La glándula lagrimal (LG) es un órgano de ramificación que produce los componentes acuosos de lágrimas necesarias para el mantenimiento de la visión y la salud ocular. Aquí describimos murino LG disección y ex vivo las técnicas de cultivo de descifrar las vías de señalización implicadas en el desarrollo de LG.
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Artículo de método
La manipulación de la murino Glándula Lagrimal
En este artículo
Resumen
Resumen
La glándula lagrimal (LG) segrega lágrimas acuosas necesarias para mantener la estructura y la función de la córnea, un tejido transparente esencial para la visión. En el ser humano una sola LG reside en la órbita sobre el extremo lateral de cada ojo la entrega de lágrimas a la superficie ocular a través de 3 - 5 conductos. El ratón tiene tres pares de glándulas oculares, el más estudiado de los cuales es la glándula lagrimal exorbital (LG) situado anterior y ventral de la oreja. Similar a otros órganos glandulares, el LG desarrolla a través del proceso de morfogénesis epitelial de ramificación en el que un solo brote epitelial dentro de un mesénquima condensado se somete a múltiples rondas de brote y la formación del conducto para formar una red interconectada intrincada de los acinos y conductos de secreción. Este elaborado proceso ha sido bien documentado en muchos otros órganos epiteliales, tales como el páncreas y la glándula salival. Sin embargo, el LG ha sido mucho menos explorada y los mecanismos que controlan la morfogénesis son mal bajoresistido. Tenemos la sospecha de que esta falta de representación como un sistema modelo es una consecuencia de las dificultades relacionadas con la búsqueda, la disección y el cultivo de la LG. Por lo tanto, aquí se describen técnicas de disección de embriones cosecha y post-natal LG y métodos de cultivo ex vivo de los tejidos.
Introducción
La glándula lagrimal (LG) es responsable de la secreción de lágrima acuosa crítica para la agudeza visual y la salud, el mantenimiento y la protección de las células de la superficie ocular. LG resultados disfunción en uno de los trastornos oculares más comunes y debilitantes: acuoso deficiente en seco de Enfermedades de los ojos, que se caracteriza por la irritación ocular, sensibilidad a la luz y la disminución de la visión 1. En el ser humano la LG reside en la órbita por encima del extremo lateral del ojo donde 3 - 5 excretores lágrimas de depósito conductos sobre la superficie ocular. El ratón tiene tres pares de glándulas oculares, el más estudiado d....
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Protocolo
Todo el trabajo de los animales se realizó en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de California, San Francisco.
1. embrionarias de ratón lagrimal Glándulas (LG): La recolección y Microdisección
- Siguiendo los procedimientos aprobados por los Animales institucionales para comité de ética de la investigación científica, la eutanasia programada embarazadas CD-1 (o transgénicos) las hembras con el aumento de inhalación de ....
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Resultados
El LG desarrolla a través del proceso de la morfogénesis de ramificación epitelial. Imágenes de campo claro de los gobiernos locales de embriones disecados en e14, e15, e16, e17, y P2 ilustran este evento.
Figura 1. El LG desarrolla a través del proceso de morfogénesis de ramificación epitelial. Imágenes de campo claro GL embrion.......
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Discusión
La versatilidad de la cultura y manipular el LG ex vivo ofrece ventajas significativas para el estudio de su desarrollo. Esto incluye la velocidad a la cual el investigador es capaz de probar las hipótesis y la multitud de las perturbaciones que se pueden realizar para evaluar cómo epitelial, neuronal, endotelial y células mesencyhmal interactúan para formar el órgano. Sin embargo, hay una serie de advertencias cuando se utiliza este modelo. En primer lugar, en virtud de su aislamiento de la glándula ya no está.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer el financiamiento proporcionado por el Programa de Asignación de Recursos de la UCSF.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 sin HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicilina-Estreptomicina | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albúmina solución de suero bovino | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Solución de paraformaldehído al 16% | 15710 | Ciencias de la microscopía electrónica | diluida al 4% en 1x |
| Solución salina tamponada con fosfato PBS 10x | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Solución salina tamponada con fosfato 1x | Preparado a partir de 10x stock | ||
| holo-Transferrin bovino | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml de solución madre en agua. Congelar las alícuotas de un solo uso a -20 °C. Añadir a los medios DMEM/F12 hasta una concentración final de 50 μ g/ml. |
| Ácido L-ascórbico (Vitamina C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml de solución madre en agua. Congelar las alícuotas de un solo uso a -20 °C. Añadir a los medios DMEM/F12 hasta una concentración final de 50 μ g/ml. |
| placas tratadas con cultivo de tejidos BioLite de 100 mm | 130182 | placas tratadas sin cultivo de tejidos | Thermo Scientific |
| Microscopio estereoscópico con iluminador de subetapa | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Se puede utilizar cualquier microscopio estereoscópico de disección que tenga una base de luz transmitida. |
| Base del iluminador de subetapa para microscopio estereoscópico | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Halcón 35 mm Placas tratadas con cultivo de tejidos | 353001 | Corning | También se pueden utilizar placas no tratadas con cultivo de tejidos. |
| Platos con fondo de vidrio sin recubrimiento de 50 mm | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Microscopio de fluorescencia de campo amplio | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Cualquier microscopio de fluorescencia (microscopio vertical, invertido o de disección estereoscópica) se puede utilizar para controlar la expresión de GFP a bajo aumento con una cámara digital conectada. |
| Microscopio confocal | TCS SP5 | Leica Microsystems | La microscopía confocal es necesaria para ver estructuras celulares detalladas. Se puede utilizar cualquier microscopio confocal. |
| Pinzas microfinas SWISS, #5 (11.2 cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Se requieren puntas finas para eliminar el mesénquima del epitelio. También se pueden utilizar agujas de tungsteno. |
| Pinzas de punta estándar Dumont, #5 (11 cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (EE. UU.), Inc. | Ideal para la recolección de glándulas de embriones. |
| Mangos de cuchillo quirúrgico de plástico reutilizable, estilo n.º 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| estériles de acero inoxidable, n.º 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Kit de aislamiento de ARN total RNAqueous-Micro | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluido 1:1 con DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) Los | Charles River Labs | se recolectan el día 14 (con el día del descubrimiento del tapón designado como día 0). | |
| Membranas hidrofílicas grabadas con huellas de nucleóporos, 0,1 μ m tamaño de poro, 13 mm | 110405 | Whatman | |
| Ratones Pax6-Cre, GFP con embarazo cronometrado | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson | Laboratory Ratones opcionales para aprender a localizar el LG. |
Referencias
- Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Current allergy and asthma reports. 14, 403(2014).
- Makarenkova, H. P., et al. FGF10 is an inducer and Pax6....
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Reimpresiones y permisos
