La glándula lagrimal (LG) es un órgano de ramificación que produce los componentes acuosos de lágrimas necesarias para el mantenimiento de la visión y la salud ocular. Aquí describimos murino LG disección y ex vivo las técnicas de cultivo de descifrar las vías de señalización implicadas en el desarrollo de LG.
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Artículo de método
La manipulación de la murino Glándula Lagrimal
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Resumen
Resumen
La glándula lagrimal (LG) segrega lágrimas acuosas necesarias para mantener la estructura y la función de la córnea, un tejido transparente esencial para la visión. En el ser humano una sola LG reside en la órbita sobre el extremo lateral de cada ojo la entrega de lágrimas a la superficie ocular a través de 3 - 5 conductos. El ratón tiene tres pares de glándulas oculares, el más estudiado de los cuales es la glándula lagrimal exorbital (LG) situado anterior y ventral de la oreja. Similar a otros órganos glandulares, el LG desarrolla a través del proceso de morfogénesis epitelial de ramificación en el que un solo brote epitelial dentro de un mesénquima condensado se somete a múltiples rondas de brote y la formación del conducto para formar una red interconectada intrincada de los acinos y conductos de secreción. Este elaborado proceso ha sido bien documentado en muchos otros órganos epiteliales, tales como el páncreas y la glándula salival. Sin embargo, el LG ha sido mucho menos explorada y los mecanismos que controlan la morfogénesis son mal bajoresistido. Tenemos la sospecha de que esta falta de representación como un sistema modelo es una consecuencia de las dificultades relacionadas con la búsqueda, la disección y el cultivo de la LG. Por lo tanto, aquí se describen técnicas de disección de embriones cosecha y post-natal LG y métodos de cultivo ex vivo de los tejidos.
Introducción
La glándula lagrimal (LG) es responsable de la secreción de lágrima acuosa crítica para la agudeza visual y la salud, el mantenimiento y la protección de las células de la superficie ocular. LG resultados disfunción en uno de los trastornos oculares más comunes y debilitantes: acuoso deficiente en seco de Enfermedades de los ojos, que se caracteriza por la irritación ocular, sensibilidad a la luz y la disminución de la visión 1. En el ser humano la LG reside en la órbita por encima del extremo lateral del ojo donde 3 - 5 excretores lágrimas de depósito conductos sobre la superficie ocular. El ratón tiene tres pares de glándulas oculares, el más estudiado de los cuales es la glándula lagrimal (LG) situado anterior y ventral de la oreja (exorbital) con lágrimas que viajan al ojo a través de un solo conducto excretor. Similar a otros órganos glandulares, el LG desarrolla a través del proceso de morfogénesis epitelial de ramificación en el que un solo brote epitelial dentro de un mesénquima condensado se somete a múltiples rondas de brote y la formación del conducto a parasoy una intrincada red interconectada de acinos y conductos de secreción (Figura 1) 2. Durante el desarrollo del epitelio se vasculariza, así como en gran medida inervado por los nervios parasimpáticos del ganglio pterigopalatina y en menor medida por los nervios simpáticos del ganglio cervical superior 3. Las interacciones entre cada uno de estos tipos de células es decir, células neuronales, epiteliales, endoteliales y mesenquimales, son esenciales para la función y el mantenimiento del tejido adulto. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes de coordinación de desarrollo LG y regeneración, así como la forma en guías de comunicación de tipo de células entre estos procesos sigue siendo poco clara.
El advenimiento de las embrionarias ex vivo las técnicas de cultivo ha permitido la identificación de las vías de desarrollo y regenerativos en múltiples órganos de ramificación 4. El cultivo ex vivo da el investigador la capacidad de manipular el órgano (memecánico, genético o químico) bajo condiciones definidas, así como para caracterizar el desarrollo de órganos y las interacciones célula-célula en tiempo real. El LG exorbital del ratón es altamente susceptible a esta técnica y estudios recientes han definido sistemas que regulan su desarrollo 2,5 señalización. Sin embargo, a pesar de la necesidad de comprender las señales moleculares que sustentan el desarrollo de LG y la regeneración, en la actualidad sigue siendo poco estudiada, probablemente debido a las dificultades técnicas para aislar el órgano. En este trabajo se describe cómo aislar y llevar a cabo el cultivo ex vivo de la embrionaria murina LG para definir los programas de desarrollo.
