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Evaluación de murino ejercicio de resistencia sin el uso de una rejilla de choque: Una Alternativa para el ejercicio forzado

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DOI:

10.3791/51846

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14 de agosto de 2014

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1Research Service, VA Puget Sound Health Care System, 2Seattle Institute for Biomedical and Clinical Research, 3Division of Gerontology and Geriatric Medicine, Department of Medicine, University of Washington, 4Geriatric Research, Education, and Clinical Center, VA Puget Sound Health Care System

En este artículo

Resumen

Se demuestra un método para evaluar la resistencia al ejercicio en ratones de laboratorio sin el uso de una rejilla de choque. Este método es un refinamiento humano que puede disminuir los efectos de confusión del estrés en los parámetros experimentales.

Resumen

El uso de modelos de ratones de laboratorio, las vías moleculares responsables de los beneficios metabólicos del ejercicio de resistencia están empezando a definir. El método más común para evaluar la resistencia al ejercicio en ratones utiliza obligó correr en una caminadora motorizada equipada con una rejilla de shock. Animales que dejan de correr son empujadas por la cinta sin fin en movimiento sobre una rejilla que proporciona una descarga eléctrica pie; para escapar del estímulo negativo, los ratones vuelven a correr sobre la cinta. Sin embargo, la conducta de evitación y el estrés psicológico debido a la utilización de un aparato de choque pueden interferir con la cuantificación de la carrera de resistencia, así como mediciones de confundir a los niveles de hormonas y citoquinas en suero post-ejercicio. En este sentido, demostrar y validar un método perfeccionado para medir la resistencia corriendo en naïve C57BL / 6 ratones de laboratorio sobre una caminadora motorizada sin utilizar una cuadrícula de shock. Cuando los ratones se preacclimated a la cinta de correr, corren voluntariamente con la marcha velocidades específicas para cada mouse. El uso de la rejilla de choque se sustituye por el estímulo suave por un operador humano utilizando un depresor de lengua, junto con la sensibilidad a la disposición voluntaria para ejecutarse en la parte del ratón. Criterios de valoración claros para cuantificar el tiempo hasta el agotamiento para cada ratón corriendo se definen y se reflejan en signos conductuales de agotamiento como la postura abocinada y dificultad para respirar. Este método es un refinamiento humano que también disminuye los efectos de confusión de la tensión en los parámetros experimentales.

Introducción

La obesidad, la resistencia a la insulina y la diabetes tipo 2 son los trastornos metabólicos relacionados entre sí que ejercen profundos efectos en la salud tanto de los EE.UU. y en todo el mundo las poblaciones 1-4. Los ejercicios de resistencia puede prevenir, así como de tratar, estas condiciones 5,6. Por otra parte, la evaluación de la velocidad de la marcha y la resistencia se utilizan pruebas de diagnóstico para el clínico como la fragilidad, sarcopenia, y las consecuencias de otros trastornos, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, en sujetos humanos 7.

Las vías bioquímicas que subyacen a los efectos beneficiosos del ejercicio de resistencia sobre la composición corporal y la sensibilidad a la insulina están comenzando a ser dilucidado, utilizando ratones genéticamente modificados o farmacológicamente que deben mostrarse mejoradas o reducidas capacidad de ejercicio 8-11. Sin embargo, muchos de estos estudios han utilizado cintas de correr motorizados equipados con rejillas de choque para obligar a los ratones para funcionar 8-11. Animales que dejan de correr son empujadas porla cinta sin fin en movimiento sobre una rejilla que proporciona una descarga eléctrica pie; para escapar del estímulo negativo, los ratones vuelven a correr sobre la cinta. Tales procedimientos pueden introducir estrés psicológico y la conducta de evitación como factores de confusión que afectan los parámetros experimentales 12. Otros métodos de medición de la resistencia, como la cuantificación de la actividad ambulatoria utilizando un aparato de rayo-break o cuantificación de en-jaula rueda para correr, pueden ser confundidos por la modulación de los ciclos circadianos, la ansiedad, la formación inadvertida, o alimentos comportamiento de búsqueda de 12-16. Además, estos procedimientos requieren la vivienda única, otra fuente de estrés psicológico para los ratones. Por lo tanto, se necesita una medición directa de ejercicio de resistencia no confundido por el estrés.

