Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático, Aedes albopictus

Summary

Los análisis de RNA-Seq son cada vez más importantes para identificar los fundamentos moleculares de los rasgos adaptativos en organismos no modelo. Aquí, se describe un protocolo para identificar genes expresados diferencialmente entre mosquitos Aedes albopictus en diapausa y no diapausa, desde la cría de mosquitos, hasta la secuenciación de ARN y análisis bioinformáticos de datos de RNA-Seq.

Abstract

La diapausa fotoperiódica es una adaptación importante que permite a los individuos escapar de los duros entornos estacionales a través de una serie de cambios fisiológicos, entre los que destacan la detención del desarrollo y la reducción del metabolismo. El perfil global de expresión génica a través de RNA-Seq puede proporcionar información importante sobre los mecanismos transcripcionales de la diapausa fotoperiódica. El mosquito tigre asiático, Aedes albopictus, es un organismo destacado para el estudio de las bases transcripcionales de la diapausa debido a su facilidad de crianza, diapausa fácilmente inducida y los recursos genómicos disponibles. Este manuscrito presenta un flujo de trabajo experimental general para identificar las diferencias transcripcionales inducidas por diapausa en A. albopictus. Se documentan las técnicas de cría, las condiciones necesarias para inducir el desarrollo de diapausa y no diapausa, los métodos para estimar el porcentaje de diapausa en una población, la extracción de ARN y la evaluación de la integridad de los mosquitos. Un flujo de trabajo para procesar datos de RNA-Seq de los secuenciadores Illumina culmina en una lista de genes expresados diferencialmente. Los resultados representativos demuestran que este protocolo puede ser utilizado para identificar de manera efectiva genes regulados diferencialmente a nivel transcripcional en A. albopictus debido a diferencias fotoperiódicas. Con ajustes modestos, este flujo de trabajo se puede adaptar fácilmente para estudiar las bases transcripcionales de la diapausa u otros rasgos importantes de la historia de vida en otros mosquitos.

Introduction

Los rápidos avances en las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) están proporcionando oportunidades emocionantes para sondear los fundamentos moleculares de una amplia gama de adaptaciones ecológicas genéticamente complejas en una amplia diversidad de organismos no modelo^1–3. Este enfoque es extremadamente poderoso porque establece una base para los estudios de genómica funcional y de poblaciones de organismos con una ecología o historia evolutiva especialmente interesante y/o bien descrita, así como de organismos de interés práctico, como plagas agrícolas y vectores de enfermedades. Por lo tanto, las tecnologías NGS están conduciendo a rápidos avances en los campos de la ecología y tienen el potencial de abordar problemas como la comprensión de las bases mecanicistas de las respuestas biológicas al rápido cambio climático contemporáneo⁴, la propagación de especies invasoras⁵ y las interacciones huésped-patógeno^6,7.

El extraordinario potencial de las tecnologías NGS para abordar cuestiones básicas y aplicadas en ecología y biología evolutiva se debe en parte al hecho de que estos enfoques se pueden aplicar a cualquier organismo a un costo moderado que es factible para la mayoría de los laboratorios de investigación. Además, estos enfoques proporcionan información de todo el genoma sin la necesidad de recursos genéticos a priori, como un chip de microarrays o una secuencia completa del genoma. Sin embargo, para maximizar la productividad de los experimentos de NGS se requiere una cuidadosa consideración del diseño experimental, incluyendo cuestiones como el tiempo de desarrollo y la especificidad tisular del muestreo de ARN. Además, las habilidades técnicas requeridas para analizar las cantidades masivas de datos producidos por estos experimentos, a menudo hasta varios cientos de millones de lecturas de secuencias de ADN, han sido un desafío particular y han limitado la implementación generalizada de los enfoques NGS.

