Artículo de método

Módulo de iluminación solo plano y Aproximación Micro-capilar para un microscopio de campo amplio

DOI:

10.3791/51993

⸱

15 de agosto de 2014

 ,  , 
1Institute of Applied Research, Aalen University

En este artículo

Resumen

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Un módulo para la iluminación microscopía de plano único (SPIM) se describe que se adapta fácilmente a un microscopio de campo amplio invertida y optimizado para cultivos celulares 3-dimensionales. La muestra se encuentra dentro de un capilar rectangular, y a través de un sistema de microfluidos colorantes fluorescentes, agentes farmacéuticos o medicamentos puede ser aplicado en pequeñas cantidades.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un módulo para la hoja de luz o iluminación microscopía de plano único (SPIM) se describe que se adapta fácilmente a un microscopio de campo amplio invertida y optimizado para cultivos de células de 3 dimensiones, por ejemplo, esferoides tumorales multicelulares (MCT). Las formas del módulo de excitación SPIM y desvía la luz de tal manera que la muestra es iluminada por una lámina de luz perpendicular a la trayectoria de detección del microscopio. El sistema se caracteriza por el uso de un capilar rectangular para sostener (y en una versión avanzada también por un enfoque de micro capilar para hacer girar) las muestras, mediante el ajuste sincrónico de la hoja de luz de iluminación y la lente del objetivo utilizada para la detección de fluorescencia, así como por la adaptación de un sistema de microfluidos para la aplicación de tintes fluorescentes, agentes farmacéuticos o medicamentos en pequeñas cantidades. Se da un protocolo para trabajar con este sistema, y ​​algunos detalles técnicos son reportados. Los resultados representativos incluyen (1) mediciones de la UPtomar de un fármaco citostático (doxorrubicina) y su conversión parcial a un producto de degradación, (2) mediciones redox mediante el uso de un sensor de glutatión codificado genéticamente después de la adición de un agente oxidante, y (3) la iniciación y el etiquetado de necrosis celular de la inhibición de la cadena respiratoria mitocondrial. Se discuten las diferencias y ventajas de la presente módulo SPIM en comparación con los sistemas existentes.

Introducción

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Además de los métodos bien establecidos (confocal o de múltiples fotones microscopía de escaneo láser 1-4, iluminación estructurada de microscopía 5,6) de lámina de luz o microscopía de iluminación plano único (SPIM) ha demostrado ser un valioso método de formación de imágenes 3D 7,8, 9. De particular interés es su aplicación a cultivos de células de 3 dimensiones, por ejemplo, esferoides tumorales multicelulares (MCT), que se utilizan cada vez más para la investigación de descubrimiento de fármacos 10,11. Además, SPIM es un método preferencial cuando incluso después de la exposición a largo plazo o mediciones repetitivas se requieren dosis bajas de luz para mantener la viabilidad de la muestra, ya que para la medición de cada plano de la muestra sólo este plano se expone a la luz. Esto está en contraste con otras técnicas de microscopía, donde para la detección de cada plano focal se ilumina toda la muestra, de modo que tras la grabación de numerosos planos las sumas dosis de luz y puede dañar la muestra 12.

Microscopía de lámina de luz o SPIM se basa en la iluminación de la muestra en dirección perpendicular a la trayectoria de observación ya sea mediante el uso de una lente cilíndrica o escaneando el haz de láser excitante (para una revisión ver ref. 8). Esto a menudo requiere cámaras de muestras especiales 13,14 o matrices, por ejemplo, agarosa 7,15, implementado en los microscopios especiales de alto costo. Como una alternativa a los sistemas de un dispositivo de iluminación sencilla comparable para SPIM se ha desarrollado y adaptado a un microscopio invertido convencional 16 (véase la Figura 1). Se compone de un haz de láser expandido a un diámetro de 8 mm y enfocada por una lente cilíndrica (longitud focal: 50 mm, apertura numérica: 0,08) a una hoja de luz de 6-10 micras de espesor sobre una profundidad de campo de aproximadamente 100 micras . Las muestras se encuentran en un capilar rectangular de 600-900 m de diámetro interior colocado delante del microscopio len objetivos para la detección de fluorescencia. Estas características principales están actualmente completado y optimizado por el uso de enfoques micro-capilares avanzadas para sujetar y para la rotación de las muestras, el ajuste sincrónico de la hoja de luz de iluminación (en dirección axial) y la lente del objetivo utilizados para la detección de fluorescencia (camino óptico idéntico longitudes de desplazamiento requieren una corrección de la alimentación mecánica), y la adaptación de un sistema de microfluidos para la aplicación de tintes fluorescentes, agentes farmacéuticos o medicamentos, minimizando de este modo las cantidades y los gastos necesarios.