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Protocolo
Todo el trabajo de los animales se realizó en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de California, San Francisco.
1. embrionarias de ratón lagrimal Glándulas (LG): La recolección y Microdisección
- Siguiendo los procedimientos aprobados por los Animales institucionales para comité de ética de la investigación científica, la eutanasia programada embarazadas CD-1 (o transgénicos) las hembras con el aumento de inhalación de CO2, seguido de confirmación por dislocación cervical a los embriones de cosecha en el día embrionario adecuado. Designar el día de la vagina e0 descubrimiento enchufe.
Nota: las glándulas lagrimales (LGS) puede ser cosechada desde el escenario solo brote e14 en adelante. Sin embargo, e16 (5-10 yemas) embriones dan los resultados más consistentes para el cultivo ex vivo. - Esterilizar la ventral lado del ratón usando etanol al 70%. Apriete la piel y hacer una incisión en la línea media con unas tijeras quirúrgicas estériles; cortar a través de la piel y el peritoneo para exponer la cavidad abdominal. Retire los 2 cuernos uterinos cortando a lo largo de la mesometrio en la parte superior de cada cuerno uterino y el lugar en PBS frío (tampón fosfato salino) o medio DMEM F12 suplementado con 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina.
- Con unas pinzas (# 5), eliminar los embriones de las bolsas amnióticas y colocar en una segunda placa de Petri estéril que contiene PBS frío. Tenga cuidado de no tocar los ojos o la zona de la cabeza.
- Coloque embrión en un microscopio de disección con una base de transiluminación. Si el embrión es los pasos 1.5 a 1.7. Si los embriones son> e17, estos pasos pueden ser útiles, pero no son esenciales, por lo tanto, continúe con el paso 1.8.
- Cortar la cabeza del torso justo por debajo de la mandíbula inferior (paso 1, Figura 2) usinga bisturí estéril (# 10 cuchilla). Girar la cabeza de manera que la mandíbula se encuentra ahora en la placa de disección. Utilice pinzas para estabilizar la cabeza y el bisturí para eliminar alrededor de ¼ de la parte dorsal del cerebro (el paso 2, 1 de corte, figura 2) - esto es especialmente importante una vez que el cartílago se endurece alrededor de e15.
- Oriente la cabeza para que el bisturí puede perforar la nariz entre los ojos. Haga un corte a través del centro de la cabeza, de modo que los ojos están puestos en mitades separadas (paso 2, 2º corte, Figura 2).
- El uso de dos # 5 pinzas, tomar la mitad de la cabeza y quite el exceso de tejido (véase el paso 3, Figura 2). Asegúrese de orientar la cabeza por lo que el LG (que se encuentra en la esquina posterior inferior del ojo) no se pierde en este proceso de eliminación. Eliminar el exceso de cerebral, cartílago y tejido nasal circundante y debajo del ojo. Puesto que la glándula es apenas visible en este momento, garantizar el ojo está orientada correctamente después de exceso de tejido eliminación to evitar la pérdida de la ubicación de la LG.
- Agarrar con cuidado la piel de la parte posterior, en la esquina inferior del ojo con las dos pinzas. Quitar la piel tirando cuidadosamente abierta con las pinzas para exponer el LG. Utilice iluminación adicional por encima y por debajo del tejido para ayudar a visualizar el LG.
Nota: El LG, distinguibles por su aparición como un botón en un conducto dentro de un mesénquima condensado más oscuro, debe ser visible en este punto. - Empezar con cuidado para diseccionar el LG y mesénquima asociado (consulte el diagrama e imágenes) de distancia del tejido que rodea el uso de fórceps, teniendo cuidado de no agarrar el LG o su conducto asociado. Una vez que la glándula está libre del tejido circundante, eliminar suavemente toda la glándula agarrando el epitelio que rodea el ojo en la base del conducto de LG. Tenga cuidado para preservar el mesénquima que rodea el epitelio, que se puede observar como un mesénquima condensado en el que los invagina epitelio.
