Síntesis in vitro de ARNm modificado para la inducción de la expresión proteica en las células humanas

Resumen

En este artículo de vídeo, se describe la síntesis in vitro del ARNm modificado para la inducción de la expresión de proteínas en las células.

Resumen

El suministro exógeno de codificación de ARN mensajero sintético (ARNm) para la inducción de la síntesis de proteínas en las células deseadas tiene un enorme potencial en los campos de la medicina regenerativa, la biología celular básica, el tratamiento de las enfermedades, y la reprogramación de las células. Aquí, se describe un paso a paso para la generación de protocolo de ARNm modificado con un reducido potencial de activación inmune y una mayor estabilidad, control de calidad de ARNm producido, la transfección de células con el ARNm y la verificación de la expresión de la proteína inducida por citometría de flujo. Hasta 3 días después de una sola transfección con eGFP ARNm, las células HEK293 transfectadas producen eGFP. En este artículo de vídeo, la síntesis de mRNA eGFP se describe como un ejemplo. Sin embargo, el procedimiento se puede aplicar para la producción de otros ARNm deseadas. Usando el ARNm sintético modificado, las células pueden ser inducidas a expresar transitoriamente las proteínas deseadas, que normalmente no expresarían.

Introducción

En las células, la transcripción de ARN mensajero (ARNm) y la siguiente traducción del ARNm en proteínas deseadas garantizar el correcto funcionamiento de las células. Trastornos genéticos hereditarios o adquiridos pueden conducir a la síntesis insuficiente y disfuncional de las proteínas y causar enfermedades graves. Por lo tanto, un nuevo enfoque terapéutico para inducir la producción de proteínas que faltan o defectuosos es la entrega exógena de sintético modificado ARNm en las células, que codifica la proteína deseada. De esta manera, las células se activan para sintetizar proteínas funcionales, que normalmente no pueden producir o, naturalmente, no necesitar. Usando este enfoque, trastornos genéticos pueden ser corregidos mediante la introducción de ARNm que codifica para la proteína defectuosa o faltante ^1. La terapia de mRNA también se puede utilizar para la vacunación de sintetizar los antígenos de proteínas, que se expresan por las células tumorales o patógenos. De esta manera, el sistema inmune del huésped puede ser activado para eliminar eficazmente las células tumorales o prevenir infecciones ^2,3. Además, en los últimos años, el ARNm se utilizó con éxito para generar células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Para este propósito, los fibroblastos fueron transfectadas con ARNm para inducir la expresión de factores de reprogramación ^4-6 y convertirlos en CMPI con un enorme potencial en medicina regenerativa.

Anteriormente, el uso de ARNm convencional se asoció con una baja estabilidad y fuerte inmunogenicidad. Por lo tanto, las aplicaciones clínicas de los ARNm convencionales eran limitadas. Sin embargo, la sustitución de citidina y uridina por 5-metilcitidina y pseudouridine dentro de la molécula de ARNm por Kariko y sus colegas rindió moléculas de ARNm estables en fluidos biológicos y redujo drásticamente la activación inmune ^7-10, que ahora permite la aplicabilidad clínica de mRNAs modificados.

Uso de mRNAs modificados producidos sintéticamente, transcripciones de genes deseados se pueden entregar temporalmente en vivo ¹¹o in vitro para inducir la expresión de la proteína. El ARNm introducido se traduce en condiciones fisiológicas por la maquinaria de traducción celular. Debido a la falta de integración en el genoma de la célula huésped en comparación con los vectores de terapia génica viral, el riesgo de oncogénesis se evita ^12,13. Por lo tanto, la terapia usando ARNm sintético modificado va a mejorar la aceptación clínica en el futuro.

Aquí se describe un protocolo detallado para la producción de ARNm modificado (Figura 1), la transfección de células con ARNm y la evaluación de la expresión de la proteína en las células transfectadas.