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Protocolo

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1. célula que crece esferoide e Incubación

  1. Experimento 1: esferoides de células incubadas con un fármaco quimioterapéutico
    1. Preparar agarosa al 1,5% en medio de cultivo mediante la adición de 0,45 g de agarosa a 30 ml de medio de cultivo (suficiente para 6 platos).
    2. Calentar la mezcla de la etapa 1.1.1 a al menos 80 ° C mientras se agita de vez en cuando.
    3. Llenar 50 l de la mezcla calentada desde el paso 1.1.2 en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se deja solidificar dentro de 1-2 horas. Guarde las placas cerradas y cubiertas en el refrigerador a 5 º C hasta su uso.
    4. Semilla sobre 150 células MCF-7 de cáncer de mama en cada pocillo de la placa preparada 96 pocillos en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con medio F-12 de cultivo de Ham suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 1% de penicilina / estreptomicina .
    5. Grow esferoides durante 5-7 días hasta un diámetro de aproximadamente 200-300 micras en un incubador a 5% de CO2 y 3776; C.
    6. Incubar los esferoides celulares con el clorhidrato de doxorrubicina antibiótico de antraciclina durante 6 horas a una concentración que oscila entre 2 M y 8 M (en medio de cultivo) en una incubadora a 5% de CO2 y 37 ° C.
    7. Lave los esferoides celulares con medio de cultivo o solución salina equilibrada de Earle (EBSS) antes de la microscopía.
  2. Experimento 2: Proceso de oxidación en esferoides que expresan un sensor redox
    1. Semilla sobre 400 células de glioblastoma U251-MG-L106 permanentemente transfectadas con el sensor de glutatión redox verde fluorescente sensible Grx1-roGFP2 en los pozos recubiertos con gel de agarosa (procedimiento descrito en los pasos 1.1.1-1.1.3) de una placa de 96 pocillos en DMEM medio de cultivo suplementado con 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina e higromicina B (150 mg / ml).
    2. Crecer esferoides durante 5-7 días hasta un diámetro de alrededor de 200 a 300 micras en una incubadora a 5% de CO2 y 37 ° C.
    3. Añadir 10 & #181; l de solución de peróxido de hidrógeno (pa purum, ≥ 30%) a 990 agua bidestilada l para crear una solución madre 100 mM para ser utilizado dentro de 12 horas.
    4. Diluir la solución madre de la etapa 1.2.3 a 50 M en EBSS justo antes del experimento.
    5. Incubar los esferoides de células a través del sistema de microfluidos durante la medición con peróxido de hidrógeno 50 mM en EBSS para la oxidación del sensor redox.
  3. Experimento 3: Iniciación y etiquetado de necrosis celular dentro de esferoides
    1. Semilla alrededor de 400 células (por ejemplo, células de glioblastoma U251-MG-L106-Grx1-roGFP2) en pozos recubiertos con gel de agarosa (procedimiento descrito en los pasos 1.1.1-1.1.3) de una placa de 96 pocillos en medio de cultivo DMEM suplementado con 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina e higromicina B (150 mg / ml).
    2. Crecer esferoides durante 5-7 días hasta un diámetro de alrededor de 200 a 300 micras en una incubadora a 5% de CO2 y 37 ° C.
    3. Incubar la célulaesferoides con el transporte de electrones mitocondrial rotenona inhibidor durante 3 horas a una concentración de 1 mM en medio de cultivo para inducir la necrosis celular. Además, co-incubar con un tinte verde citotoxicidad durante 3 horas a una concentración de 1 l en 1 ml de medio de cultivo para etiquetar células necróticas.
    4. Lave los esferoides celulares con medio de cultivo o EBSS antes de la microscopía.

