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Summary

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

Abstract

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today’s preclinical research and clinical practice.

Introduction

Imágenes (fotoacústica) optoacústica atrae cada vez mayor interés por parte de las comunidades de investigación biológica y médica, tal como se manifiesta por el cada vez mayor número de publicaciones que abarcan gran variedad de nuevas aplicaciones que aprovechan las ventajas únicas que ofrece la tecnología de ^1-5. En particular, la capacidad de imagen espectral distintivos agentes de absorción de fotos con resolución espacio-temporal de alto a profundidades que van más allá del límite de difusión de la luz se abre capacidades sin precedentes para la proyección de imagen funcional y molecular ^6-10.

De hecho, la traducción de la tecnología en la práctica clínica optoacústica viene con perspectivas prometedoras en el diagnóstico y la monitorización del tratamiento de muchas enfermedades. Sin embargo, la limitada propagación de fotones en la dispersión ópticamente y tejidos absorbentes y las respuestas débiles generalmente asociados con el fenómeno optoacústica limitar la profundidad de aplicación del método. Como resultado, optoa de manosondas Coustic se han intentado partes de imagen accesible desde el exterior del cuerpo ^11,12 mientras que los sistemas endoscópicos se utilizan para proporcionar imágenes del interior del cuerpo mediante la inserción de ellos a través de orificios naturales ^13. Algunas partes de baja absorción del cuerpo humano, tales como la mama de la mujer, también se puede acceder por los escáneres tomográficos optoacústica ^14,15. De particular interés es el enfoque de mano, ya que permite gran versatilidad, de manera similar a la ecografía. Aquí, la adaptación de los ultrasonidos común gama de sondas lineales para imágenes optoacústica sigue siendo un reto, debido principalmente a diferencias fundamentales en los requisitos de formación de imágenes tomográficas entre ultrasonido y optoacoustics. Mientras altas velocidades de cuadro en la ecografía estándar están habilitadas por secuencial de transmisión-recepción esquemas que emplean frecuencias de repetición de pulso de alta en el rango de kHz, optoacústica de imágenes en tiempo real en tres dimensiones se consigue por la recolección simultánea de datos de tomografía volumétrica de una sola interrogating pulso de láser. Por lo tanto, la imagen optoacústica de alta calidad implica la adquisición de datos tridimensionales a partir de la más grande de ángulo sólido posible alrededor del objeto fotografiado.

Recientemente, se introdujo la primera sonda optoacústica de mano para tres dimensiones (volumétrica) de imágenes en tiempo real ^16. El sistema se basa en una matriz bidimensional de elementos piezoeléctricos 256 dispuestos sobre una superficie esférica (puntos azules en la figura 1A) que cubren un ángulo de 90 °. El tamaño de los elementos individuales de aproximadamente 3 x 3 mm ^2, así como su orientación y ancho de banda de frecuencia (aproximadamente 2-6 MHz) garantizan colección señal efectiva de un volumen centímetro escala que rodea el centro de la esfera (cubo negro en la figura 1A). Excitación óptica de la región de formación de imágenes está provisto de un haz de fibras insertado a través de una cavidad cilíndrica central de la matriz, de modo que cualquier longitud de onda SUSCeptible de ser transmitida a través del haz de fibras se puede utilizar para la imagen. Una imagen real de la matriz de transductores junto con el haz de fibras ópticas se muestra en la Figura 1B. La excitación eficiente y la detección simultánea de las señales permite formación de imágenes de tejido profundo con excitación de disparo único (un pulso láser), de modo que imágenes en tiempo real a una velocidad determinada por la frecuencia de repetición de impulsos del láser se activa adicionalmente con un Graphics- procesamiento de unidades (GPU) aplicación del procedimiento de reconstrucción ^17. Una carcasa cilíndrica con una membrana de polietileno transparente (Figura 1C) se une a la matriz de transductores para encerrar un medio líquido acústicamente transmitir (agua). La membrana está acoplado además al tejido por medio de gel acústico. Una imagen de la sonda optoacústica como se utiliza en el modo de operación de mano se muestra en la Figura 1D.