NOTA: Algunos eliminación adicional de tissue (los pequeños fragmentos de hueso, músculo y tejido conectivo) pueden ser necesarias para evitar factores de señalización / crecimiento de los tejidos vecinos. - Para el cultivo, la cosecha 4 - 5 glándulas y mesénquima asociado por placa (GL se colocan inmediatamente después de la disección); recoger un mínimo de 14 ganglios por cada 100 l de tampón de lisis de ARN por RT-PCR 6.
2. Prepare las placas para ex vivo Cultura
Este procedimiento se basa en que la empleada para el desarrollo de la glándula salival 7,8.
- Añadir 200 l de DMEM F12 (suplementado con 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina) medios de cultivo con 50 mg / ml de ácido ascórbico y 50 mg / ml holo-transferrina a un plato de 50 mm de diámetro de micropocillos con fondo de vidrio 7.
Nota: F12 DMEM fue elegido ya que previamente nos pareció que para maximizar la morfogénesis de la glándula salival embrionaria. - Flotador un Polycarb 13 mmfiltro de membrana de 0,1 micras Oñate con poros en la parte superior de los medios de comunicación.
- Paso opcional: Diluir laminina 3-D 1: 1 con DMEM / F12 para hacer una concentración final de 3 mg / ml (200 l utilizar la pipeta para mezclar suavemente; centrifugar durante 1 min si aparecen burbujas). Añadir 15 l de esta diluyeron laminina 3-D para filtrar.
Nota: Esta dilución se encontró que era óptimo para el mantenimiento de la LG en su estado 3D sin comprometer ramificación epitelial. Sin embargo, no es esencial para la cultura de LG. - Coloque 4 - 5 LG en filtro o en laminina. Cultura GL ex vivo por 24 - 48 h (Figura 3) o fijar con PFA al 4% durante 20 min para su posterior análisis por qPCR o inmunotinción (Figura 4). Para el análisis qPCR de tejido glandular embrionario, por favor consulte Rebustini et al., 2011. Para el análisis de inmunofluorescencia de los tejidos glandulares embrionarias por favor consulte las siguientes citas: Hoffman et al, (2002) y Steinberg correo.t al., (2005).
3. Ratón postnatal y adulto lagrimal Glándulas (LG): Disección
- La eutanasia del ratón postnatal de acuerdo a las normas del comité de ética animal apropiado. Para cachorros postnatal día 8 o más jóvenes, la eutanasia por el corte de la cabeza con unas tijeras estériles. Para el día postnatal 8 años o más, rociar la piel con etanol al 70%.
- Para localizar el LG, yacía ratón lateral lado bajo un microscopio de disección con iluminación desde arriba. Nota: El LG postnatal y adulto se limita con la arteria carótida, el músculo masetero y la dermis (ver Figura 5).
- El uso de pequeñas tijeras de disección, hacer pequeña incisión en la epidermis lateralmente desde donde se debe colocar el LG.
- Con unas pinzas, abra la epidermis hacia la oreja para exponer el LG.
- Utilice pinzas para aflojar suavemente LG del tejido circundante.
- Una vez que el LG se libera del tejido circundante, retire con cuidado el LG por el conducto,agarrando donde el conducto y el epitelio que rodea el ojo se conectan (Figura 1).
- Coloque los GL en tampón de lisis de ARN para RT-PCR, o fijar con PFA al 4% durante 20 min para inmunotinción.
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Resultados
El LG desarrolla a través del proceso de la morfogénesis de ramificación epitelial. Imágenes de campo claro de los gobiernos locales de embriones disecados en e14, e15, e16, e17, y P2 ilustran este evento.
Figura 1. El LG desarrolla a través del proceso de morfogénesis de ramificación epitelial. Imágenes de campo claro GL embrion...