Los recientes estudios de RNA-Seq sobre las bases transcripcionales de la diapausa en el mosquito invasor y médicamente importante Aedes albopictus proporcionan un ejemplo útil de algunos de los protocolos experimentales que se pueden emplear para aplicar con éxito la tecnología NGS para estudiar las bases moleculares de una adaptación ecológica compleja en un organismo no modelo ^8-10. A. albopictus es una especie altamente invasora que es originaria de Asia, pero recientemente ha invadido América del Norte, América del Sur, Europa y África^11,12. Al igual que muchos insectos templados, las poblaciones templadas de A. albopictus sobreviven durante el invierno entrando en un tipo de latencia conocida como diapausa fotoperiódica. En A. albopictus, la exposición de las hembras pupales y adultas a días cortos (otoñales) conduce a la producción de huevos en diapausa en los que se completa el desarrollo embriológico, pero la larva de farato dentro del corion del huevo entra en una detención del desarrollo que hace que el huevo sea refractario al estímulo de eclosión^15-17. Los huevos con diapausa son más resistentes a la desecación^5,18 y contienen más lípidos totales¹⁹ que los huevos sin diapausa. La diapausa fotoperiódica en A. albopictus es, por lo tanto, una plasticidad fenotípica adaptativa controlada por la madre que es esencial para sobrevivir a las duras condiciones del invierno en ambientes templados. A pesar de la importancia ecológica bien entendida de la diapausa fotoperiódica en una amplia gama de insectos^20,21, la base molecular de esta adaptación crucial no está bien caracterizada en ningún insecto²². En organismos como A. albopictus que experimentan una diapausa embrionaria en la etapa larvaria de famarato, sigue siendo un desafío particularmente apremiante comprender cómo la señal fotoperiódica recibida por la madre se transmite a la descendencia y persiste a lo largo del curso del desarrollo embrionario para causar la detención en la etapa larvaria de famarato.

Este protocolo describe la cría de mosquitos, el diseño experimental y los análisis bioinformáticos para los experimentos de NGS (secuenciación del transcriptoma) realizados para dilucidar los componentes transcripcionales de la diapausa fotoperiódica en A. albopictus. Este protocolo se puede utilizar para estudios adicionales de diapausa en A. albopictus, se puede adaptar para investigar la diapausa en otras especies estrechamente relacionadas, como otros mosquitos aedine que experimentan diapausa en huevos²³, y también es más relevante en general para emplear enfoques de NGS para estudiar las bases transcripcionales de cualquier adaptación compleja en cualquier insecto.

Protocol

1. cría de larvas de dos A. albopictus Grupos a la edad adulta

1. Establecer dos gabinetes de fotoperiodo con iluminación programable a 21 ° C para la expresión óptima diapausa ¹⁶ y una humedad relativa del 80% aproximadamente.
   1. Programa de un gabinete para un 16L: 8D luz: oscuridad ciclo (un no-diapausa inducir fotoperíodo LD). Establezca el segundo armario para un 8L: 16D luz: oscuridad ciclo (diapausa inducir) ^13.
   2. 'Luces' programa al mismo tiempo en ambos gabinetes para sincronizar el tiempo circadiano entre fotoperíodos.
2. Calcular la cantidad de huevos necesarios para llevar a cabo el experimento. Trate de 300-500 huevos por jaula. Al menos tres jaulas replicar diapausa y tres replicados se necesitan jaulas no diapausa para la generación de ARN. Esto asciende a aproximadamente 1,800-3,000 huevos por experimento.
   1. Hatch los huevos sumergiendo papeles de huevo en aproximadamente 500 ml de _H2O desionizada
   2. Añadir ca. 1 ml suspensión alimentos consistentes en comida para perros suelo y artemia lo descrito previamente ^24. Cubra recipiente con malla, y mantener la malla en su lugar con una banda elástica.
   3. Coloque en el gabinete fotoperíodo LD durante aproximadamente 24 horas.
3. Larvas nacidas de transferencia a 10 x 10 x 2 cm Petri platos llenos de ca. 90 ml de agua desionizada H ₂ O.
   1. Mantener ca. 30 larvas por plato. Traslado larvas para limpiar platos cada 48-72 horas, por ejemplo, todos los lunes, miércoles y viernes (MWF) ^24.
   2. RSS aproximadamente 1 ml suspensión alimentos consistentes en comida para perros suelo y artemia en agua desionizada cada MWF lo descrito previamente ^24.
4. Configure tres y cincuenta y siete jaulas para adultos para cada tratamiento fotoperíodo, donde cada jaula comprende una biológica replicar.
   1. Desde los lados opuestos de 9,5 L cubos, cortar un agujero de 10 cm por 14, y otro agujero con 15 cm de diámetro. CoVer la primera con malla. Cortar aproximadamente una longitud de pie de una media ortopédica, y la cola de un extremo alrededor del interior de el otro agujero.
   2. Cortar la parte de los pies de la media apagado y cierre nudo - abierto sólo cuando se necesita acceso al interior de la jaula. Para la tapa de la jaula, cortar todo el interior, dejando sólo la llanta, y sustituir el plástico interior con malla ^24.
   3. Tenga en cuenta el fotoperiodo, replicar número, jaula fecha de inicio, y otra información relevante para el experimento con un marcador permanente en el lado de la jaula.
5. Cubra el fondo de las jaulas adultos con papel de filtro húmedo. Humedezca el papel de filtro con suficiente desionizada H ₂ O para aumentar la humedad local en la jaula, pero evitar el agua estancada, que puede estimular la oviposición en el papel de filtro ^24. Compruebe el filtro de papel diario para el secado, re-húmedo cuando sea necesario.
6. Para producir los huevos suficientes para una biblioteca de ARN, incluir al menos 100 mujeres / 9.5 L cage, con no más de 500 mosquitos por jaula.
7. Recoger MWF pupas y colocar en una pequeña taza de H ₂ O limpia a una densidad de no más de 50 pupas por 25 ml de H ₂ O. Transferir la taza pupas a una jaula de adulto. Coloque las jaulas en el gabinete fotoperíodo respectiva - A. albopictus pupas son fotosensibles ^15.
8. Asegúrese de que todos los días H ₂ O en vasos es limpia y clara, y quitar pupas muertas, porque la acumulación de pupas muertas puede causar una mortalidad masiva. Retire H ₂ O copas después de todas las pupas emergen.
9. Coloque las pasas orgánicas en la malla superior de la jaula para proporcionar azúcar para adultos surgido. Monitorear las pasas, y cambiarlos cada 3-5 días para evitar la acumulación de moho.