Protocolo

1. Aumento de plásmidos que contienen ADN que codifica secuencias Obligatorio (CDS)

1. Pre-caliente medio SOC, que se incluye en el kit de transformación, a temperatura ambiente y las placas de agar LB que contenían 100 mg / ml de ampicilina a 37 ° C. Equilibrar el baño de agua a 42 ° C.
2. Descongelar un vial de E. químicamente componente coli en hielo.
3. Añadir 1-5 l del plásmido (10 pg a 100 ng) que contiene los CDS en el vial de E. componente químicamente coli y mezclar suavemente. No mezcle las células por pipeteo. Después de la adición de los plásmidos, mezclar tocando el tubo suavemente.
4. Incubar la mezcla en hielo durante 30 min.
5. Heat-shock del E. coli durante 30 segundos a 42 ° C en un baño de agua sin agitación.
6. Colocar el vial en hielo durante 2 min.
7. Añadir 250 l de medio SOC precalentado a la E. coli y agitar las bacterias horizontalmente a 300 rpm durante 1 hora a 37 ° C en una incubadora de bacterias.
8. Extender 100 l y 150 l de mezcla de transformación sobre placas de agar LB pre-calentado, invertir las placas e incubar durante la noche a 37 ° C.
9. Después de colonias se hacen visibles, inocular una única colonia de cada placa en un tubo de cultivo de 15 ml que contiene 5 ml de medio LB con 100 mg / ml de ampicilina. Incubar durante la noche a 37 ° C con agitación a 300 rpm hasta que la cultura es en el registro tarde o fase estacionaria.
10. Para el almacenamiento a largo plazo de transformado E. coli, pipeta de 75 l de 100% de glicerol en el criovial. Añadir 225 l de cultivo bacteriano (madre congelada contendrá 25% de glicerol), mezclar bien y guardar el criovial a -80 ° C.
11. Aislar los plásmidos que contienen los CDS requeridos usando un kit de purificación de plásmido de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
12. Determinar la concentración de plásmido usando un espectrofotómetro.
13. Preparar alícuotas de 20 l y almacenarlas a -20 ° C durante un tiempo prolongado.

_title "> 2. La amplificación del plásmido inserciones y adición de poli T-cola por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

1. NOTA: Para obtener el molde de ADN para la transcripción in vitro (IVT), los CDS de interés, aquí eGFP, se amplifica mediante PCR. Simultáneamente, se añade una poli-T de la cola de 120 thymidines (T) a la inserción mediante el uso de un cebador inverso con una T ₁₂₀ de extensión. De este modo, los ARNm generados obtener un poli A-cola con una longitud definida después de la IVT.
2. Preparar la mezcla de PCR como se detalla en la Tabla 1.
3. Mezclar la mezcla de reacción a fondo. NOTA: producto de PCR se puede utilizar en reacciones 4-5 IVT. Para aumentar la cantidad de plantilla de ADN para la IVT, el volumen total de la mezcla de PCR puede ser aumentada. Varios tubos de PCR que contienen cada uno 100 l mezcla de PCR se pueden utilizar para obtener un rendimiento suficiente de producto de PCR.
4. Colocar los tubos de PCR en un termociclador y ejecute la PCR utilizando el protocolo de ciclos de PCR (Tabla 2).
5. Limpiar el PCR reacción usando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante y eluir el ADN usando 20 agua libre de nucleasa l.
6. Medir la concentración del ADN usando un espectrofotómetro. NOTA: La concentración de ADN detectado es de aproximadamente 300 mg / ml. Por lo tanto, la cantidad total de la esperada debe ser ~ 6 mg. La cantidad de ADN para otras proteínas puede diferir dependiendo de la longitud de CDS, la cantidad de plásmido utilizado para la PCR, la temperatura de hibridación de los cebadores, y el número de ciclo.
7. Congelar el ADN a -20 ° C durante un período prolongado o utilizarlo directamente para IVT.

