La competencia en Streptococcus pneumoniae está mediada por bacteriocinas, pequeños péptidos antimicrobianos con actividad inhibitoria hacia el neumococo y otras especies relacionadas. Aquí describimos un ensayo de superposición bacteriana optimizado que permite la caracterización de la actividad de la bacteriocina y el espectro inhibitorio, la inmunidad específica de la bacteriocina y la detección de péptidos de detección de quórum secretados.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Uso de la superposición de ensayo para medir cualitativamente la producción bacteriana y sensibilidad hacia neumocócica bacteriocinas
En este artículo
Resumen
Resumen
Streptococcus pneumoniae coloniza la comunidad polimicrobiana altamente diversa de la nasofaringe, donde debe competir con los organismos residentes. Hemos demostrado que los péptidos antimicrobianos producidos por bacterias (bacteriocinas) dictan el resultado de estas interacciones competitivas. Todas las cepas neumocócicas completamente secuenciadas albergan un locus de eptide bacteriocin-l ike p (blp). El locus blp codifica una variedad de bacteriocinas diversas y todos los componentes altamente conservados necesarios para su regulación, procesamiento y secreción. La diversidad de las bacteriocinas que se encuentran en la región de inmunidad a las bacteriocinas (BIR) del locus es uno de los principales contribuyentes a la competencia neumocócica. Junto con las bacteriocinas, los genes de inmunidad se encuentran en el BIR y son necesarios para proteger a la célula productora de los efectos de su propia bacteriocina. El ensayo de superposición es un método rápido para examinar un gran número de cepas en busca de interacciones competitivas mediadas por bacteriocinas. El ensayo de superposición también permite la caracterización de la inmunidad específica de la bacteriocina y la detección de péptidos de detección de quórum secretados. El ensayo se realiza mediante la inoculación previa de una placa de agar con una cepa que se va a analizar para la producción de bacteriocina, seguida de la aplicación de una capa de agar suave que contiene una cepa que se va a probar para determinar la sensibilidad a la bacteriocina. Una zona de aclaramiento que rodea la puñalada indica que la cepa superpuesta es sensible a las bacteriocinas producidas por la cepa preinoculada. Si no se observa ninguna zona de aclaramiento, la cepa superpuesta es inmune a las bacteriocinas que se producen o la cepa preinoculada no produce bacteriocinas. Para determinar si el locus blp es funcional en una cepa determinada, el ensayo de superposición se puede adaptar para evaluar la secreción de feromonas peptídicas por la cepa preinoculada. En este caso, se utilizan en la superposición una serie de cuatro cepas lacZ-reportera con diferente especificidad de feromonas.
Introducción
Streptococcus pneumoniae, un colonizador común de la comunidad polimicrobiana de la nasofaringe, es capaz de competir con otros neumococos y especies estrechamente relacionadas con la producción de péptidos antimicrobianos producidos por bacterias (bacteriocinas). Cada cepa de neumococo totalmente secuenciado-examinado hasta la fecha contiene una versión de la l ike locus p eptide b acteriocin-, BLP. La producción de bacteriocina por el neumococo ha demostrado ser importante en el resultado de tanto in vitro como in vivo en la competición 1-4. Dinámica competitiva están influenciados por la expresión de diversas bacteriocinas junto con proteínas de la inmunidad afines en respuesta a una feromona específica de péptido. Inducción del locus BLP está controlado por un sistema de detección de quórum en la que una feromona péptido, BLPC, se une a la quinasa sensor, BlpH, e inicia una cascada de señalización que resulta en lala transcripción del locus 5,6 BLP. Hay cuatro variaciones alélicas de BLPC que se unen cada uno a su BlpH afines 6. Para la célula para sobrevivir a los efectos de su propia bacteriocina, los genes que codifican proteínas de la inmunidad afines se transcriben en el mismo operón como cada uno de los genes de bacteriocina. Killing se produce si una cepa competidor no es capaz de regular positivamente el locus BLP en respuesta a la feromona exógeno o, si la cepa carece del gen de inmunidad específica necesaria para la protección. El complejo transportador, BlpAB se requiere para la secreción y el procesamiento de la feromona de péptidos y los péptidos de bacteriocina 2,4. Recientemente, se ha demostrado que una proporción significativa de cepas neumocócicas son "tramposos" que significa que tienen una mutación en el gen conservado BLPA que las hace incapaces de secretar feromonas y bacteriocinas 1,2. Estas cepas son capaces de responder a BLPC exógeno 2 secretada por relinchocepas aburridas que permitan la producción de proteínas de la inmunidad.