La THR demostradoee de imágenes de mano dimensional optoacústica combinada con la capacidad de formación de imágenes en tiempo real funcional venir con ventajas importantes para el diagnóstico clínico y una serie de aplicaciones potenciales se prevé para diversas indicaciones, tales como la enfermedad vascular periférica, trastornos del sistema linfático, cáncer de mama, lesiones de la piel, inflamación o artritis ^18. Además, la capacidad de formación de imágenes permite la visualización rápida de acontecimientos biológicos dinámicos con la sonda dispuesta en una posición estacionaria. Combinado con la longitud de onda de ajuste rápido oscilador paramétrico óptico (OPO) la tecnología láser, este enfoque permite la formación de imágenes en tiempo real de la biodistribución de agentes de absorción de fotos. De esta manera, las nuevas posibilidades pueden surgir igualmente en pequeñas aplicaciones de imágenes de animales, por ejemplo., En el estudio de la hemodinámica del tejido, el seguimiento in vivo de células, la visualización de la farmacocinética, la perfusión de órganos, dirigido imagen molecular de los tumores y el sistema cardiovascular, o la neuroimagen.

<p class = "jove_content"> En este trabajo se realiza una descripción detallada del protocolo de imagen experimental para operar con el rendimiento de la matriz esférica optoacústica de mano sonda y escaparate en varios escenarios clínicos por imágenes de animales y pequeñas típicas.