Paso 3. Control: Calidad del producto de PCR

1. Compruebe la calidad del producto de PCR mediante electroforesis en gel de ADN.
2. Mezclar la cantidad deseada de agarosa con TBE 1x en un matraz. Para un gel de agarosa al 1%, añadir 0,5 g de agarosa a 50 ml de TBE 1x.
3. Se disuelve de microondas hasta que la agarosa. No deje que hierva. Asegúrese de que la agarosa es completamente en solución.
4. Añadir 5 l nucleico mancha de gel de ácido a 50 ml de gel de agarosa.
5. Vierte el gel en un gel de agarosa al cuadro, establezca el peine, y esperar aproximadamente 1 hora hasta que el gel se solidificó.
6. Retire el peine y colocar el cuadro de gel en una bandeja de gel.
7. Mezcle 2 l (200 ng) de 80-10,000 pb de ADN Global y 200 ng de producto de PCR, cada uno con 2 l de tampón de carga 6x en un volumen total de 12 l.
8. Cargar cuidadosamente muestras de ADN en los pocillos del gel de agarosa.
9. Uso de 1x TBE como tampón, ejecute el gel de agarosa a 100 V durante 1 hr.
10. Visualice las bandas de ADN en un sistema de imagen (Figura 2).

4. Transcripción in vitro (IVT)

1. NOTA: Después de la PCR, los insertos de plásmidos se amplifican y se añade un poli T-cola. Durante la IVT, la información genética se transcribe a partir de ADN a ARN. El transcrito de ARNm generado se utiliza para producir proteínas en las células.
2. Limpie la zona de trabajo y pipetas con una RNasa dsolución econtamination. El uso de PCR puntas de pipeta de doble filtro limpio y estéril y con frecuencia cambian los guantes para minimizar la contaminación de reacción se mezcla con RNasas.
3. Preparar la mezcla analógica NTP / tapa como se describe en la Tabla 3.
4. Mezclar la mezcla analógica NTP / tapa a fondo por agitación y centrifugar brevemente.
5. Montar la mezcla de reacción IVT como se describe en la Tabla 4.
6. Mezclar la mezcla de reacción IVT fondo pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. A continuación, centrifugar el tubo de PCR brevemente para recoger la mezcla en la parte inferior del tubo.
7. Se incuba a 37 ° C durante 3 horas en un termomezclador.
   NOTA: El tiempo óptimo de incubación depende de la longitud de los insertos y la eficiencia transcripcional de plantilla dada. Para insertos cortos (<500 nt), un tiempo de incubación más largo puede ser ventajoso. Un experimento de curso temporal se puede hacer para determinar el tiempo de incubación óptimo para el rendimiento máximo. Por lo tanto, establecer reacciones IVT, para example, para 1, 2, 3, 4, 6 hr, y la incubación durante la noche y determinar la cantidad de ARNm. La cinética de la transcripción in vitro para la generación de eGFP ARNm se muestran en la Figura 3.
8. Para retirar la plantilla de ADN, añadir 1 l de DNasa (2 U / l) a la mezcla de reacción IVT, mezclar bien e incubar 15 min a 37 ° C.
9. Se purifica la mezcla de reacción usando un kit de purificación de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Eluir el ARNm modificado a partir de la membrana de la columna de centrifugado dos veces con 40 agua libre de nucleasa l. NOTA: La concentración de ARN detectado es de aproximadamente 1.500 g / ml. Por lo tanto, la cantidad total de la esperada debe ser ~ 120 g. La cantidad de mRNA sintetizado para otras proteínas puede diferir dependiendo de la longitud de CDS y la cantidad de producto de PCR utilizado para IVT.