Aunque, preparaciones crudas de bacteriocinas a partir de sobrenadantes se pueden preparar a partir de cepas de productores usando métodos pasos bioquímicos para lograr la pureza, este enfoque no es útil para el cribado de grandes colecciones de cepas y si el nivel de expresión de bacteriocina es baja en caldos de cultivo crecido 2,7- 9. La superposición de ensayo se utiliza como una forma rápida para investigar la dinámica competitiva entre las cepas que puedan existir en vitro. Para ello, una cepa neumocócica es pre-inocularon en una placa de agar y se dejaron crecer hasta alcanzar concentraciones bacterianas locales suficientes para la inducción del locus BLP. Una segunda cepa se inocula luego en una solución de agar blando fundido que se aplica entonces sobre la cepa de pre inoculado para la prueba de sensibilidad. Para evaluar la actividad del locus BLP (independiente de la actividad inhibitoria), las cepas pueden ser superpuestos con una serie de juree reportero cepas BLPC descritos anteriormente. Se construyeron estas cepas para contener uno de los tres alelos blpH diferentes que responden a las tres feromonas BLPC más comunes secretadas por el neumococo. Las cepas indicadoras tienen un gen lacZ integrado que está bajo el control de un promotor dependiente de BlpH y llevar a una deleción en el gen BLPC que impide la auto-estimulación 10,11.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1 Preparación de la cepa productora
- Racha de una cepa neumocócica a ensayar para la producción de bacteriocinas en una sangre de oveja de soja tríptico placa de agar 5% desde -80 ° C congelador stocks.
NOTA: La utilización de placas de sangre para el crecimiento inicial de la cepa a ensayar para la inhibición aumenta en gran medida la reproducibilidad del ensayo. Además, otras cepas no neumocócicas que producen bacteriocinas pueden ser utilizados aunque pueden necesitar ser modificados para un organismo específico condiciones de crecimiento. Hemos utilizado Streptococcus mitis y Lactococcus lactis en el ensayo de recubrimiento con éxito. - Incubar la placa durante la noche (O / N) a 37 ° C con 5% de CO 2.
- Después de la incubación de la cepa productora, preparar la placa de agar de soja tríptico (TSA) pipeteando 3000 a 4000 unidades de catalasa sobre placas que contienen 25 ml de TSA y se extendió la solución de catalasa usando perlas de vidrio estériles. Deje que la placa se seque durante 10 minutos bajouna cabina de seguridad biológica.
- Se recoge una cantidad visible de bacterias en una punta de la pipeta. Apuñalar a la punta de la pipeta en la placa de TSA seca.
NOTA: Mas de una cepa productora puede ser apuñalado en una sola placa de TSA. Es importante espaciar las puñaladas de manera que halos resultantes no se solapan.- Si es posible, incluir conocido productor de bacteriocina como un control positivo y la cepa para ser utilizado en la superposición como un control negativo.
NOTA: Los controles positivos y negativos son han sido publicados con anterioridad y están disponibles bajo petición 10.
- Si es posible, incluir conocido productor de bacteriocina como un control positivo y la cepa para ser utilizado en la superposición como un control negativo.
- Incubar la placa TSA contiene múltiples puñaladas a 37 ° C con CO2 al 5% durante 6 horas.
2. Hacer reservas de glicerina de la cepa Overlay
- Preparar stocks de glicerol (cultivos desarrollados a mediados de la fase exponencial y luego almacenados a -80 ° C después de la adición de glicerol) antes del día del ensayo de superposición. Inocular 5-10 colonias de str neumocócicaain a hacerse la prueba de sensibilidad o secreción de feromonas en medio Todd-Hewitt con extracto de levadura al 0,5% (THY).
NOTA: Construcción de BLPC reporteros inducibles se ha descrito previamente 2 y cepas están disponibles bajo petición. - Incubar 5-10 colonias en tubos de vidrio con 5 ml de THY con tapas bien cerrados, en un baño de agua a 37 ° C sin agitación.
- Incubar cultivos a 37 ° C hasta que llegan a un OD 620 de 0,3 a 0,5.
NOTA: Esto tomará aproximadamente 4-5 horas, dependiendo de la cepa utilizada.- Invierta suavemente el tubo un par de veces antes de la medición de la densidad óptica.
- Si el experimento no se puede realizar el mismo día o de la cepa se puede utilizar varias veces en el futuro, hacer stocks de glicerol y reanudar el experimento en una fecha posterior. Para las poblaciones de glicerol, glicerol añadir a los cultivos a una concentración final de 20%. Culturas alícuotas en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y almacenar a -80 ° C. NOTA: Las muestras pueden ser sreada durante meses a -80 ° C. Si no hacer stocks de glicerol, utilizar muestras directamente para el ensayo de superposición.
