analiza mediante RT-PCR cuantitativa. La producción de las isoformas proteicas correspondientes se valida mediante ensayos de inmunotransferencia. El método de detección de isoformas de empalme descrito aquí también es adecuado para el estudio de empalme alternativo en otros procesos biológicos.

Introducción

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La transición epitelial-mesenquimal (EMT) es un programa de desarrollo que impulsa la morfogénesis de órganos y la remodelación de tejidos durante la embriogénesis. Cuando se activa de forma anormal, EMT promueve la metástasis tumoral y la fibrosis de órganos 1,2. Estudios convincentes han descrito la importancia de la regulación transcripcional durante el proceso de la EMT, que se define por varios factores de transcripción, como Twist, Caracol, y ZEB, que reprimen la expresión de la proteína de unión adherens E-cadherina, lo que resulta en la pérdida de un cobble- piedra, como la morfología del epitelio y la ganancia de un fenotipo mesenquimal fusiforme 3-8. Estudios recientes a través del análisis de todo el genoma de ARN revelaron que existe un grupo de genes cuyos patrones de empalme están asociados ya sea con fenotipos epiteliales o mesenquimales 9,10. El trabajo de nuestro laboratorio funcionalmente conectado splicing alternativo y EMT. Mediante el estudio de la superficie celular molécula de adhesión CD44, hemos demostrado que CD44 alternativa empalme está estrechamente regulada durante EMT, y lo más importante, que la isoforma de empalme CD44 conmutación causalmente contribuye a EMT 11.

Splicing alternativo representa un modelo generalizado y conservado de la regulación de genes, ya que hasta el 95% de los genes de varios exones humanos están empalmados alternativamente 12-14. Mediante la generación de múltiples productos de proteína a partir de un único gen, corte y empalme alternativo constituye un mecanismo esencial para la diversidad de proteínas, la adición de otra capa de complejidad al genoma humano. Como tal, la desregulación de splicing alternativo podría dar lugar a profundos efectos biológicos que causan enfermedades humanas. De hecho, el splicing alternativo aberrante en enfermedades se ha documentado desde hace más de una década 15-25, incluyendo los recientes hallazgos de que las mutaciones en los genes que codifican la maquinaria spliceosome se encuentran comúnmente en los síndromes mielodisplásicos 26-28. Por lo tanto, el desarrollo de métodos fiables para la detección de i empalmados alternativamentesoforms es de gran importancia en el estudio de diversos procesos biológicos incluyendo la EMT.

Aquí proporcionamos un protocolo para detectar cambios en el splicing alternativo utilizando un modelo EMT inducible. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y la detección de isoformas de empalme son adecuados no sólo para el estudio de corte y empalme alternativo durante la EMT, sino también para el estudio de splicing alternativo en otros procesos biológicos. La investigación de corte y empalme alternativo durante EMT es imperativo con el fin de comprender mejor los mecanismos de la EMT y la metástasis del tumor, facilitando así el desarrollo de estrategias eficaces para tratar la metástasis del cáncer.

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Protocolo

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1. cultivo celular de EMT Inducción

Nota: EMT puede ser inducida por tratamiento de TGF o la expresión ectópica de factores de transcripción Twist, Snail, o ZEB1 / 2 en las células epiteliales. Se describe en este protocolo es un sistema inducible EMT través de la expresión de la proteína de fusión Twist-ER en las células mamarias humanas inmortalizadas epiteliales (HMLE / Twist-ER, un regalo del Dr. J Yang, UCSD) 9,11,29. Tras 4-hidroxitamoxifeno tratamiento (TAM), la proteína de fusión Twist-ER se transloca al núcleo para conducir la transcripción y los resultados en una transición EMT completa en 12-14 días 9,11,29. Sistemas inducibles EMT adicionales, como HMLE / Caracol-ER, HMLE / TGF, y MCF10A / TGF, se pueden encontrar en nuestras publicaciones anteriores 11,30.