2. Mantenimiento de adultos para permitir el acoplamiento y la producción de huevos

1. Mantener jaulas en humedad alta (aprox. 80%) por el forro del fondo de la jaula con un papel de filtro húmedo, y proporcionar acceso a las pasas no moho, como se describió anteriormente (SECTIons 1.5 y 1.9).

3. alimentan de sangre

1. Prepárese para las mujeres de sangre de alimentación entre dos y seis días después de la eclosión de asegurar que las mujeres han estado expuestos a por lo menos ocho días cortos inequívocos antes de la oviposición comienza por casi 100 huevos% diapausa ^14.
2. Preparar el sistema de alimentación Hemotek membrana. Conecte las unidades de alimentación en la fuente de alimentación. Ajuste la temperatura de cada unidad a 37 ° C con el tornillo de ajuste. Utilice un termómetro electrónico y la sonda para medir la temperatura de la unidad de alimentación durante la calibración.
3. Preparar el depósito de comida. Estire un cuadrado de membrana de colágeno de alimentación sobre la abertura del depósito de comida y seguro que con una junta tórica. Tire con cuidado las esquinas para eliminar las arrugas; recortar el exceso de membrana con unas tijeras.
   NOTA: membrana de colágeno puede no funciona bien para todas las especies de mosquitos, y puede ser necesario probar varios tipos de encontrar la membrana óptimo si se trabaja con unespecies distintas de A. albopictus. Parafilm funciona bien con Culex pipiens.
   1. Si la sangre se almacena congelada, descongelar a temperatura ambiente durante al menos 1 hora antes de usar.
   2. Mantenga el depósito por lo que la membrana se encuentra hacia abajo, y las bocas de llenado no compatibles estén mirando hacia arriba. Usar una pipeta de transferencia o una jeringa para llenar el depósito con aproximadamente 3 ml de sangre total de los pollos que tiene citrato de sodio como un anti-coagulante. Selle los puertos de llenado con tapones de plástico.
4. Coloque el depósito preparado para el alimentador atornillándolo en el perno en la placa de transferencia de calor en la parte inferior del alimentador. Invierta el alimentador y colóquelo en la parte superior de la jaula, lado de la membrana hacia abajo, de modo que los mosquitos pueden alimentar a través de la malla de la jaula. Mantenga el alimentador en la jaula por aproximadamente 45 minutos para maximizar la alimentación.