Protocol

El procedimiento detallado para operar con la sonda optoacústica volumétrica manual se describe a continuación. Este procedimiento se realiza de acuerdo a las regulaciones institucionales aprobados en relación con los experimentos en animales y humanos. 1. Sistema de Preparación Encender el láser durante un período de calentamiento de ~ 15 min antes de la operación para la estabilización del haz de luz de salida. Coloque la parte de agua que encierra con la membrana de aislamiento que está en contacto con la piel (Figura 1). NOTA: La distancia entre la membrana de aislamiento (en contacto con la piel) y la región con la máxima sensibilidad del transductor (centro de la sonda esférica) establece la profundidad de formación de imágenes eficaz. Llenar todo el volumen de aproximadamente 100 ml de aislamiento entre la membrana y la superficie del transductor con agua desionizada por medio de una bomba. Asegúrese de que no hay fugas de agua ni burbujas de aire son present. Por otra parte, evitar las burbujas de aire, proporcionando la recirculación de agua. Realizar los experimentos a temperatura ambiente y asegurar el medio de acoplamiento (agua) se mantiene a esta temperatura. 2. Preparación Imaging Preparación de imágenes humano. Eliminar el vello de la parte al-fotografiada-estar con una loción de depilación con el fin de evitar un fondo no deseado en las imágenes (este paso es opcional). Aplicar gel de ultrasonido sobre la piel alrededor de la región para formar una imagen con el fin de proporcionar un acoplamiento acústico eficiente. Coloque la sonda optoacústica en la región de interés. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en el gel de acoplamiento de ultrasonido. Preparación de imágenes de animales. Asegúrese de que los procedimientos de atención y experimentales con animales están de acuerdo con las normas y reglamentos institucionales y gubernamentales. Retire la piel del animal en la región para obtener imágenes con una loción de afeitar. Proteger los ojos del animal conungüento veterinario, lo que evita la sequedad y los daños causados ​​por la exposición a la radiación láser pulsada intensa. Anestesiar al animal mediante el uso de la inyección intraperitoneal (IP) de ketamina / xilazina (100 mg / kg de ketamina kg + 5 mg / kg kg de xilazina) antes del experimento o utilizar anestesia con isoflurano (2-3% (en volumen) con 0,9 l / flujo de gas min) durante el experimento. Confirmar anestesia comprobando el reflejo de la extremidad posterior del animal. Aplicar gel de ultrasonido sobre la piel alrededor de la región a ser fotografiado con el fin de proporcionar un acoplamiento acústico eficiente y colocar la sonda optoacústica en la región de interés. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en el gel de acoplamiento de ultrasonido. 3. Pre-vista del modo de funcionamiento Establecer la longitud de onda de formación de imágenes (s) entre 690 nm y 900 nm y la tasa de repetición de impulsos entre 10 y 50 Hz. Seleccione los parámetros para el sistema de adquisición de datos acústicos – 1 MWimpedancia de entrada. Adquirir 2.030 muestras para cada pulso de láser a una frecuencia de muestreo de 40 megamuestras por segundo y 12 bits de resolución vertical. Desencadenar la adquisición con la salida Q-switch del láser. Asegúrese de que tanto el operador y el paciente utilizar gafas de protección adaptadas a la longitud de onda (s) de excitación óptica. Ajustar la potencia del láser de manera que se mantiene la fluencia de luz en la superficie del tejido por debajo de 20 mJ / cm 2 durante el experimento para longitudes de onda del infrarrojo cercano con el fin de satisfacer los límites de exposición de seguridad para los experimentos humanos 19 y para evitar tensión térmica y daños en la piel en los animales . Iniciar el software pre-view con una implementación de algoritmos de procesamiento de GPU para permitir la visualización de imágenes en tres dimensiones a una velocidad correspondiente a la tasa de repetición de impulsos del láser. Mueva la sonda y / o el objeto a ser reflejado con el fin de optimizar el rendimiento de visualización y localización de las estructuras de interés. 4. Adquisición de Datos La adquisición de datos para el modo de exploración (de mano). Si es necesario, inyectar un agente de contraste antes de la adquisición de enriquecer el contraste en la región de interés. NOTA: En nuestros experimentos no hemos realizado la imagen humana con contraste. Sin embargo, diversos agentes de contraste pueden ser potencialmente utilizados para este propósito. Verde de indocianina (ICG) es un ejemplo de agente de contraste óptico aprobado clínicamente que se puede utilizar para la mejora del contraste en dosis máxima recomendada de 2 mg / kg de peso corporal en los adultos. Iniciar el hardware para la adquisición de datos con los parámetros descritos en 3,1 manteniendo la ejecución del software de vista previa. Mueva suavemente la sonda alrededor de la región fotografiada para realizar un seguimiento de las estructuras de interés. NOTA: Cuando las imágenes en múltiples longitudes de onda láser se adquieren simultáneamente, la velocidad del movimiento de la sonda en el modo de mano tiene que ser disminuido significativamente (preferiblemente por debajo de 2 mm / segpara una tasa de repetición de impulsos de láser de 50 Hz) con el fin de evitar artefactos relacionados con el movimiento en las imágenes espectralmente sin mezclar. La adquisición de datos para el modo estacionario. Monte el objeto fotografiado (ej., Los animales) y la sonda de mano en el soporte e iniciar la adquisición con los parámetros descritos en el punto 3.1, manteniendo la ejecución del software pre-vista. Mantener la sonda optoacústica y la parte de formación de imágenes en la misma posición durante el experimento para visualizar los eventos biológicos dinámicos en la región de interés. Inyectar un agente de contraste para rastrear su distribución dinámica en la región de interés. NOTA: En nuestros experimentos con ratones, verde de indocianina (ICG) se utilizó para la mejora del contraste. Como pauta general, una cantidad de 10 nmol o 0,4 mg / kg de ICG tiene que ser introducido en la circulación del ratón con el fin de crear un contraste detectable con optoacoustics multi-espectrales en vivo. NOTA: El agente de contraste debe seraprobado para uso humano y / o animal por la autoridad respectiva. 5. Finalización del Experimento Detenga el láser. Retire la sonda optoacústica de la región fotografiada. Para el estudio de los animales, detener el suministro de anestesia. Colocar el animal en un calentador de infrarrojos para mantener el calor y evitar el contacto con otros animales hasta que se recuperó de la anestesia. No deje que el animal sin vigilancia durante la recuperación de la anestesia. 6. Fuera de línea de procesamiento de datos Cargue el archivo (s) que contiene las señales optoacústica adquiridas en la aplicación de software utilizadas para el procesamiento de datos. Utilice un algoritmo de reconstrucción para obtener una matriz de matriz tridimensional correspondiente a una imagen volumétrica de la absorción óptica de cada fotograma y cada longitud de onda. NOTA: Para la reconstrucción, es preferible utilizar un algoritmo que representa factores de distorsión, como heterogéneodades y la atenuación en el objeto fotografiado, efectos de ancho de banda final y forma geométrica de los elementos de detección y variaciones de la luz de fluencia, a fin de obtener una representación más cuantitativa de la distribución de la energía absorbida. Usa un algoritmo de desmezcla para obtener, a partir de cada trama de múltiples longitudes de onda, un nuevo conjunto de matrices de la matriz tridimensional que representa la absorción óptica para cada sustancia absorbente presente en la muestra. Si es necesario, procesar aún más los conjuntos de matriz que representa la distribución de absorción óptica para facilitar la visualización y la lectura de los parámetros biológicamente relevantes.