  1. Mantener células HMLE / desenroscables ER en mamaria medio de crecimiento de células epiteliales sin suero (MEGM) en una incubadora a 37 ° con 5% de CO 2. Pasaje de las células cada 2-3 días cuando llegan a 80% de confluencia. Se incuban las células con 0,15% de tripsina a 37 ° C durante 5-10 min, y después inactivar la tripsina con suero de ternera 5% / DMEM. Centrifugar las células y resuspender en MEGM. Células de la placa en una nueva placa de cultivo tisular en una proporción de 1 a 4.
  2. Disolver TAM en etanol para preparar una solución 200 mM. Proteja TAM de la luz y almacenar a -20 ° C. Antes de su uso, recién añadir TAM en medios MEGM a una dilución de 1: 10.000 para hacer una concentración final de 20 nM TAM.
  3. Para la inducción de la EMT, placa células 1,6 x 10 6 HMLE / desenroscables ER en una placa de 10 cm de cultivo de tejidos por duplicado. Células de cultivo con medios 20 nM TAM-que contiene MEGM.
  4. Placa células 1,6 x 10 6 HMLE / desenroscables ER en una placa de 10 cm por duplicado y el tratamiento de las células con etanol 0,01% como control no tratada con TAM.
  5. Dos días después de la incubación, tomar fotografías bajo un microscopio de luz a un aumento de 10X para registrar los cambios morfológicos de las células.
  6. Aspirar el medio de un plato de control o tratados con TAMcélulas. Lavar las células con PBS frío, y las células de la cosecha mediante el desguace de un medio de la placa en tampón de lisis de ARN para el aislamiento de ARN y la otra mitad en tampón RIPA para el análisis de proteínas.
  7. Células pasaje del control o platos tratados con TAM en 1,6 x 10 6 células re-enchapado en una placa de 10 cm por duplicado. Continuamente tratar las células con 20 nM de TAM o vehículo.
  8. Repita los pasos 5 a 7 una vez cada dos días hasta el día 14, momento en el cual, las células Twist-ER tratados con TAM muestran una morfología mesenquimal fusiforme, mientras que las células de control tratados con vehículo mantienen la morfología epitelial-adoquines similares.

2. Caracterización de EMT

Nota: A la finalización de la EMT se indica mediante: (1) celulares cambios morfológicos de una morfología epitelial-adoquines como éste adopte un aspecto fibroblástico en forma de huso; (2) Pérdida de localización E-cadherina en las uniones célula-célula; y (3) La expresión de los marcadores de EMT de conmutación, que se define por la pérdidade marcadores epiteliales y ganancia de marcadores mesenquimales.

Cambios morfológicos celulares son capturados por microscopio de luz a un aumento de 10X durante el curso del tiempo de la inducción de EMT, descrito en la Sección 1.-Immuno fluorescencia detección de E-cadherina en células uniones se describe en esta sección. La expresión de marcadores de EMT se detecta por inmunotransferencia. Marcadores epiteliales comunes son la E-cadherina, γ-catenina, y ocludina y marcadores mesenquimales incluyen fibronectina, N-cadherina y vimentina. Procedimientos generales de inmunotransferencia se describen en la Sección 4.