4. Estimular la oviposición

1. De cuatro a cinco días después de la harina de sangre, equipar a cada jaula con un color oscuro 50 ml chasta forrada con papel sin blanquear germinación de la semilla (papel huevo) o una toalla no blanqueada con textura de papel y llenar hasta la mitad con agua desionizada ^9. Si hay más de 250 mosquitos están en una jaula, utilizar dos tazas.
   NOTA: Para pequeñas jaulas o viales de una sola mujer ", la infusión de heno" en recipientes de oviposición puede aumentar la oviposición debido al olor de la flora microbiana ^25.

5. Recoja y tienda Huevos

1. Comenzar la recolección de huevos dentro de 4-5 días de alimentación de la sangre debido a la producción de huevos normalmente alcanza su máximo aproximadamente cinco días después de la alimentación de sangre, y luego desaparece durante la próxima semana.
2. Varíe la frecuencia de recolección de huevos en las necesidades del experimento. Para propósitos generales, recoger los papeles de huevo en un horario de MWF. Retire los papeles de huevo de cada jaula y sustituir por papel nuevo. Coloque los documentos retirados recientemente en placas de Petri y se guardan en el gabinete fotoperíodo SD para evitar los efectos de confusión de almacenamiento de los huevos.
3. Permitir que los papeles de huevo para re principal húmedo durante 2 días después de la oviposición para permitir la formación de la cutícula serosa, lo que aumenta la resistencia a la desecación de huevo ^26.
4. Colección de post Aproximadamente 48 h, huevos secos en aire libre. Secar el papel de manera que es floja y ligeramente húmedo al tacto, pero no tan húmedo que el papel esté oscuro de H ₂ O o estimula la eclosión de los huevos.
   NOTA: A 6,5 papel "x 4" puede tardar aproximadamente 3,5 horas para secar. Tenga cuidado de no sobre-seca papeles de huevo, ya que esto dará lugar a la desecación de huevo ^27.
5. Reserva huevos adicionales tanto LD y SD fotoperiodos para evaluar la incidencia de la diapausa e interpretar el efecto fotoperiódico (ver Medición de diapausa, Sección 6).
6. Para el almacenamiento a largo plazo, mantener los papeles de huevo a 21 ° C y aproximadamente el 80% de humedad en placas de Petri. Mantenga placas de Petri en un contenedor de almacenamiento Tupperware con un frasco de agua para mantener la humedad local como el desarrollo embrionario toma de cuatro a cinco días a 21 ° C.

ove_title "> 6. Mida diapausa Incidencia

1. Utilice embriones reservados adicionales (ver Estimular oviposición, Sección 4) que son 7-20 días para cuantificar la respuesta diapausa.
2. Anote el número de huevos presentes en cada papel huevo.
3. Estimular los huevos para incubar sumergiendo completamente papeles individuales de los huevos en un plato de 90 ml Petri con aproximadamente 80 ml ​​de _H2O desionizada Añadir aproximadamente 0,25 ml de suspensión de alimentos.
4. Después de 24 horas contabilizar el número de tramado larvas de primer estadio. Coloque la placa de Petri sobre una superficie de color negro para visualizar larvas y colocar una fuente de luz en un lado del plato. Las larvas se alejará de la fuente de luz, lo que permite un recuento claro de larvas individual. Retire larvas individuales con una pipeta mientras cuenta para evitar el recuento de larvas individuales.
5. Papeles Place de huevo en una nueva placa de Petri y re-seco. Re-huevos eclosionan después de aproximadamente 1 semana y de nuevo coinciden huevos eclosionados utilizando el método anterior.
6. Papeles Place de huevo con la u restante huevos eclosionados-n en nuevas placas de Petri de 90 ml con solución de blanqueo de aproximadamente 80 ml ^​​28. Asegúrese de que los documentos de huevo están completamente sumergidos en la solución de blanqueo y dejan toda la noche bajo una campana de humos para evitar el olor a lejía.
   NOTA: La decoloración de la solución se puede almacenar durante ~ 1 semana a 4 ° C, pero por lo demás debe ser recién hecho.
7. Inspeccione los huevos utilizando un microscopio de luz como el blanqueo, se borrará el corion y permitir la visualización de huevos embrionados, un-sombreada. Si se embrionados el huevo, el huevo tendrá un color blanquecino con los ojos que aparecen como dos pequeños puntos negros frente a la otra en el lado dorsal. Cuente el número de un-sombreada, huevos embrionados ^13.
8. Determinar la incidencia diapausa con la siguiente fórmula:% diapausa = no. huevos eclosionados-un embrionados / (no. huevos eclosionados + no. huevos embrionados de un-sombreada) x 100 ^13.

