Artículo de método

Un método altamente reproducible y fácil de Perform En Vivo Ocular enucleación en el ratón después de la abertura del ojo

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DOI:

10.3791/51936

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6 de octubre de 2014

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1Department of Biology, KU Leuven - University of Leuven

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

La eliminación de los ojos, también llamado enucleación, ofrece una estrategia útil para estudiar los aspectos de la visual, cross-modal, y la plasticidad del desarrollo a lo largo del sistema visual de mamíferos ya que induce irreversible parcial (monocular) o completa (binocular) pérdida de la visión. Aquí se describe un enfoque altamente reproducible y fácil de realizar en la enucleación vivo.

Resumen

La enucleación o la extirpación quirúrgica de un ojo generalmente se pueden considerar como un modelo para deaferentación nervio. Proporciona una herramienta valiosa para estudiar los diferentes aspectos de la visual, cross-modal y la plasticidad del desarrollo a lo largo del sistema visual mamífero 1-4.

Este sentido, demuestran una técnica elegante y sencillo para la extracción de uno o ambos ojos en el ratón, que se validó en ratones de 20 días de edad hasta adultos. Brevemente, un desinfectados pinzas curvas se utiliza para pinzar el nervio óptico detrás del ojo. Posteriormente, se realizan movimientos circulares para constreñir el nervio óptico y quitar el globo ocular. Las ventajas de esta técnica son de alta reproducibilidad, un mínimo o ningún sangrado, rápida recuperación post-operatorio y un umbral muy bajo de aprendizaje para el experimentador. Por lo tanto, una gran cantidad de animales puede ser manipulada y procesada con la cantidad mínima de esfuerzo. La naturaleza de la técnica puede inducir daños leves ala retina durante el procedimiento. Este efecto secundario hace que este método menos adecuado en comparación con Mahajan et al. (2011) 5, si el objetivo es recoger y analizar el tejido de la retina. Además, nuestro método se limita a post-oculares apertura de edades (de ratón: P10 - 13 en adelante) ya que el globo ocular necesita ser desplazados de la toma de corriente sin la eliminación de los párpados. La técnica de enucleación in vivo descrito en este manuscrito se ha aplicado recientemente con éxito con modificaciones menores en las ratas y parece útil para estudiar la vía visual aferente de los roedores en general.

Introducción

Extracción de un ojo y con ello destruyendo irreversiblemente la superficie del receptor sensorial (retina), impone una considerable pérdida de información sensorial a lo largo de la vía visual. El modelo de la enucleación en el sistema visual juveniles y adultos ha demostrado ser valiosa para comprender el desarrollo, la plasticidad y la función de diferentes centros visuales 1-4. Las consecuencias moleculares, celulares y fisiológicos de esta privación sensorial pueden ayudar a comprender cómo se regula el desarrollo normal y Cómo se forman circuitos corticales hacer frente y cambian su estructura y función en respuesta a un amplio cambio de esta naturaleza en la experiencia.

Existen diferentes métodos de privación visual y todos ellos tienen sus ventajas específicas en la investigación relacionada con la visión. Por ejemplo la cría oscuro específicamente elimina la actividad impulsada visualmente, sin embargo, no afecta a la actividad retinal espontáneo. Visua Del mismo modo, las suturas tapa o parches de los ojos Quitar modeladosl entrada sin perturbar la actividad espontánea, sino que permiten la penetración de luz dispersa a través de los ojos cerrados. Estos métodos son reversibles y se ha demostrado ser valiosa en la comprensión del papel de la visión y de bajo nivel modelado correlación de entradas binoculares en esculpir circuitos corticales durante el desarrollo 6-8. En la investigación glaucoma, el modelo de aplastamiento del nervio óptico en los animales adultos se ha utilizado ampliamente debido a que establece una pérdida progresiva de entradas de células ganglionares de la retina que constituyen el nervio óptico 9,10. Por otro lado, la enucleación, donde el ojo y por lo tanto la retina se elimina completamente y al instante, es la elección apropiada de la privación cuando el objetivo es eliminar de manera irreversible la visión tanto espontánea como patrón a la vez. También induce una robusta actividad intraocular desequilibrio que puede mejorar la relación señal a ruido en estudios de mapeo de la actividad 11,12. La comparación de los cambios funcionales y estructurales en respuesta a la enucleación con la famiose después de la privación por métodos menos drásticos tales como sutura tapa por ejemplo, también podría exponer nuevas ideas sobre el papel de la actividad espontánea de la retina en ambos tipos homeostáticos y de la plasticidad sináptica.