  1. En el día 12 del tratamiento TAM, semilla de 1 x 10 5 células en un 12 mm de vidrio cubreobjetos circular colocado en un pocillo de una placa de 24 pocillos.
  2. 48 horas después de la siembra de células, medio aspirado y lavado con PBS precalentado.
  3. Fijar las células con pre-calentado paraformaldehído al 4% durante 15 min.
  4. Lavar las células tres veces con PBS.
  5. Se incuban las células con 0,2% de Triton X-100 en PBS durante 15min a TA.
  6. Lavar las células tres veces con PBS.
  7. Se incuban las células en 5% de BSA / PBS durante 1 hora a TA para bloquear la unión no específica.
  8. Se incuban las células con el anticuerpo primario E-cadherina en una dilución 1:50 en 1% de BSA / PBS en una cámara humidificada O / N a 4 ° C. NOTA: El intervalo de dilución de anticuerpo primario es normalmente entre 1:50 y 1: 200, y la dilución óptima para cada anticuerpo debe ser determinado experimentalmente.
  9. Decantar el anticuerpo primario y lavar las células tres veces con PBS.
  10. Se incuban las células con anticuerpo secundario marcado con fluorescencia en una dilución 1: 500 durante 1 hora a RT. Desde este paso en, proteger las células de la luz.
  11. Decantar el anticuerpo secundario y lavar tres veces con PBS.
  12. Las células se tiñen con 0,1-1 g / ml DAPI o Hoechst durante 10 min.
  13. Enjuagar las células con PBS tres veces.
  14. Monte cubreobjetos con una gota de medio de montaje y cubreobjetos sello con esmalte de uñas.
  15. Observar las células y tomarimages bajo un microscopio de fluorescencia 63X.

La tinción con anticuerpos adicionales se puede realizar para confirmar el fenotipo EMT. Por ejemplo, N-cadherina y α-actina de músculo liso se pueden teñir para un 29,31,32 fenotipo mesenquimal. Reorganización de la estructura del citoesqueleto se puede controlar mediante tinción de las células con faloidina para F-actina 11. Además, los ensayos para la motilidad celular y la resistencia a la muerte celular se pueden realizar para examinar las propiedades de EMT 11.