7. Extracción de ARN a partir de huevos / larvas pharate

ontenido "> NOTA: El uso Trizol en una campana de flujo laminar.

1. Huevos de mosquito cepillo contienen embriones en desarrollo o larvas pharate en puntos de tiempo de desarrollo distintos de los papeles de huevo para amoladoras de vidrio utilizando un cepillo de pelo de camello. Moler los huevos en Trizol (1 ml por 50 a 100 mg de tejido) hasta que esté completamente pulverizado. Utilice al menos 400 huevos por la biblioteca para producir suficiente ARN.
   1. Alternativamente, snap huevos de congelación en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C en tubos de microcentrífuga durante un máximo de un mes antes de la molienda en Trizol.
2. Realizar la extracción de ARN en Trizol seguido por precipitación con isopropanol de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
3. Tratar el banco con solución de RNasa descontaminación o otros agentes para eliminar las nucleasas residuales para evitar la degradación del ARN.
   1. Tratar el ARN extraído con DNasa. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, incubar las muestras de ARN con ADNasa durante 30 min a 37 ° C. Utilice 1 y #181; l DNasa para un máximo de 10 g de ARN en una reacción de 50 l. Aumentar la cantidad de DNasa si hay más de 10 g de ARN en una reacción.
   2. Inactivar la DNasa añadiendo 5 l de reactivo de inactivación DNasa suspendido. Incubar 5 min a temperatura ambiente, la mezcla tres veces durante el período de incubación (vórtex suave).
   3. Centrifugar a 10000 xg durante 1,5 min. Transferir el sobrenadante que contiene las muestras de ARN tratados a tubos nuevos para los pasos posteriores.
4. Evaluar la calidad de las muestras de ARN total por fluorometría. Enviar las muestras a un centro especializado con el instrumento adecuado para esta tarea. La instalación llevará a cabo la electroforesis en gel en el chip para determinar los tamaños de las especies de ARN en la muestra, visualizadas por tinción fluorescente inculcado en el chip. Los resultados se devuelven como un electroferograma.
   1. Determinar la integridad de las muestras de ARN total por la presencia o ausencia de productos de degradación, como se evidencia por la presencia of picos entre los 18S y 5S picos de ARN ribosómico en el electroferograma resultante (Figura 1B).

8. RNA Secuenciación

1. Enviar muestras de ARN total con una calidad suficientemente alta (Figura 1A) y cantidad (por lo general> 3 g por biblioteca) a un centro de secuenciación comercial para la construcción de bibliotecas de ARNm enriquecido de gama emparejado y la secuencia de ARNm, siguiendo protocolos estándar.
2. Si más de un carril se utiliza para la secuenciación de un solo experimento, dividir bibliotecas individuales en dos carriles para la secuenciación para dar cuenta de la variación técnica entre los carriles durante la secuenciación.

9. lllumina Leer Limpieza

NOTA: La Figura 2 resume la parte de bioinformática de este protocolo. Para obtener una lista completa de todos los programas y los recursos utilizados en la sección de bioinformática de este protocolo, consulte la Tabla 1. EnAdemás, Archivo suplementario 1 contiene ejemplos de línea de comandos para cada uno de los siguientes pasos del protocolo de bioinformática.

1. Utilice SSAHA2 ²⁹ (Tabla 1) para identificar coincidencias de 95% de identidad o superior a la base de datos NCBI UniVec Core (Tabla 1), A. secuencia albopictus rRNA (GenBank # L22060.1), y adaptadores de secuenciación (ejemplos detallados de línea de comandos proporcionados en Archivo Suplementario 1). Retire pares de lectura con partidos que utilizan Perl o herramienta de scripts similares, por ejemplo, adaptando el guión Perl proporcionado (Archivo Suplementario 2).
2. Clean restante lee con el paquete SolexaQA ³⁰ (Tabla 1; Suplementario Archivo 1): recorte de regiones con un phred equivalente puntuación de menos de 20 utilizando la configuración predeterminada de DynamicTrim.pl.
   1. Retire lee más corto que 25 pb con LengthSort.pl tanto en avance y retroceso lee simultáneamente. Evaluar la calidad de los archivos limpiados FASTQ con FastQC (Tabla 1 ) - en particular, verificar que la secuencia de calidad per-base y las puntuaciones de calidad por la secuencia están por encima de 20.