2. Hoja Luz de ajuste

NOTA: Para lograr los mejores resultados, se debe garantizar que la cintura del haz de la hoja de luz está en el plano de enfoque de la lente objetivo. La posición de la cintura del haz sólo se puede alinear mediante la observación de la hoja de luz en posición vertical con respecto al capilar (consulte los pasos 2.5 a 2.8).

  1. Utilice un microscopio invertido y montar el módulo de excitación SPIM, como se describe en la Ref. 16, a la placa base de la mesa de posicionamiento (véase la Figura 1A).
  2. Equipar el microscopio con un 10X / o 20X 0,3 / 0,5 microscopio de lente de objetivo y un filtro apropiado de paso largo (por ejemplo, λ ≥ 515 nm) en la trayectoria de detección del microscopio.
  3. Montar la integración de una cámara al puerto de detección del microscopio.
  4. Utilice un haz colimado paralela de un láser o un diodo láser con una longitud de onda de excitación de 470 nm y preferentemente aplicar al módulo SPIM.
  5. Girar la lente cilíndrica 90 grados, que transfiere la hoja de la luz en una posición vertical para un ajuste axial de la cintura del haz de la hoja de luz.
  6. Coloque un capilar que contiene un líquido con un tinte fluorescente en el portamuestras.
  7. Una el soporte de la muestra con el capilar a la mesa de posicionamiento del microscopio y alinear la posición del capilar de manera que se centra y la cintura del haz de la hoja de la luz está en el foco.
  8. Ajuste la cintura del haz por la variación de la posición axial de la lente cilíndrica sí mismo. A continuación, girar la lente después de adglaje.

3. Cell Aplicación esferoide y Microscopio RSS Sincronización

  1. Coloque los esferoides de células por separado o en grupos dentro de capilares de vidrio de borosilicato 16 rectangular con una sección transversal interior de 600 micras x 600 micras y un espesor de pared de 120 micras. Dos técnicas para la aplicación de un esferoide de células han demostrado ser exitoso.
    1. Tome el capilar vacío en posición vertical con el dedo pulgar y el dedo medio y sellar la abertura superior con el dedo índice. Traiga la abertura inferior cerca del esferoide de células en su líquido circundante (EBSS o medio de cultivo). Soltar el dedo índice desde la abertura superior. Líquido con el esferoide de células en ella se empapó en forma inmediata por las fuerzas capilares. Ajustar la posición del esferoide dentro del capilar llenado por gravedad en posición vertical respectivo del capilar.
    2. Alternativamente, aplicar el esferoide de células para el capilar a través de pipeteado. Tome el cuidado del that la abertura de la punta de la pipeta es, por un lado, lo suficientemente grande para el tamaño del esferoide y, por otra parte, menos o igual en tamaño al diámetro interior del capilar.
  2. Coloque el capilar con el esferoide en ella en un soporte especial de la muestra para microscopía.
  3. Una el soporte de la muestra con el capilar a la mesa de posicionamiento del microscopio y alinear la posición del esferoide de células de tal manera que se centra y se concentró.
  4. Establecer la correspondencia entre la lámina de luz y el plano focal de la lente objetivo del microscopio en la trayectoria de detección mediante el ajuste de la posición del espejo de reflexión y la lente cilíndrica (véase tornillo de ajuste en la Figura 1B).
  5. Ajuste el tornillo micrométrico (véase la Figura 1B) de acuerdo con los índices de refracción y la apertura numérica de la lente objetivo para compensar el efecto pecera.
    NOTA: Los diferentes índices de refracción de la muestra y el medio circundante tél plomo lente objetivo a una diferencia entre el desplazamiento de la lente objetivo y el cambio del plano focal. Puesto que la lámina de luz se mueve por la torreta objetivo, el desfase entre el desplazamiento de la lámina de luz (correspondiente al desplazamiento de la lente objetivo) y el desplazamiento del plano focal es compensada por un brazo de palanca (véase la Figura 1B). El tornillo micrométrico se utiliza para adaptar la distancia entre la parte superior y el pasador inferior para ajustar el desplazamiento de la hoja de luz de acuerdo con la apertura numérica de la lente objetivo y los índices de refracción.