3. Detección de Empalme isoformas utilizando ensayos de qRT-PCR

  1. Diseño Primer
    NOTA: Primer pares deben ser cuidadosamente diseñados para amplificar distintas isoformas de empalme. Omisión de exón, el evento splicing alternativo más comúnmente observado, se muestra aquí como un ejemplo para ilustrar la estrategia de diseño del cebador. Figura 1A representa una de cuatro exón pre-ARNm, con el tercer exón como un exón variable. La inclusión del exón 3 resultados enla producción de una isoforma de empalme más largo, mientras que la omisión del exón 3 genera una isoforma de empalme más corta. Los cebadores deben ser diseñados para distinguir la isoforma exón-3-y-incluido el exón 3-omitido isoforma, y ​​para detectar la transcripción de ARNm total de este.
    1. Para la detección de exón inclusión, diseñar cuidadosamente un cebador directo dentro de la variable de exón 3, y un cebador inverso en el interior del exón constitutiva cerca 4, lo que permite la amplificación específica de la isoforma exón-incluido variable. Asegúrese de no diseñar adelante y atrás primers dentro del mismo exón variable con el fin de evitar los productos de PCR amplificados a partir de ADN genómico o pre-mRNA.
    2. Para amplificar específicamente eventos omisión de exón, diseño uno de los cebadores que abarcan la unión del exón constitutiva 2 y el exón 4 que de otro modo se destruye cuando el exón variable de 3 se incluye. Diseñar el otro cebador dentro del exón constitutiva 4. Como tal, los productos PCR se generan sólo cuando el exón variable de 3 es en excluired y la constitutiva posteriormente se unen exón 2 y el exón 4 juntos.
    3. Para detectar los transcritos totales del gen, el diseño de los cebadores dentro de los dos exones constitutivos 1 y 2 Por lo tanto, los productos de PCR se amplificaron a partir de todas las isoformas.
    4. Asegúrese de que la temperatura de fusión (Tm) para todos los cebadores es de aproximadamente 55 ° C, la longitud de cada cebador es de aproximadamente 18-22 nucleótidos, y el tamaño de los productos de PCR es de entre 80 y 150 pares de bases.
  2. La extracción de RNA: Extracto de ARN utilizando un kit de aislamiento total de ARN (véase la Tabla de Materiales).
    1. Recoger las células en 350 l de tampón de lisis de ARN.
    2. Añadir 350 l de etanol al 70% al lisado y mezclar bien.
    3. Transferir la muestra a la columna de purificación de ARN.
    4. Centrifugar a 10.000 xg durante 1 min y descarte de flujo a través.
    5. Lavar la columna una vez con 500 l de tampón de lavado ARN I y dos veces con tampón de lavado II de ARN.
    6. Retirar el tampón de lavado residual de ARNII de la columna por centrifugación a velocidad máxima durante 2 min.
    7. Transferir la columna en un nuevo tubo de 1,5 ml, añadir 50 l de agua libre de nucleasa en el centro de la matriz de la columna y eluir el ARN por centrifugación a la velocidad máxima.
  3. Síntesis de la primera cadena de ADNc
    1. Determinar la concentración y la calidad del ARN mediante medición de la absorción UV. NOTA: Good ARN de calidad debe tener una relación de absorbancia / 280 nm 260 nm de aproximadamente 2,0.
    2. Configuración de la transcriptasa inversa (RT) reacciones que contienen 250 ng de ARN total 0,05 g cebadores hexámeros al azar, 50 pmol de MgCl 2, 10 pmol dNTP, 2 l 5 x tampón de goscript, y 1 l de la enzima RT en un volumen final de 20 l.
    3. Realizar RT reacciones a 42 º C durante 1 hora, seguido de incubación a 70 ° C durante 5 minutos para inactivar la enzima RT.
  4. PCR en tiempo real
    1. Establezca 20 l reacciones que consisten en 10 l SYBR verde Master Mix,0,1-1,0 l molde de ADNc, y 5 pmol cebadores directo e inverso.
    2. Ejecute PCR en tiempo real con 40 ciclos de los siguientes pasos: 95 ° C desnaturalización durante 10 segundos, 58 ° C recocido durante 10 segundos, y 60 ° C de extensión durante 30 segundos. Lleve a cabo reacciones de PCR por triplicado.
    3. Compruebe curvas de disociación y asegúrese de que un solo pico se observa para cada grupo de cebadores.
    4. Obtener los valores de ciclo de cuantificación (Cq) mediante el cálculo de los segundos valores derivados de curvas de amplificación.
    5. Calcular la cantidad relativa (RQ) de ARNm diana en las muestras inducidas en comparación con la muestra no inducida a través del "delta delta Cq (ΔΔCq) 'método como se muestra por la siguiente fórmula. Utilice los genes de limpieza, tales como GAPDH o PDD, como referencia.

figure-protocol-1
Para calcular con mayor precisión los valores relativos de las isoformas de empalme, tl uso de múltiples genes de referencia debe ser considerada. Los resultados pueden ser analizados usando un método de cuantificación valor absoluto modificado descrito por Pfaffl et al 33,34.

4. Examen de Empalme Isoformas a nivel de proteínas

  1. Recoger las células en 100 tampón RIPA helada l.
  2. Conjunto lisados ​​en hielo durante aproximadamente 10 min.
  3. Centrifugar a 14.000 xg durante 10 min a 4 ° C, y recoger el sobrenadante.
  4. Medir la concentración de proteína mediante ensayos de Bradford.
  5. Diluir las muestras de proteína en tampón de carga SDS y cargar 20-40 g de proteínas en 10% geles de SDS-PAGE.
  6. Ejecute geles SDS-PAGE a 20 mA durante 1,5 horas.
  7. Proteínas de transferencia a membranas de PVDF en un sistema de transferencia húmeda a 4 ° C durante 3 horas a 85 V. Ajuste el tiempo de transferencia de acuerdo con el peso molecular de las proteínas diana.
  8. Bloquear la membrana en la leche desnatada al 5% durante 30 min a 1 hora a TA.
  9. Incubar wi membranath un anticuerpo primario a 4 ° CO / N. El rango de dilución de anticuerpo primario es normalmente entre 1: 200 y 1: 5000, determinar la dilución óptima para cada anticuerpo experimentalmente. La dilución de los anticuerpos utilizados en este protocolo se puede encontrar en la "Tabla de reactivos y equipos específicos".
    1. Para detectar isoformas de empalme, utilizar anticuerpos específicos que reconocen una isoforma particular. Alternativamente, utilizar un anticuerpo que reconoce el epítopo en la región de codificación de exón constitutiva y detectar isoformas de empalme de forma simultánea sobre la base de sus diferentes tamaños de proteína.
    2. Al mismo tiempo, controlar EMT por inmunotransferencia para los marcadores de EMT. Utilice E-cadherina, γ-catenina, y ocludina como marcadores epiteliales, y la fibronectina, N-cadherina y vimentina como marcadores mesenquimales.
  10. De membrana de lavado tres veces con TBS-T (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) en un intervalo de 5 min.
  11. Incubar la membrana con una hormiga secundario conjugado con HRPibody en una dilución de 1: 10.000 durante 1 hora a RT.
  12. Membrana Lavar tres veces con TBS-T en un intervalo de 5 min.
  13. Visualizar proteína con un sistema de detección de quimioluminiscencia y exponer la membrana a una película de autorradiografía.