La enucleación desencadena una pérdida de influencias tróficas en objetivos directos de la retina. Por ejemplo, los niveles de BDNF están regulados a la baja de manera significativa en el núcleo lateral geniculado (LGN) y colículo superior de ratas adultas enucleados 13. Especies reactivas de oxígeno, que funcionan como moléculas mensajeras para mediar remodelación estructural, también se detectaron en las estructuras subcorticales del sistema visual 14 de rata adulta. Además, microglial y astroglial de activación a través de diferentes estructuras subcorticales objetivo visual en el ratón se producen en un marco de tiempo post-enucleación específico de una semana 15. Juntos, los resultados de deaferenciación óptica en diferentes respuestas subcorticales en el glial, nivel estructural y molecular. A pesar de estas subcorticalefectos, que no implican necesariamente efectos a nivel cortical 16. Digno de mención, la plasticidad cortical cross-modal, incluyendo modificaciones en otras áreas sensoriales junto al fortalecimiento de las entradas no visuales a la corteza visual privados se producen después de tanto monocular (ME) 3,4,17,18 y binocular (BE) 1,17 enucleación.

Además de contribuir a la neurociencia visual, la enucleación como un tipo de deaferentación se puede utilizar para estudiar el equilibrio entre neuroprotectores 19 y neurodegenerativas 20-22 propiedades del sistema nervioso central.

Los diferentes procedimientos para llevar a cabo la enucleación ya se han descrito en la literatura. Algunas metodologías para in vivo ME en ratas y ratones son menos sencillo debido a seccionamiento innecesaria de los músculos orbitales y tejido 23-25. Otras publicaciones como Mahajan et al. (2011) 5 proporcionan un protocolo detallado utilizando disección roma para una colección de alto rendimiento de los ojos para estudiar las correlaciones genotipo-fenotipo, probablemente post-mortem. Para su propósito, el método es conveniente y rápido. Sin embargo, este método es menos adecuado para la enucleación in vivo cuando uno opta para estudiar la vía visual aferente después de la enucleación (en los animales vivos) en lugar del propio ojo. En tal escenario, la supervivencia después de la enucleación es de gran importancia. Además, minimal daños vivo y preservación del nervio óptico y el tejido orbital es favorable. A continuación, presentamos un método enucleación alternativa, más similar a la descrita por Faguet et al (2008) 26, que ofrece ciertas propiedades ventajosas:. Se asocia con una recuperación postoperatoria rápida y se caracteriza por un umbral muy bajo de aprendizaje para los investigadores. En general, los diferentes métodos son complementarios dependiendo del enfoque de la investigación posterior: la morfología de los ojos o la investigación de las vías ópticas.

ve_content "> En suma, la enucleación se puede aplicar de investigación de la visión hacia investigaciones de plasticidad homeostática y la cruz-modal cerebro, propiedades de respuesta gliales, y la estabilidad axón. En este artículo visualizado, se demuestra un método factible y fiable para la enucleación del ojo in vivo en el ratón.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por el comité de ética de la investigación de la KU Leuven y eran estrictamente de acuerdo con las Comunidades Europeas la Directiva del Consejo de 22 de septiembre 2010 (2010/63 / UE) y con la legislación belga (KB de 29 de mayo de 2013). Se hicieron todos los esfuerzos posibles para minimizar el sufrimiento de los animales y reducir el número de animales.

1. Animal Tratamiento y Anestésicos

  1. Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de una mezcla de clorhidrato de ketamina (75 mg / ml) e hidrocloruro de medetomidina (1 mg / kg) en solución salina.
  2. Compruebe los reflejos apretando los dedos de los pies con una pinza para asegurar el ratón está completamente sedado.
  3. Aplicar etanol al 70% para la desinfección de los párpados y la región que rodea el ojo con una punta de algodón. Compruebe el reflejo palpebral para evaluar adicionalmente el grado de sedación.

2. Eliminar el Ojo

  1. Asegúrese de que el animal reside en un plano, seco ysuperficie lisa.
  2. Esterilizar un fórceps con una punta dentada (tamaño de la punta preferido: 0,5 x 0,4 mm) curvada.
  3. Presione suavemente sobre el canto (en la esquina del ojo) con las pinzas hasta que el globo ocular es desplazado de la toma y el nervio óptico es alcanzable.
  4. Guía de las pinzas detrás del ojo. Mantenga pulsado el nervio óptico firmemente, preferiblemente con el comienzo de la curva y no la punta de la pinza. Esto ayudará a levantar el globo de la toma y para sujetar el nervio óptico completo.
  5. Haga movimientos circulares con la mano que sostiene la pinza en la dirección con la menor resistencia mientras que el ratón permanece en la superficie plana. El ratón se moverá a lo largo de la superficie de acuerdo a la dirección del movimiento de la mano.
  6. Lleve a cabo esta acción con el aumento de la velocidad gradualmente hasta que el nervio óptico está restringido en dos (por lo general entre 7 a 15 movimientos circulares, aproximadamente de media a una vuelta completa por segundo). Por lo tanto, el globo ocular es independienteeliminado.

