Utilizando diseño personalizado galvanotaxia Cámaras para Estudiar direccional migración de las células de la próstata

Resumen

Presentamos un método para aplicar un campo eléctrico fisiológico a las células prostáticas migratorias e inmortalizadas en una cámara de galvanotaxis hecha a medida. Usando este método, demostramos que 2 líneas de células prostáticas no tumorigénicas muestran diferentes grados de direccionalidad de migración en el campo.

Resumen

El campo eléctrico fisiológica sirve funciones biológicas específicas, tales como la dirección de la migración celular en el desarrollo del embrión, consecuencia neuronal y la curación de la herida epitelial. La aplicación de un campo eléctrico de corriente directa a las células cultivadas in vitro induce la migración celular direccional, o galvanotaxia. El método galvanotaxia 2-dimensional se demuestra aquí se modifica con cámaras de poli por encargo (cloruro de vinilo) (PVC), superficie de vidrio, electrodos de platino y el uso de una etapa motorizada en la que se crean imágenes de las células. Las cámaras de PVC y electrodos de platino presentan baja citotoxicidad y son asequibles y re-usable. La superficie de vidrio y la platina del microscopio motorizado mejorar la calidad de las imágenes y permiten posibles modificaciones a la superficie de vidrio y tratamientos para las células. Filmamos la galvanotaxia de dos líneas de células no tumorigénicas SV40 inmortalizado próstata, PRN-1-1 y PNT2. Estas dos líneas celulares muestran velocidades de migración similares y ambos migran haciael cátodo, pero muestran un grado diferente de direccionalidad en galvanotaxia. Los resultados obtenidos a través de este protocolo sugerir que los PRN-1.1 y las líneas celulares PNT2 pueden tener diferentes características intrínsecas que gobiernan sus respuestas migratorias direccionales.

Introducción

Campos eléctricos endógenos se detectan en varios tejidos, como la piel ^{1, 32, 33} y el cerebro ^2. El campo eléctrico fisiológica sirve funciones biológicas específicas, incluyendo la dirección de desarrollo del embrión ^{3, 4,} guiando la consecuencia de los procesos neuronales ^{5, 6} y la promoción de cierre de la herida epitelial corneal y ^{1, 7.} In vitro, la aplicación de un campo eléctrico de corriente directa a las células cultivadas imita el campo eléctrico fisiológica e induce la migración celular direccional, o galvanotaxia. Galvanotaxis se ha estudiado en fibroblastos, queratinocitos ⁸ de p....

Protocolo

1. cultivar células de la próstata

1. Cultura los PRN-1-1 y PNT2 próstata células en 100 mm cultura platos en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB y antibióticos Antimycotic a 37 ° C con 5% de CO _2. Actualizar el medio de cultivo cada día hasta que las células alcanzan 80% de confluencia para los experimentos galvanotaxia.

2. Composición galvanotaxia Cámaras

1. Montaje de cámaras inferiores
   1. Limpie una cámara galvanotaxia plástico con 2-propanol. Aplicar el sellador de silicona de grado marino alrededor de las aberturas circulares en la parte inferior de una cámara con una jeringa y adjuntar....

Resultados

Dos líneas de células de la próstata (PRN-1-1 y PNT2) se investigaron con este método. Las células en ambas líneas migran a velocidades similares de 1,0 +/- 0,3 micras / min durante el transcurso de 2 horas (figura 5A). Sin embargo, la direccionalidad al campo eléctrico es 0,7 +/- 0,3-PRN para la línea 1-1, y 0,2 +/- 0,8 para la línea PNT2 (Figura 5B). Los resultados muestran una diferencia significativa en la galvanotaxia de estas dos líneas celulares (p <0,01, 100 células fueron se.......

Discusión

El análisis de la respuesta galvanotaxia de una célula ha sido un indicador funcional importante para muchos migratoria o crecimiento celular procesa ^{27, 28.} Aquí se utiliza una cámara de medida con la superficie de vidrio a la película dos líneas celulares de próstata. Estas líneas celulares demostraron diferentes grados de galvanotaxia, y especulan que la localización intracelular o la activación de las proteínas galvanotaxia-mediación pueden ser interferidas durante el proceso de generación de las líneas c.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cells
pRNS-1-1 células			Lee, et al. (1994)
Células prostáticas PNT2	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon, et al. (1995)
Medium and solutions
>RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	calentamiento hasta 37 ° C antes de usar
Suero Fetal Bovino - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% en PBS, calentar hasta 37 ° C antes de usar
Antibiótico-Antimicótico (100x)	Life Technologies	15240	añadir 5 ml a 500 ml
2-propanol	VWR	BDH1133-5GL
PBS-		-	137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4 y 1,5 mM KH2PO4 en 1.000 ml de H2 O, pH a 7.4 y autoclave, calentamiento hasta 37 ° C antes de usar
0,25% Tripsina-EDTA	Invitrogen	25200-056	calentamiento hasta 37 ° C antes de usar, tratar las células durante 3-5 minutos a 37 ° C
fuerteGalvanotaxis
cámaras de Galvanotaxis	Precision Plastics Inc, CA		Cámaras de PVC transparentes y no tóxicas diseñadas a medida (1/4" x 2" x 3,5"), no tóxicas. Póngase en contacto con los autores para conocer las especificaciones de diseño.
Electrodos Galvanotaxis Electrodos	UCD Electric shop		Electrodos en espiral de platino con cordones flexibles
Caja de alimentación Galvanotaxis	Substrate Engineering, CA		Salida de alimentación de CC diseñada a medida con voltímetro
Cubierta de microscopio Vidrio, grande, 45 x 50 mm, n.º 1,5	Fisher	12-544-F
Cubreobjetos para microscopio, pequeño, 25 x 25 mm, n.º 1	ThermoScientific	3307
Marcador de punta de diamante	ThermoScientific	750
Sellador de silicona de grado marino, transparente	3M	051135-08019
Grasa de alto vacío	Dow Corning	2021846-0807
Jeringa de 6 ml	Fisher Scientific	05-561-64
Jeringa Nichiryo, 1,5 ml	Nichiryo	SG-M
Aplicadores de algodón	Productos Médicos Purtian	806-WC
Qtips	Johnson & Tubería de PVC Johnson	729389
Nalgene 180	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Pared
Bacto-Agar	Difco	0140-01	hacer una solución de agar al 2%
Cuchilla de afeitar	Personna	74-0001
Equipos y Software
Centrífuga de sobremesa	Eppendorf	5810R	operada con un rotor A-4-62
Celómetro Auto T4	Nexcelom	Auto T4
	Nexcelom	CHT4-SD100-002	carga 20 μ l soluciones de celda para contar
la placa de calentamiento Culture Temp	Bel-Art Scienceware	370150000	para mantener las cámaras de galvanotaxis a 37 ° C
Microscopio Eclipse TE-2000 con platina motorizada y cámara ambiental	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 len objetivo	Nikon
Retiga EX Cámara CCD	Qimaging		Cámara CCD refrigerada, monocolor, 12 bits
Aire comprimido con 5% de CO2	Airgas		pedido especial
Volocity 6.3	PerkinElmer		Software de adquisición de imágenes
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Software de seguimiento de células y personalizado para medir ángulos de migración
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 para Mac	Microsoft

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