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Resultados

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Los procedimientos descritos anteriormente proporcionan un método robusto para detectar splicing alternativo durante la EMT. Los resultados representativos de empalme isoforma CD44 conmutación durante EMT inducida Twist-A continuación se dan como ejemplo.

EMT inducida Twist-en las células HMLE / Twist-ER se caracteriza por una transición de un adoquín como fenotipo epitelial a un fenotipo fibroblástico alargada (Figura 2A), la ausencia de marcadores epiteliales E-cadherina, ...

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Discusión

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El procedimiento descrito aquí permite la detección de corte y empalme alternativo en un modelo inducible EMT. Como tales, las alteraciones dinámicas de empalme isoforma expresión pueden ser capturados durante todo el curso de tiempo de EMT. Este método tiene ventajas sobre el uso de diferentes epithelial- o líneas de células mesenquimales-que representa para la comparación de splicing alternativo debido a antecedentes genéticos distintos de líneas celulares no relacionados, podrían influir indebidamente en el splicing ...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer a Wensheng Liu por su inestimable ayuda con la obtención de imágenes celulares. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (R01 CA182467), la Sociedad Americana del Cáncer (RSG-09-252-01-RMC), la Fundación Lynn Sage y la Fundación A Sister's Hope.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
4-hidroxitamoxifenoSigmaH7904Haga una solución madre disolviendo 4-hidroxitamoxifeno en etanol a 200 μM. Mantenga la solución a -20 ° C protegido de la luz.
E.Z.N.A. Kit de aislamiento de ARN totalOmega Bio-TekR6731Kit de aislamiento de ARN total
Sistema de transcripción inversa GoScriptPromegaA5001Reactivo para ensayo qRT-PCR
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6002Reactivo para ensayo qRT-PCR
LightCycler 480 Sistema de PCR en tiempo realRocheEquipo para ensayo qRT-PCR
Anticuerpo CD44R& D SystemsBBA10Dilución 1:1.000
Anticuerpo E-cadherinaTecnología de señalización celular4065Dilución 1:2.500 para inmunotransferencia; Dilución 1:50 para inmunofluorescencia
γ-Catenina anticuerpoTecnología de señalización2309Dilución 1:1.000
Anticuerpo OccludinSanta Cruz Biotechnology Inc.sc-5562dilución 1:500
anticuerpo de fibronectinaBD Transduction Laboratories610077dilución 1:5.000
anticuerpo de N-cadherinaBD Transduction Laboratories610920dilución 1:2.000
anticuerpo de vimentinaNeoMarkersMS-129-p1dilución 1:500
anticuerpo GAPDHMillipore CorporationMAB374dilución 1:10.000
Amasham ECL Reactivo de detección de Western blotGE Health Life ScienceRPN2209Sistema de quimioluminiscencia
celular

Referencias

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