Para evitar estos problemas, nuestro laboratorio ha desarrollado y validado un método para evaluar la capacidad de funcionamiento máxima y sostenida velocidad de carrera en los ratones no tratados previamente, sin entrenamiento utilizando una caminadora motorizada no equiPPED con una rejilla de choque. El espacio al final de la cinta en funcionamiento, donde la red de choque normalmente reside, entonces se convierte en una plataforma para los ratones para descansar, y proporciona un lugar para los ratones que se niegan a ejecutar para sentarse hasta retirado del aparato. Se anima a los ratones a correr por un observador humano mediante suaves golpecitos o tocar con un depresor de lengua, junto con la sensibilidad a la disposición voluntaria para correr en la parte del ratón. Este método se ha utilizado para cuantificar las diferencias en el ejercicio de resistencia entre modificada genéticamente y controlar ratones C57BL / 6 que difieren en la expresión de la citoquina derivada de músculo interleucina-15 (IL-15) 16,17. Este método es un refinamiento humano que disminuye los efectos de confusión de refuerzo negativo causado por el uso de una rejilla de choque.

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Protocolo

El procedimiento descrito aquí fue aprobado por el Comité Institucional Animal Sound Cuidado y Uso VA Puget, y cumple con la Guía ILAR para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Preparación Experimental

  1. Decida de antemano si la sangre o la recogida de tejidos poco después es necesario hacer ejercicio, y si es así, determinar el intervalo post-ejercicio para la conducción de este tipo de procedimientos. Ejemplos incluyen la determinación de la hormona inducida por el ejercicio o la liberación de citoquinas en la circulación (que requiere la recogida de sangre), la determinación de la expresión inducida por el ejercicio de las especies de ARNm de interés (que requiere la eutanasia seguido por la recogida de tejidos). Si está indicado en la sangre después del ejercicio inmediato o la recogida de tejidos, tener materiales para estos procedimientos en la mano en la sala de procedimientos. Recibir la aprobación del comité institucional de revisión y llevar a cabo de acuerdo con las pautas reglamentarias. No todos los experimentos requieren de sangre después del ejercicio o collecti tejidoen; una simple comparación de la carrera de resistencia puede ser todo lo que se necesita.
  2. Decida de antemano en los grupos experimentales y los procedimientos post-ejercicio para los ratones (ver descripción anterior).
  3. Coloque la máquina para correr sobre una mesa resistente en una habitación tranquila dedicado durante los ensayos de propagación respecto a este procedimiento.
  4. Coloque la caminadora para carriles-ratón de tamaño y con una inclinación adecuada para el protocolo. La inclinación de 5 o se utiliza aquí para obviar el daño muscular debido al ejercicio excéntrico (alargando el músculo al mismo tiempo que la contracción) que se produce durante correr cuesta abajo.
  5. Coloque una almohadilla absorbente debajo de la cinta de correr para atrapar las heces.

2. Aclimatación de los ratones a la rueda de ardilla

Decida si una (sin ejercicio) grupo "sedentaria" de los ratones es necesario, y exponer los ratones sedentarios a la cinta de correr sin correr como se indica en los pasos 2.1 a 2.5. Determinar si se requieren 2 ó 4 grupos experimentales,. por ejemplo, sedentario / Ejercicio (2 grupos); Controles ejercidos / Ejercido Tratamiento (2 grupos, no hay animales sedentarios); o, sedentario x Control / Ejercidas / Tratamiento (4 grupos). El "tratamiento" puede ser un genotipo transgénico o nocaut, un régimen farmacológico, dieta especial, u otra intervención experimental.