10. Normalización digital

1. Realice una ronda de normalización digital en el limpiado lee usando la herramienta khmer ³¹ (Tabla 1; Suplementario Archivo 1), específicamente normalize-by-median.py (usando tamaño k-mer 20, una cobertura de corte de 20, y x = 1e10).
2. Alternativamente, si una máquina con alta memoria RAM es disponibles (cientos de GB), utilice guión normalize_by_kmer_coverage.pl de Trinidad (Tabla 1).

11. De Novo Asamblea Transcriptome

1. Obtener acceso a un clúster de ordenador o computadora con hasta 256 GB de RAM y 24 CPUs, dependiendo del tamaño del conjunto.
2. Utilice Trinidad ³² (Tabla 1; File Suplementaria 1) para montar la lectura digital normalizado establecido en contigs. Para reduciruso de la memoria, utilice --min_kmer_cov 2.

Evaluación Asamblea 12.

1. Ejecute assemblathon_stats.pl del proyecto Assemblathon2 ³³ en la salida contig Trinidad. Este script realiza cálculos básicos relevantes para la evaluación de la calidad de montaje, como el número de andamios, N50, composición de montaje, y más (Tabla 1; Archivo Suplementario 1).

13. Anotación del transcriptoma Montado

1. Realizar Blastx (Tabla 1) del conjunto frente a un conjunto de proteínas de referencia; para los mosquitos, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens, y Aedes aegypti son las referencias adecuadas. En concreto, formatee el archivo fasta proteína de referencia para la explosión, seguida de blastx (Archivo Suplementario 1).

14. Mapa lee a la Asamblea Usando RSEM ³⁴ (Tabla 1)

1. Crear un archivo de 'transcripción de genes de ruta », en la que elprimera columna contiene los identificadores de genes de referencia, y la segunda columna los IDs contig. En un editor de hoja de cálculo, intercambiar las primera y segunda columnas de la salida Blastx, y escribir estas columnas en un archivo .txt. Utilice el programa LineBreak para convertir los saltos de línea en el archivo .txt resultante a formato Unix.
2. Crear un conjunto de datos de referencia a partir del archivo fasta transcriptoma mediante el script rsem-preparar-referencia, incluida en el envase RSEM (Archivo Suplementario 1).
3. Calcular los valores de expresión por separado para cada biblioteca con el comando rsem a calcular la expresión personal, incluida en el envase RSEM (Archivo Suplementario 1). Como lee, utilizar los archivos emparejados FASTQ resultantes de la etapa de limpieza de lectura (paso 9.2).
   1. Si ARN a partir de una réplica biológica se dividió en dos carriles para la secuenciación, incluir ambos archivos FASTQ en el cálculo de la expresión para generar un único archivo.
4. Convertir los resultados de la expresión de cada biblioteca a una matriz fácilmente procesada por otra programas mediante el script rsem-generar-data-matriz proporcionada, incluida en el envase RSEM (Archivo Suplementario 1).

15. Análisis de la expresión diferencial

1. Instale R y bordeadora (Tabla 1).
2. Utilice read.delim para cargar los resultados RSEM de paso 14.3 (Archivo Suplementario 1). Si es necesario, completar los recuentos al entero más cercano.
   NOTA: La guía bordeadora recomienda limitar el conjunto de datos de genes con alta expresión suficiente para detectar significado.
3. Para dar formato a los datos para bordeadora, generar un objeto DGEList del archivo de datos cargado (Archivo Suplementario 1). Entonces, normalizar los datos mediante TMM normalización (Archivo Suplementario 1). Estimar las dispersiones comunes y tagwise de los datos (archivos Suplementario 1).
4. Identificar los genes expresados ​​diferencialmente con un Benjamini-Hochberg corregido valor de p <0,05 (Archivo Suplementario 1). Trazar la distribución de log-pliegue de cambio frente a la abundancia (Archivo Suplementario 1).