5. Tratamiento de ARNm purificado con Antártico fosfatasa

1. NOTA: El ARNm generado se trató con fosfatasa para eliminar 5 'trifosfatos, que pueden ser reconocidos por RIG-I y conducen a la activación inmune. Además, el tratamiento con fosfatasa previene la re-circularización en una reacción de auto-ligación.
2. Añadir 9 l de 10x tampón de reacción de la fosfatasa antártica a 79 l de solución de ARNm purificado. Posteriormente, añadir 2 l de fosfatasa Antártico (5 U / l) y mezclar suavemente la muestra. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 30 min.
3. Se purifica la mezcla de reacción usando un kit de purificación de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Eluir el ARNm modificado a partir de la membrana de la columna de centrifugación dos veces con 50 agua libre de nucleasa l.
4. Medir la concentración de los ARNm modificados utilizando un espectrofotómetro. Compruebe que la relación de absorbancia a 260 nm / 280 nm (A ₂₆₀ / A ₂₈₀₎ es ≥ 1,8 y la relación de A ₂₆₀ / A ₂₃₀ es de 2,0, lo que indica la pureza.
   NOTA: El rendimiento total esperado debería ser de aproximadamente 90 mg, que es sufficient durante aproximadamente 36 transfecciones de mRNA.
5. Ajustar la concentración de ARNm a 100 ng / l mediante la adición de agua libre de nucleasa.
6. Alícuota del ARNm modificado en un solo uso alícuotas necesarias para transfecciones y almacenar a -80 ° C. Evite múltiples ciclos de congelación y descongelación. Adecuadamente preparado y almacenado ARNm es estable durante muchos años. Durante trabajar, mantener siempre el ARNm modificado en hielo.

Paso 6. Control: Calidad de mRNA sintetizado Modificado

1. Compruebe la calidad de ARNm modificado por electroforesis en gel de ARN.
2. Mezclar la cantidad deseada de agarosa con TBE 1x en un matraz. Para un gel de agarosa al 1%, añadir 0,5 g de agarosa a 50 ml de TBE 1x.
3. Se disuelve de microondas hasta que la agarosa. No deje que hierva. Asegúrese de que la agarosa es completamente en solución.
4. Añadir 5 l nucleico mancha de gel de ácido a 50 ml de gel de agarosa.
5. Vierte el gel en una caja de gel de agarosa, establezca el peine, y esperar aproximadamente 1 hora hasta que el gel es solidified.
6. Retire el peine y colocar el cuadro de gel en una bandeja de gel.
7. Mezclar 3 l (3 g) de 0,5-10 kb ARN Escalera y 200 ng de mRNA sintetizado modificado cada uno con 7 l de tampón de carga en un volumen total de 10 l. La composición del tampón de carga se describe en la Tabla 5.
8. Desnaturalizar la escalera y las muestras de ARNm a 70 ° C durante 10 min.
9. Coloque con cuidado la escalera y las muestras de ARNm en el gel de agarosa al 1%.
10. Realice la electroforesis a 100 V durante 1 hora usando 1x TBE como tampón de ejecución.
11. Visualice la escalera y bandas de ARNm en un transiluminador UV y una fotografía usando un sistema de documentación de geles (Figura 4).

7. Preparación de las células para la transfección

1. Plate 2 x 10 ⁵ células (células HEK293) por pocillo de placa de 12 pocillos.
2. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C en un incubador de células. NOTA: En el día de la transfección, las células deben tener reacHed 80-90% de confluencia.