Representative Results

Los resultados representativos, lo que demuestra la capacidad de la sonda optoacústica de mano volumétrico descrito, se exhiben en esta sección. En todos los casos, la fluencia de la luz en la superficie de la piel se mantuvo por debajo del límite de exposición seguridad de 20 mJ / cm 2 19. El rendimiento de la sonda en tiempo real el seguimiento de la vasculatura periférica humana se mostró en la Figura 2. Durante el curso de este experimento, la sonda se …

Discussion

Las ventajas únicas que ofrece técnicas de imagen optoacústica en la investigación con animales pequeños han creado una fuerte motivación para la traducción de la tecnología en la práctica clínica, con una serie de diagnósticos y aplicaciones de monitoreo de tratamiento previstas por ejemplo., En el cáncer de piel de la mama y, inflamación o enfermedades vasculatura periférica. Sin embargo, a diferencia de los ratones o animales más pequeños, que pueden estar rodeado de un número suficiente de …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Optical parametric oscillator (OPO)-based laser	Innolas Laser GmbH, Krailling (Germany)	custom-made	The laser provides laser pulses with a duration around 10ns and an energy up to 80mJ. The wavelength is tunable between 680-950nm.
Spherical array of piezocomposite detectors	Imasonic SaS, Voray (France)	custom-made	The array consists of 256 piezoelectric sensors distributed on a spherical surface. Each element has dimensions 3x3mm2, a central frequency of 4MHz and a bandwidth of 100%.
Data acquisition system (DAQ)	Falkenstein Mikrosysteme GmbH, Taufkirchen (Germany)	custom-made	The DAQ simultaneously acquires 256 signals at 40 megasamples per second and 2030 samples. The input impedance is 1MW.
Fiber bundle	CeramOptec GmbH, Bonn (Germany)	custom-made	The bundle consists of 480 individual fibers randomly distributed in the input and output. The numerical aperture of each individual fiber is 0.22.
Athymic Nude mouse	Harlan Laboratories (The Netherlands)	Athymic nude – Foxn1nu	The mouse was 8 weeks old (adult) at the time of the experiment. The ethical protocol was approved by the Bavarian goverment (number 55.2.1.54-2632-102-11)
Bepanthen cream	Bayer AG (Germany)	N/A	Vet ointment to protect the eyes during anesthesia
Data processing software	Matlab (Mathworks, Natick, MA, USA)	custom-made	The data processing software was devoped at our institute. It allows reconstruction at each wavelength and multi-wavelength unmixing, as well as further data processing.
Water-enclosing part	N/A	custom-made	This part contains the water that acts as an acoustic coupling medium between skin and transducer elements
Indocyanine green (ICG)	PULSION Medical Systems SE	N/A	ICG-PULSION (active ingredient: indocyanine green dye) is a drug used in cardiac, circulatory and micro-circulatory diagnostics, liver function diagnostics and ophthalmic angiography diagnostics.