Cuidado 3. postoperatoria

  1. En caso de sangrado (poco frecuente), llenar la órbita con un coagulado viscoso y agente hemostático.
  2. Invertir la anestesia mediante la inyección de 1 mg / kg de clorhidrato de atipamezol en solución salina por vía intraperitoneal.
  3. Administrar 1 mg / kg de meloxicam por vía intraperitoneal cada 24 horas para aliviar el dolor.
  4. Aplicar pomada ocular al ojo restante para prevenir la deshidratación de la córnea.
  5. Deje que el animal se recupere en una placa calefactora o envuelva el animal en material aislante en una jaula separada para controlar la temperatura corporal.
  6. Medir el peso del ratón cada día durante al menos 2 días. La pérdida de peso puede indicar sufrimiento y en este caso, continuar con el tratamiento Meloxicam hasta que el animal está totalmente recuperado.

Resultados

La Figura 1 ilustra la eliminación con éxito del ojo utilizando el protocolo descrito y se caracteriza por la ausencia de sangrado o cualquier daño físico evidente para el tejido orbital o cuenca del ojo (Figuras 1A, 1B). Además, el ojo tiene una córnea eliminado lisa, la coroides y el disco óptico, indicativo de un globo completamente intacto (Figura 1C). Dado que nuestro protocolo incluye la sujeción del nervio óptico detrás del ojo y de giro mecánico, el nervio óptico del ojo eliminado es constreñido en la base de la retina (Figura 1D). Realización de los descritos procedimiento da como resultado un nervio óptico de corte limpio y sin ningún daño a la zona cerebral circundante (Figura 1E).

Enucleación monocular, en combinación con el mapeo de la actividad (Figura 2), permite delinear fuertemente las regiones funcionales de entrada u ojo específicos en el visua contralaterall corteza del ratón 12,27 o columnas de dominancia ocular, incluso en los mamíferos de orden superior como los monos 28.

En experimentos con ratones, la eliminación de una (ME) o ambos ojos (BE) en combinación con la estimulación visual específica y la detección de ARNm de zif268 o c-Fos los niveles de expresión de proteínas se aplicó para descubrir la activación neuronal regional en la corteza visual 12,27 . En contraste con los controles estimulados visualmente (Figura 2A), BE ratones mostraron actividad basal en la corteza visual debido a la completa falta de información visual (Figura 2B). Como tal, se descubrieron las fronteras entre visual con corteza no visual (es decir. Corteza somatosensorial en más secciones anterior y la corteza auditiva en más secciones posteriores). Los resultados de ME ratones con una semana de tiempo de supervivencia visualizaron las regiones de entrada específicos de los ojos en la corteza visual contralateral. Las dos regiones monocularmente impulsadas fueron hipoactivo y ubicados mediy al lateral de la zona binocular central (Figura 2C).

Diagrama de disección de ratón que muestra el proceso de extirpación del ojo, la coroides, el disco óptico y la anatomía del cerebro.
Figura 1. Evaluación cualitativa del estado post-enucleación de la cuenca del ojo, el ojo eliminado y el nervio óptico. Después de la eliminación del ojo con unas pinzas curvas (A) no hay sangrado o daño se observa en la cuenca del ojo (B). El ojo es eliminado completamente intacto como se refleja por una apariencia normal de la córnea y la coroides (C, D). El nervio óptico se estrecha en el disco óptico donde sale del ojo (D). El examen de la parte ventral del cerebro revela un nervio corte limpio óptica (asterisco) y ningún daño aparente a otras estructuras (E). Las barras de escala en C, D: 1 mm. La barra de escala en E: 5 mm. A: anterior; L: izquierdo; P: posterior; R: derecha.