8. Realización de mRNA transfección de células

1. Descongelar el ARNm modificado.
2. Generar los lipoplexes para la transfección.
3. Añadir 25 l (2,5 mg) de ARNm modificado y 2 l de reactivo de transfección lípido catiónico a 473 l Opti-MEM (Medio Esencial Mínimo) reduje medio de suero para generar la mezcla de transfección para la transfección de un pocillo de una placa de 12 pocillos. Aumentar la escala de los volúmenes de acuerdo con el número de pozos a ser transfectadas. Como control negativo, se prepara una mezcla de transfección sin ARNm.
4. Mezcle los componentes suavemente con la pipeta. Incubar la mezcla de transfección a temperatura ambiente durante 20 min para generar lipoplexes para la transfección.
   NOTA: La mezcla de transfección no contiene antibióticos. Por lo tanto, tenga cuidado para asegurar la esterilidad durante la manipulación de las células.
5. Lavar las células con 500 l DPBS / pocillo.
6. Añadir 500 l mezcla de transfección a un pocillo de una PLA de 12 pocilloste.
7. Se incuban las células durante 4 horas a 37 ° C y 5% de CO _2.
8. Aspirar la mezcla de transfección y añadir 1 ml de medio de cultivo celular completa a las células.
9. Se incuban las células durante 24 horas en la incubadora de células.
10. Realizar microscópico de fluorescencia analiza utilizando un microscopio de fluorescencia (Figura 5). NOTA: Para examinar la expresión de otras proteínas en las células, que se producen por transfección con otra mRNA de eGFP ARNm que codifica, las células pueden ser cultivadas en cubreobjetos. A continuación, la transfección puede llevarse a cabo y las células se puede teñir con anticuerpos apropiados y se analizó por microscopía de fluorescencia.

9. Análisis de citometría de flujo de EGFP expresión en células

1. Retire medio de cultivo celular de los pocillos y lavar cada pocillo con DPBS 1 ml (sin calcio y magnesio). Añadir 500 l de tripsina / EDTA por pocillo para separar las células de la superficie de placas de cultivo celular. Posteriormente, añadir 500TNS l por pocillo para inactivar la tripsina.
2. Centrifugar las células desprendidas durante 5 min a 300 x g a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante dejando sólo el pellet. Resuspender el sedimento celular en 150 l solución de fijación de células y transferir la suspensión de células en un tubo de citometría de flujo.
3. Analizar el porcentaje de células que expresan eGFP y la intensidad de fluorescencia usando Geo media (media geométrica de intensidad de fluorescencia) (Figura 6).

10. La medición de la expresión de la proteína a través del tiempo

1. Realizar mRNA transfección de células en 3 pocillos de una placa de 12 pocillos como se describe en el paso 8. Además, incubar 3 pocillos de células HEK293 con la mezcla de transfección sin la adición de mRNA.
2. Medir la expresión de eGFP 1, 2, y 3 días después de la transfección para evaluar la duración de la expresión de la proteína (Figura 7).

Resultados

El uso de un plásmido pcDNA 3.3 que contiene los CDS de eGFP, se estableció la síntesis de mRNA eGFP modificado (Figura 1). Después de la amplificación por PCR de inserción y poli T-tizón, una banda clara con una longitud de aproximadamente 1100 pb se detectó (Figura 2). Aumentando el tiempo de IVT aumentada el rendimiento de ARNm (Figura 3). Después de la IVT, se detectó una banda de ARNm claro con una longitud de aproximadamente 1.100 pb, que corresponde a la longitud...