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Discusión
La versatilidad de la cultura y manipular el LG ex vivo ofrece ventajas significativas para el estudio de su desarrollo. Esto incluye la velocidad a la cual el investigador es capaz de probar las hipótesis y la multitud de las perturbaciones que se pueden realizar para evaluar cómo epitelial, neuronal, endotelial y células mesencyhmal interactúan para formar el órgano. Sin embargo, hay una serie de advertencias cuando se utiliza este modelo. En primer lugar, en virtud de su aislamiento de la glándula ya no está...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer el financiamiento proporcionado por el Programa de Asignación de Recursos de la UCSF.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 sin HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicilina-Estreptomicina | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albúmina solución de suero bovino | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Solución de paraformaldehído al 16% | 15710 | Ciencias de la microscopía electrónica | diluida al 4% en 1x |
| Solución salina tamponada con fosfato PBS 10x | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Solución salina tamponada con fosfato 1x | Preparado a partir de 10x stock | ||
| holo-Transferrin bovino | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml de solución madre en agua. Congelar las alícuotas de un solo uso a -20 °C. Añadir a los medios DMEM/F12 hasta una concentración final de 50 μ g/ml. |
| Ácido L-ascórbico (Vitamina C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml de solución madre en agua. Congelar las alícuotas de un solo uso a -20 °C. Añadir a los medios DMEM/F12 hasta una concentración final de 50 μ g/ml. |
| placas tratadas con cultivo de tejidos BioLite de 100 mm | 130182 | placas tratadas sin cultivo de tejidos | Thermo Scientific |
| Microscopio estereoscópico con iluminador de subetapa | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Se puede utilizar cualquier microscopio estereoscópico de disección que tenga una base de luz transmitida. |
| Base del iluminador de subetapa para microscopio estereoscópico | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Halcón 35 mm Placas tratadas con cultivo de tejidos | 353001 | Corning | También se pueden utilizar placas no tratadas con cultivo de tejidos. |
| Platos con fondo de vidrio sin recubrimiento de 50 mm | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Microscopio de fluorescencia de campo amplio | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Cualquier microscopio de fluorescencia (microscopio vertical, invertido o de disección estereoscópica) se puede utilizar para controlar la expresión de GFP a bajo aumento con una cámara digital conectada. |
| Microscopio confocal | TCS SP5 | Leica Microsystems | La microscopía confocal es necesaria para ver estructuras celulares detalladas. Se puede utilizar cualquier microscopio confocal. |
| Pinzas microfinas SWISS, #5 (11.2 cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Se requieren puntas finas para eliminar el mesénquima del epitelio. También se pueden utilizar agujas de tungsteno. |
| Pinzas de punta estándar Dumont, #5 (11 cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (EE. UU.), Inc. | Ideal para la recolección de glándulas de embriones. |
| Mangos de cuchillo quirúrgico de plástico reutilizable, estilo n.º 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| estériles de acero inoxidable, n.º 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Kit de aislamiento de ARN total RNAqueous-Micro | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluido 1:1 con DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) Los | Charles River Labs | se recolectan el día 14 (con el día del descubrimiento del tapón designado como día 0). | |
| Membranas hidrofílicas grabadas con huellas de nucleóporos, 0,1 μ m tamaño de poro, 13 mm | 110405 | Whatman | |
| Ratones Pax6-Cre, GFP con embarazo cronometrado | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson | Laboratory Ratones opcionales para aprender a localizar el LG. |
Referencias
- Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Current allergy and asthma reports. 14, 403(2014).
- Makarenkova, H. P., et al. FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development. Development. 127, Cambridge, England. 2563-2572 (2000).
- Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).
- Nigam, S. K. Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs. Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).
- Qu, X., et al. Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development. Development. 139, Cambridge, England. 2730-2739 (2012).
- Rebustini, I. T., et al. MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis. Developmental cell. 17, 482-493 (2009).
- Hoffman, M. P., et al. Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms. Development. 129, 24-5778 (2002).
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