Results

Fluorometría de dos muestras de ARN representativos mostró dos bandas a aproximadamente 2000 nt (Figura 1A, B). El 28S ribosomal RNA de insectos se compone de dos cadenas de polinucleótidos se mantienen unidos por enlaces de hidrógeno, que son fácilmente interrumpido por calentamiento o agentes que interrumpen los enlaces de hidrógeno ³⁵ breve. Los dos componentes resultantes son aproximadamente el mismo tamaño que el ARN ribosomal 18S. La segunda muestra de ARN mostró altos niveles de degrad...

Discussion

Este protocolo se presentan métodos para descubrir los genes expresados ​​diferencialmente debido a fotoperiódicas diapausa inducida en A. albopictus. El protocolo es importante porque combina de forma única cría de mosquitos y técnicas de bioinformática para hacer todos los aspectos experimentales de un programa de fisiología molecular accesible para los usuarios novatos - en particular para los que se centran en la respuesta diapausa photoperiodic. Los métodos existentes, hasta donde sabemos, no proporcionan ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubadora - Modelo 818	Thermo-Scientific	3751	120 V
Sala de ambiente controlado	Thermax Scientific	N/A	Sala de ambiente controlado construida según especificaciones personalizadas por Thermax Scientific Products. Una alternativa más grande a una incubadora. http://thermmax.com/
Cool Bombilla fluorescente	Philips	392183	4 W
Placa de Petri 100 mm x 20 mm	Fisher	08-772-E
Papel de filtro 20,5 cm	Fisher	09-803-6J
Cubo de 9,5 L Plastican		Bway Productos	http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Tela-Mosquitera blanca	Joann	10173292	http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Medias ortopédicas	Albahealth	23650-040	N.º de producto 081420
Pasas orgánicas	Newman's Own	UPC: 884284040255
Copas de oviposición (marrón)	Fisher Scientific	03-007-52	El producto es en realidad una botella ámbar de 125 ml de la que vimos la tapa.
Toallas de papel recicladas	séptima generación	30BPT120
Modular Mates Square Tupperware Set	Tupperware		http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Molinillo de vidrio	Corning Incorporated	7727-2	Estos molinillos de papel tisú Tenbroeck rompen los huevos y liberan ARN en el reactivo TRI.
Reactivo TRI	Sigma Aldrich	T9424	Aplicar 1 ml de Reactivo TRI por cada 50-100 mg de tejido. Precaución — Este reactivo es tóxico.
TURBO Libre de ADN	Ambion/Life Technologies	AM1907	Este kit genera un mayor rendimiento que el tratamiento tradicional con DNasa seguido de limpieza con fenol/cloroformo, y es más fácil de usar.
RNaseZap	Ambion/Life Technologies	AM9782	Aplicar generosamente sobre las superficies del banco y cualquier equipo que pueda estar en contacto con las muestras de ARN. La solución es ligeramente alcalina/corrosiva, puede causar irritación y es dañina cuando se ingiere.
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA	Coloque hasta 12 muestras de ARN en un chip.
Alimentador de membrana Hemotek	Hemotek	5W1	Este sistema proporciona 5 estaciones de alimentación que se pueden utilizar simultáneamente. Incluye unidad de alimentación PS5 y cable de alimentación; 5 alimentadores FUI + depósitos de harina y juntas tóricas; Tapones de plástico, membrana de alimentación de colágeno Hemotek; Herramienta de ajuste de temperatura; y Herramienta de extracción de tapones. La dirección postal de la empresa es: Hemotek Ltd; Unidad 5 Tribunal de la Unión; Alan Ramsbottom Way; Gran Harwood; Lancashire, Reino Unido; BB6 7FD; Tel: +44 1254 889 307.
Termómetro digital y sonda	Hemotek	MT3KFU	Termómetro MicroT3 y sonda KFU. Se utiliza para ajustar la temperatura de cada unidad de alimentación FU
Sangre entera de pollo, no estéril con citrato de sodio	Pel-Freez Biologicals	33130-1	Los 500 ml de sangre se congelaron y almacenaron en alícuotas de 20 ml a -80 ° C hasta por 1 año. Descongele la sangre a temperatura ambiente durante al menos 1 hora antes de usarla.