figure-protocol-1
Figura 1. (A) Imagen del módulo de iluminación plano único montado en la placa de base de la tabla de posicionamiento de un microscopio invertido, (B) de configuración del plano de iluminación únicomódulo y la sincronización de alimentación microscopio para compensar la elevación-desajuste (efecto pecera) entre el plano focal y el plano de iluminación. O Delta z indica el desplazamiento de la lente objetivo y Delta z f el desplazamiento del plano focal y la hoja de luz. La incrustación muestra secciones transversales de esferoide que contiene capilares. Izquierda: capilar rectangular con diámetro interior de 600 micras (de pared de 120 micras). Derecha: el programa de instalación utilizado para la rotación. Un capilar interior redonda (diámetro interior de 400 m, diámetro exterior de 550 micras) se gira dentro del capilar rectangular exterior. El espacio entre los dos tubos capilares se llena con un fluido de inmersión.

4. medición en líquido dinámico para el Medio Ambiente

NOTA: El protocolo anterior se utiliza para la incubación estática antes de una medición en el que el esferoide de células ha sido previamente incuba y luego se mantiene en su lugar en el capilar mediante la simple gravitación. No hay necesidad de nuevas FIJACIÓNsucesivamente. Sin embargo, para mediciones en donde los medios de comunicación que fluye de una incubación de dinámica y, por lo tanto, un entorno dinámico es deseable medir la cinética de absorción, se puede lograr este sub-protocolo. Los pasos 4.5 hasta 4.9 son fundamentales para evitar las burbujas de aire que llegan a la muestra.

  1. Llenar el capilar con FCS durante 30 min para apoyar la adhesión celular después de un esferoide de células a la superficie de vidrio interior.
  2. Deje que el recubrimiento FCS restante en el capilar empobrecido se seque por lo menos durante 12 horas.
  3. Introducir el esferoide de células al capilar recubierto FCS como se describe en el paso 3.2.
  4. Deje el capilar en el incubador a 5% de CO2 y 37 ° C durante 2-4 horas adicionales para causar la adhesión celular del esferoide.
  5. Configure la parte aflujo del sistema de microfluidos (ver Figura 2). Utilice una bomba peristáltica para llenar el aflujo de la tubería (diámetro interior: 0,89 mm) con medio de cultivo que contiene el colorante fluorescente, fármaco o agente.
  6. Connect la parte aflujo del sistema microfluídico a una trampa de burbujas (véase la Figura 2).
  7. En primer lugar sujetar el capilar sin burbujas a la tubería de aflujo y luego sujetar el otro lado del capilar a la tubería de drenaje.
  8. Sintonice la temperatura del líquido del baño de agua hasta el valor deseado (por ejemplo, 37 ° C).
  9. Ajustar la bomba peristáltica a la velocidad de la bomba deseada (por ejemplo, velocidad de flujo: 9 l / min; la velocidad de la bomba en el capilar: 25 mm / min).
  10. Recoger el líquido bombeado sea en un (configuración de bucle abierto) destinatario, alimentar de nuevo a su fuente (configuración de circuito cerrado) o alimentarlo directamente en el tubo de la bomba peristáltica (configuración de circuito cerrado apretado).

figure-protocol-2
Figura 2. configuración de microfluidos (lazo abierto y apretado de circuito cerrado); incrustaciones de: Iluminación de un spheroid dentro de un micro-capilar mediante hoja de luz de microscopía de fluorescencia basada acoplado a un microscopio invertido.