Discusión

La terapia de ARNm tiene un enorme potencial en el campo de la medicina regenerativa, el tratamiento de las enfermedades y la vacunación. En este vídeo, se demuestra la producción de un ARNm modificado estabilizada para la inducción de la expresión de proteínas en las células. El uso de este protocolo, otros ARNm deseadas se pueden generar. La síntesis in vitro de ARNm modificado permite la transfección de células con mRNAs deseados para inducir la expresión de proteínas diana. De este modo, la proteína deseada...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cultivo celular
DMEM, alta glucosa	PAA	E15-009
FBS	Life Technologies	10500
Penicilina/Estreptomicina	PAA	P11-010	100x
L-glutamina	PAA	M11-004	200 mM
DPBS sin calcio y magnesio	PAA	E15-002
0,04% Tripsina / 0,03% EDTA	Promocell	C-41020
TNS	Promocell	C-41120	Solución Neutralizante de Tripsina, Inhibidor de Tripsina al 0.05% en células BSA
HEK-293	ATCC	CRL-1573
Consumibles
Placas de cultivo de tejidos, 12 pocillos	Corning	3512
Matraz de cultivo celular (75 cm2)	Tubos de
	Eppendorf	0030 121.589	Safe-Lock, Biopur
15 ml tubos cónicos	puntas de
PCR limpias y estériles	Eppendorf	10 y micro; l: 022491202; 100 y micro; l: 022491237; 1.000 y micro; l: 022491253
Cryovial	greiner bio-one	122279-128	Cryo.s
Tubo de fondo redondo de polipropileno de 14 ml para cultivo bacteriano	BD Falcon	352059
Plasmid amplificación y purificación
>pcDNA 3.3_eGFP Plásmido	Addgene	26822
One Shot Top10 componente químico Escherichia coli	Invitrogen	C4040-10
Agua estéril (Ampuwa)	Fresenius Kabi	1636071
LB medio (Luria/Miller)	Carl Roth	X968.1	Disolver 25 g L-1 en agua estéril.
Agar LB (Luria/Miller)	Carl Roth	X969.1	Disolver 40 g L-1 en agua estéril.
Ampicilina Solución Preparada Sigma	Aldrich	A5354	100 mg/ml
Glycerol	Sigma Aldrich	G2025
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
mRNA fuerte
HotStar HiFidelity Polymerase Kit	Qiagen	202602
QIAquick PCR Kit de purificación	Qiagen	28106
MEGAscript T7 Kit	Life Technologies	AM1334
5-metilcitidina-5&agudo;-trifosfato	Trilink	N1014	5-metil-CTP
pseudouridina-5&agudo;-trifosfato	Trilink	N1019	Pseudo-UTP
3&agudo;-O-Me-m7G(5´)PPP (5&agudo;)Análogo de la estructura de la tapa de ARN G	New England Biolabs	S1411L
RiboLock Inhibidor de la RNasa	Thermo Scientific	EO0381	40 U/µ l
TURBO DNase	Life Technologies	AM1334	2 U/µ l (de MEGAscript T7 Kit)
Fosfatasa antártica	Nuevo Biolabs	MO289S
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Solución RNaseZap	Life Technologies	AM9780
Transfection
Lipofectamine 2000 Reactivo de Transfección	Invitrogen	11668-019	Reactivo catiónico de transfección de lípidos
Opti-MEM I Medios de suero reducidos	Invitrogen	11058-021	Medio Esencial Mínimo Mejorado (MEM) que permite una reducción de la suplementación con Suero Fetal Bovino (FBS)
electroforesis en gel
Agarosa	Sigma-Aldrich	A9539
Tinción de gel de ácido nucleico gelificado	Biotium	41003	10,000x en agua
peqGOLD Range Mix DNA-Ladder	Peqlab	25-2210
Flow cytometry analyses
CellFIX (1x)	BD Biosciences	340181	10x concentrado
Primer para amplificación de insertos y cola de poli (T) PCR fuerte
hacia adelante (grado HPLC) 10 µ M	Ella Biotech		5&agudo;-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3&agudo;
Imprimación inversa (grado HPLC) 10 y micro; M	Ella Biotech		5&agudo;- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3&agudo;
Equipment
Cell incubadora	Binder		CO2 (5%) y O2 (20%)
Contador de células CASY	Schä Sistema
Banco de trabajo estéril	BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH
Incubadora de bacterias	Espectrofotómetro Incutec
ScanDrop con baño
	Termociclador analítico Jena
PCR	Microcentrífuga Eppendorf Eppendorf
Vortex	peqlab
Thermomixer	Eppendorf
Aparato de gel para electroforesis	de documentación Bio-Rad
Gel	Sistema Bio-Rad
FACScan	BD Biosciences
Microscopio de fluorescencia
	Zeiss