  1. Deje que el ratón se aclimate a la sala de procedimientos en su jaula de transporte a casa, con sus compañeros de jaula, por 1 - 2 hr.
  2. Seleccione un solo ratón y número de etiqueta de registro; sopesar ratón y registrar el peso.
  3. Coloque el ratón en la cinta de correr sin el motor encendido durante la aclimatación, a unos 5 min. Encienda la alimentación eléctrica, sin el funcionamiento cinta sin fin, y dejar que el ratón se aclimate al ruido de la máquina durante otros 5 minutos.
  4. Retire los ratones en los grupos "sedentarios" (si se utiliza; véase la nota 1) de la cinta de correr en este punto y devolverlos a su jaula o realizar procedimientos posteriores al ejercicio de acuerdo con el diseño experimental (véase la Nota 2).

3. A partir de la prueba de corrida a Agotamiento

  1. Después de la aclimatación, girar la correa a baja velocidad (10 m / min) cuando el animal está explorando la cinta y no en la plataforma.
  2. Toque o levantar los cuartos traseros del ratón con un depresor de lengua, una a tres veces, para animar a los animales reacios a permanecer en la cinta de correr y correr suavemente.
    NOTA: La mayoría de los ratones se ejecutarán con facilidad, pero a veces detenerse durante períodos cortos. Cuando esto ocurre, utilice el depresor de lengua para golpear suavemente o levantar la parte trasera del animal para fomentar la reanudación de la carrera. A menudo, los ratones no deben ser manipuladas con el depresor de la lengua; darse la mano con el depresor de lengua que viene hacia ellos hace que los ratones a correr un poco más.
  3. Iniciar un temporizador de laboratorio una vez que el ratón está funcionando a la velocidad inicial de 10 m / min.
  4. Gire la velocidad lentamente cuando el ratón está en la parte superior (extremo cuesta arriba) de la cinta, en incrementos de 1 m / min, aproximadamente cada 2 min.
  5. Gire la velocidad a laconfiguración anterior si el ratón se ejecuta repetidamente en ráfagas cortas y no a un ritmo constante.
  6. Determinar la máxima velocidad de carrera sostenida de cada ratón (normalmente 14 - 17 m / min para ratones C57BL / 6) mediante el ajuste de la velocidad y viendo el ratón. Anote esta velocidad.
    NOTA: La ubicación del animal en la cinta salta al investigador como a la voluntad del animal para funcionar a una velocidad mayor. Si el ratón está en el (cuesta arriba) y otro extremo a punto de quedarse en la pared, que está listo para funcionar a una velocidad mayor. Si el ratón está funcionando a un ritmo constante en el medio de la cinta de correr que puede ser a su velocidad máxima, o puede necesitar un ajuste adicional, dependiendo de la calidad de la ejecución.

4. Endpoints y ratones que se detienen

  1. Utilice el depresor de lengua para golpear suavemente o levantar los cuartos traseros de los animales que se detienen, para alentar la reanudación de la carrera (véase Nota 3.2). No detener el temporizador por interrupciones temporales en el funcionamiento.
  2. Identificar y removratones e que se niegan a ejecutar. Nota esta en la hoja de datos. Dependiendo de su diseño experimental, los ratones que se niegan pueden ser reexaminados en un día diferente
    NOTA: Algunos ratones se niegan por completo a correr. Estos ratones se ejecutarán en ráfagas cortas, y luego se detiene para el novio o "pedal", es decir, sentarse en la plataforma y utilizar sus patas delanteras sobre la cinta. La postura de estos ratones es encorvada, con las cuatro patas plantadas en el animal para evitar ser empujado de nuevo en la cinta de correr por el depresor de lengua. De vez en cuando un ratón se vuelve agresivo hacia el depresor de lengua cuando dispuestos a correr, se muerda la lengua depresor o subir como una vía de escape. Está claro dentro de los primeros 5 minutos de la prueba si el ratón, o no quiere, correr. Retire los ratones que se niegan a correr a partir del análisis, pero no cuentan como ratones "sedentarios".
  3. Identificar los ratones agotados y detener el temporizador.
    NOTA: El agotamiento se define por tres paradas sucesivas y rehusar su reingresosume corriendo a pesar del estímulo suave, además de los signos físicos de agotamiento, como dificultad para respirar y la postura abocinada. Los ratones a recuperarse de agotamiento dentro de 30 a 60 min.
  4. Anote la cantidad total de tiempo dedicado a correr en todas las velocidades.
  5. Dependiendo del diseño experimental, o bien devolver el ratón es a su jaula, o llevar a cabo procedimientos de post-ejercicio inmediatos, como la sangre o la recogida de tejidos de acuerdo con las directrices institucionales.
  6. Limpiar la cinta limpia con una toallita germicida después de probar cada ratón individual de modo que el olor del ratón anterior no influye en el comportamiento de los ratones posteriores probadas.
  7. Pruebe el siguiente ratón. Utilice una lengua fresca depresor para cada ratón. Los ratones que residen en la misma jaula pueden ser probados secuencialmente en el mismo día sin aclimatación adicional a la sala de procedimiento.