Figura 2. funcionales subdivisiones específicas ojo-de entrada en la corteza visual del ratón según lo revelado por la enucleación. Las líneas negras y grises que conectan los ojos y la corteza representan el entrecruzamiento de las fibras aferentes de la retina y de las regiones de entrada específicos de los ojos. La actividad neuronal se visualiza en secciones coronales de control (A), BE (B) y ME (C) ratones por radiactiva de hibridación in situ (ISH) para zif268 (escala de grises) en torno al nivel Bregma -3.40 mm. En los animales control (a), la corteza visual en ambos hemisferios expresa una alta actividad después de la estimulación visual. Cuando uno o ambos ojos (s) se extirpa, una clara disminución de la señal de la actividad es visible en las regiones corticales privadas correspondientes. Monocular enucleado (C) ratones muestran una zona de alta actividad en la zona binocular de la corteza visual rodeado por una disminución de la señal en las zonas monoculares contralaterales al ojo eliminado. Barra de escala: 2 mm. Reproducido con permiso del Van Brussel et al 12.

Discusión

Para realizar una enucleación exitosa de acuerdo con nuestro método, los pasos más importantes a considerar son: 1) el uso de unas pinzas con una punta curvada y dentada del tamaño adecuado; 2) la realización de la enucleación en una superficie suave y seco; y 3) acelerar gradualmente los movimientos circulares en la dirección con la menor fricción.

Para un resultado eficaz, es esencial utilizar un fórceps adecuados caracterizados por una punta curvada y dentada (tamaño de la punta preferido: ratón: 0,5 x 0,4 mm; rata: 2,15 x 1,3 mm). La curvatura permite un fácil acceso al nervio óptico después del desplazamiento globo ocular y es necesario para la colocación correcta de la mano al realizar los movimientos circulares. Puntas suaves no son recomendables ya que carecen de la necesaria agarre al sostener el nervio óptico. El fracaso para mantener el nervio óptico correctamente durante los movimientos circulares resulta en la ruptura de la arteria oftálmica, pobres desprendimiento del ojo y por lo tanto mala reproducibilidad.Por lo tanto se recomienda primera práctica esta técnica en animales sacrificados para la optimización de las pinzas de manipulación con el fin de garantizar el bienestar animal máxima una vez que la aplicación del método in vivo. El éxito de la enucleación del ojo también ha sido recientemente realizado en la rata en nuestro laboratorio utilizando la misma técnica, excepto para girar manualmente el cuerpo del animal y mantener estacionario el fórceps.

Una limitación de la técnica es que posiblemente podría dañar la retina. Por lo tanto este método es menos adecuado para recoger retinas para llevar a cabo la histología 5. Por otra parte, nuestro método se limita a publicar la apertura del ojo edades ya que el globo ocular debe ser desplazado de la toma sin quitar o cortar los párpados.

Enucleación del ojo en diferentes especies, incluyendo roedores, se realiza de forma rutinaria utilizando métodos alternativos, que a menudo conllevan la eliminación de los párpados y el corte del nervio óptico 18,23-25. Estos methods tienden a ser más invasivos y tienen una curva de aprendizaje más alta que la técnica descrita aquí. Sin la necesidad de retirar o sutura de los párpados, el tiempo de recuperación después de la cirugía se reduce al mínimo, lo que resulta en un mayor bienestar de los animales y resultados más reproducibles.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Ellen Ytebrouck por su valiosa información sobre la aplicación del método en ratas. Este trabajo contó con el apoyo del Consejo de Investigación de la KU Leuven (OT09/22) y el Fondo para la Investigación Científica-Flandes (FWO Vlaanderen). Jeroen Aerts cuenta con el apoyo de una beca de doctorado de la Agencia para la Innovación a través de la Ciencia y la Tecnología de Flandes (IWT Vlaanderen) y Julie Nys con una beca de doctorado de FWO Flandes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Clorhidrato de ketamina (Anesketin)Dechra Veterinary Products (Eurovet)BE-V136516
Clorhidrato de medetomidina (Domitor)Orion Corporation (Janssen Animal Health)BE-V151742
Clorhidrato de Atipamezol (Antisedan)Orion Corporation (Elanco Animal Health)BE-V153352
Antibióticos (cefazolina, Kefzol)Eurocept Productos farmacéuticosBE 106267
Pomada para los ojos (Fucithalmic)Leo Pharma nv-saBE 144654
Moria MC31 Pinzas - Dentadas CurvasFine Science Tools11370-31Para aplicación en el ratón. Se puede utilizar cualquier pinza de dimensiones similares siempre que la punta esté curvada y dentada.
Pinzas de patrón estrecho - curvadasFine Science Tools11003-13Para aplicación en ratas. Se puede utilizar cualquier pinza de dimensiones similares siempre que la punta esté curvada y dentada.
Algodón hemostáticoQualipharN/A Otrosagentes hemostáticos son igualmente adecuados (p. ej., Viscostat, #649, Ultradent Products)

Referencias

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