5. Adquisición de datos y análisis

  1. Ajuste la potencia del láser y el tiempo de integración para la adquisición de imágenes.
  2. Tenga cuidado de que los parámetros definidos en el paso 5.1 no exceden los valores de dosis de luz sobre 50-100 J / cm 2 para las células nativas o 10-20 J / cm 2 para las células incubadas con un colorante fluorescente o transfectadas con un plásmido que codifica la proteína fluorescente a evitar la fototoxicidad (para detalles ver. Ref 12).
  3. Ajuste el incremento para el z-stack a Delta z = 5-10 micras que es preferible para el análisis de datos en 3 dimensiones como el grosor de lámina de luz es de aproximadamente 10 micras.
  4. Realizar mediciones de imágenes individuales o z-pilas por la variación del plano focal dentro del esferoide de células.

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Resultados

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Experimento 1: esferoides de células incubadas con un fármaco quimioterapéutico

Una tomografía z-stack de un esferoide de células previamente incubadas MCF-7 (8 M doxorrubicina, 6 horas) se representa en la figura 3. Proporciona información detallada acerca de la captación celular y la distribución de doxorrubicina 17 y su producto de degradación 18,19. Dentro de la capa celular externa de la doxorubicina fluorescente de color rojo esfe...

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Discusión

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El presente manuscrito describe una hoja de luz o microscopía de iluminación plano único (SPIM) del dispositivo que está optimizado para sistemas de células de 3 dimensiones, por ejemplo, esferoides tumorales multicelulares (MCT). Tres aplicaciones ejemplares incluyen (1) la absorción de un fármaco citostático y su conversión parcial a un producto de degradación (cuya contribución a la eficacia de la quimioterapia sigue siendo ser evaluado), (2) mediciones del estado redox mediante el uso de un sensor de glutat...

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Divulgaciones

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No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

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Este proyecto fue financiado por el Estado federado de Baden-Württemberg, así como por la Unión Europea, Europäischer Fonds für die Regionale Entwicklung. Los autores agradecen a Rainer Wittig (ILM Ulm) para proporcionar la línea celular U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 y Claudia Hintze para la asistencia técnica en un crack.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de microtitulaciónOrange Scientific4430100Para el crecimiento de esferoides celulares
Agarose Carl Roth GmbH3810.1Para el crecimiento de esferoides celulares
Línea celular MCF-7CLS Cell Lines Service GmbH300273 Línea celular
U251-MG-L106 Líneacelular
DMEMBiochrom AG (Merck Millipore)FG0435Medio de cultivo
DMEM/Ham's F-12Biochrom AG (Merck Millipore)FG4815Medio de cultivo
FCSBiochrom AG (Merck Millipore)S0615Suplemento de cultivo celular
Penicilina/estreptomicinaBiochrom AG (Merck Millipore)A 2213Antibióticos
Higromicina BLaboratorios PAA   P02-015Antibiótico
EBSSSigma-Aldrich Inc.E3024Suplemento de cultivo celular
DoxorrubicinaSigma-Aldrich Inc.D1515Colorante fluorescente (ATENCIÓN: toxicidad aguda)
Colorante verde de citotoxicidadPromega GmbHG8742CellTox - colorante fluorescente de citotoxicidad
RotenonaSigma-Aldrich Inc.R8875Inhibidor celular (PRECAUCIÓN: toxicidad aguda)
Peróxido de hidrógeno (H2O2)Sigma-Aldrich Inc.95302Reactivo para la oxidación (ATENCIÓN: toxicidad aguda)
VitroCom capilar;8260-050
MicroscopioCarl Zeiss JenaAxiovert 200M
AxioCam MRc Cámara CCDCarl Zeiss MicroImaging GmbH426508-9901-000Cámara CCD
Software de adquisición de datos AxioVisionCarl Zeiss MicroImaging GmbHversión 4.8.2.
Diodo láserPico Quant GmbH LDH-P-C-470Utilizado con el controlador PDL800-B
Bomba peristálticaIsmatec LabortechnikMS-1 RegloRecalibrado para reducir la velocidad mínima de la bomba en 1/10 
Tubos de siliconaIDEX Health & Science GmbHTYGON R3607
de preparación de muestras

Referencias

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