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Resultados

Este procedimiento para la medición de la resistencia al ejercicio refleja con precisión el perfil molecular y metabólica de diferentes cepas de ratones C57BL / 6 que difieren en la expresión de la citoquina IL-15 16,17. Los ratones transgénicos que sobreexpresan IL-15 (IL-15 TG ratones) presentan un aumento significativamente plazo-hasta el agotamiento veces en comparación con los controles de la misma camada, mientras que los ratones que carecen de IL-15 (IL-15 KO ratones) exhiben una reducción considerable...

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Discusión

Se describe aquí es un método para evaluar la resistencia voluntaria funcionamiento en ratones de laboratorio usando una cinta de correr motorizada sin el uso de una rejilla de choque. Este método puede revelar diferencias entre los sub-líneas de ratones C57BL / 6 que difieren en la expresión de la citoquina IL-15, que a su vez provoca diferencias en la expresión de factores que subyacen 16,17 ejercicio de resistencia. En consonancia con los principios de las "Tres R" en animales de laboratorio, est...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

Agradecimientos

Con el apoyo de la opinión Mérito # BX001026 del Departamento de Asuntos de Veteranos (LSQ), y el uso de los recursos e instalaciones al Sistema de Salud VA Puget Sound, el Núcleo de Recursos transgénico en la Universidad de Washington Nathan Centro Choque de Excelencia en la Biología Básica de Adultos Mayores (NIA # 5P30AG-013280), y la Universidad de Washington Diabetes Centro de Investigación de Endocrinología (NIH # P30 DK-17047). Agradecemos a Cynthia Pekow DVM y Kari L. Koszdin DVM, VA Puget Sound, siempre útiles comentarios sobre el manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cinta de correr abierta para roedores Exer-3/6Columbus Instruments, Columbus OH1050RMEste número de catálogo es para modelos sin rejilla de choque. Las rejillas de choque se pueden quitar manualmente de los modelos más antiguos (Eco 3/6)
Sani Cloth Germicidal TowlettesPDI- Professional Disposables, Inc., Orangeburg, NYgeneralmente se pide a través de una instalación localContiene 10% de alcohol isopropílico; se puede usar cualquier producto equivalente.
Depresores lingualesCualquier proveedor
Temporizador de laboratorioCualquier proveedor
Ratones IL-15 TG*JAX, Bar Harbor, ME011002Murine Transgén IL-15 expresado a partir de un promotor de actina alfaesquelético humano modificado con secuencia de señal alterada para facilitar la secreción.
Ratones C57BL/6J (tipo salvaje)*JAX, Bar Harbor, ME000664Ratones de control para ratones IL-15 TG
IL-15 KO*Taconic Farms, Germantown, NY4269-MRatones homocigotos IL-15 "knockout" en C57BL/6 de fondo
C57BL/6NTac (tipo salvaje)*Taconic Farms, Germantown, NYB6-M Ratones decontrol para IL-15 KO
*Opcional; las líneas de ratón y los tratamientos pueden ser específicos para el experimento protocolo.
local

Referencias

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