3. Overlay Ensayo
- Justo antes de la aplicación superponer, mezclar los componentes de superposición. En un tubo cónico de 15 ml, añadir 5 ml de THY, 3.000-4.000 U de catalasa, y 200 l de caldo de cultivo cepa superposición que se ha cultivado ese día o una acción de glicerol de la cultura que se descongela a temperatura ambiente. Si se utiliza la cepa reportero, añadir 50 l de X-gal (40 mg / ml) a la mezcla de superposición. Utilice un tubo cónico por placa.
- Equilibrar mezcla de recubrimiento a temperatura ambiente antes de la adición de TSA fundido.
- Retire la placa de TSA con la cepa apuñalado de la incubadora. Derretir sólido TSA en el microondas y mantener a 55 ° C baño de agua hasta que esté listo para usar. Añadir 3 ml de TSA fundido con 1,5% de agar se enfría a 55 ° C para superponer mezcla.
- Preparar la mezcla de superposición inmediatamente antes de pipeteo, la mezcla empezará a solidificar muyrápidamente. NOTA: Si la cubierta comienza a solidificarse antes de enchapado, los resultados serán imposibles de interpretar.
- Mezclar la mezcla de superposición pipeteando arriba y abajo varias veces con una pipeta de 5 ml con cuidado de no introducir burbujas en la mezcla. Lentamente pipetear mezcla de superposición directamente sobre la placa de TSA apuñalado. Mantenga la placa sobre la mesa de trabajo para pocos minutos permitiendo que el agar se endurezca.
- No gire la placa para distribuir la mezcla de superposición, este se tire el crecimiento de la cultura apuñalado en la superposición.
- Con cuidado, coloque la placa de TSA con plantilla a 37 ° C incubadora que contiene 5% de CO 2 O / N (aproximadamente 16 a 18 h).
- Observar las placas después del crecimiento durante la noche. Las placas deben aparecer opaco de crecimiento de la cepa de superposición excepto en las zonas donde se ha producido la inhibición o la feromona de señalización. Estos aparecerán como zonas bien claros o azules alrededor de la cepa apuñalado, respectivamente.
NOTA: Aunque measurelemen- del diámetro de la compensación de color azul o se pueden determinar para la evaluación cuantitativa, las diferencias en el diámetro también puede variar dependiendo de la cantidad de bacterias que se clavó en la placa. La superposición de ensayo es un ensayo cualitativo, cualquier evaluación cuantitativa debe ser interpretado con cautela. Cualquier compensación visible en comparación con el control negativo se considera como actividad.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Hay dos posibles resultados en el ensayo de recubrimiento. Debe ser posible ver el crecimiento de la cepa acuchillado después de la incubación durante la noche. En la Figura 1A, la cepa es sensible a la superposición de las bacteriocinas que se producen. Un espacio libre se puede visualizar que rodea la cepa apuñalado. Además, remolino de la cepa acuchillado en la mezcla de superposición es posible y se puede ver en la Figura 1A. En la Figura 1B, la cepa de superposició...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Esta superposición de ensayo es una manera rápida de determinar la gama de actividades para los productores de bacteriocinas y para demostrar las interacciones competitivas que pueden ocurrir entre las cepas de neumococo. El ensayo de superposición se puede adaptar a utilizar para la detección de múltiples cepas para la producción de bacteriocina en una sola placa. Hemos analizado con éxito grandes colecciones de cepas con este ensayo mediante el uso de un replicador de 48 pines para inocular placas de SBA de la mitad d...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido apoyado por el Premio de Investigación Elizabeth E. Kennedy.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agar de soja tripticasa con 5% de sangre de oveja | Fisher | B21261X | Para el crecimiento a partir de cultivos congelados |
| Catalasa | Sigma | C100-500mg | 4,741 Unidades por plato |
| Todd Hewitt Caldo + Extracto de Levadura (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g de THB, 5 g de extracto de levadura, 1 L de autoclave ddH2O |
| Tripticasa, Caldo de Soja + Placas de Agar (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g de TS, 15 g de agar, 1 L de autoclave ddH2O |
| 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galactopiranósido (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Disolver en placas de Petri de dimetilformamida |
| Espectrómetro | Fisher Mide el OD620 de los cultivos | ||
| C baño | |||
| 37 ° Incubadora C con 5% CO2 | |||
| Tubo |
Referencias
- Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
- Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
- Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
- Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
- Saizieu, A., et al. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide. J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).
- Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10. PLoS One. 8 (10), 77751(2013).
- Wladyka, B., et al. Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).
- Shea, E. F., et al. Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity. 4 (6), 00498-00413 (2013).
- Son, M. R., et al. Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters. MBio. 2 (5), (2011).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).
- Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
- Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
