Medición anafilaxia local en ratones

Resumen

Las respuestas alérgicas, caracterizados por la activación de los mastocitos y basófilos, están impulsados ​​por la reticulación de IgE y liberación de mediadores proinflamatorios. Una evaluación cuantitativa de las respuestas alérgicas se puede lograr mediante el uso de colorante azul de Evans para monitorear los cambios en la permeabilidad vascular después de la provocación con alergeno.

Resumen

Las respuestas alérgicas son el resultado de la activación de los mastocitos y basófilos y la posterior liberación de mediadores vasoactivos y proinflamatorios. La exposición a un alérgeno en un individuo sensibilizado puede dar lugar a síntomas clínicos que varían desde leves hasta anafilaxia eritema que amenazan la vida. En el laboratorio, se han desarrollado diversos modelos animales para comprender los mecanismos que impulsan respuestas alérgicas. En este documento, se describe un método detallado para medir los cambios en la permeabilidad vascular para cuantificar las respuestas alérgicas localizadas. El ensayo de la anafilaxia local fue reportado por primera vez en la década de 1920, y ha sido adaptada de la técnica publicada por Kojima et al. en 2007 ^1. En este ensayo, los ratones sensibilizados a OVA son desafiados en el oído izquierdo con vehículo y en la oreja derecha con OVA. Esto es seguido por una inyección intravenosa de colorante azul de Evans. Diez minutos después de la inyección de azul de Evans, el animal es sacrificado y el tinte que se ha extravasado enpara los oídos se extrae durante la noche en formamida. La absorbancia del colorante extraído se cuantificó luego con un espectrofotómetro. Este método da con fiabilidad una manifestación visual y cuantificable de una respuesta alérgica local.

Introducción

Hipersensibilidad de tipo I está mediada por reticulación inducida por el antígeno de la IgE en la superficie de mastocitos y basófilos. Esto da como resultado la desgranulación celular y la liberación de mediadores vasoactivos y proinflamatorios tales como histamina, triptasa, y factor activador de plaquetas ^2. Después de la liberación de mediadores preformados durante la degranulación de los mastocitos sintetizan y liberan prostaglandinas y leucotrienos, que aumentan aún más la permeabilidad vascular ^3. La respuesta clínica inicial se produce rápidamente y se conoce como una "reacción inmediata". En la piel, una respuesta de roncha y eritema e....

Protocolo

1. Ratones Sensibilizar

1. Preparar una solución madre de OVA mediante la dilución de OVA en PBS 1X a una concentración final de 20 mg / ml. Congele por alícuotas en crioviales y almacenar a -80 ° C para su uso futuro.
2. Traiga una o más alícuotas de 20 mg / ml OVA de stock a temperatura ambiente. Diluir OVA en PBS 1X a una concentración final de 1 mg / ml en un tubo de poliestireno de 5 ml de fondo redondo con una tapa. Vortex brevemente para mezclar.
3. Mientras sostiene el tubo de poliestireno que contiene el 1 mg / ml de OVA en un vórtice a velocidad media, añadir un volumen igual de bien homogeneizada Imject alumbre (40 mg / ml) gota a got....

Resultados

Los animales que han sido sometidos a la prueba con éxito tendrán la piel y los ojos que aparecen de color azul. PBS animales sensibilizados no deben reaccionar a PBS o desafío OVA, por lo tanto ambos oídos deben permanecer blanco (Figura 1A). En los animales sensibilizados OVA, el oído recibir el desafío PBS (izquierda) debe ser completamente blanco o ligeramente azul en forma localizada en el sitio de inyección. El oído recibir el desafío OVA (derecha) debe convertirse en progresivamente más oscuro az.......

Discusión

Numerosos marcadores de la enfermedad alérgica se utilizan para evaluar la solidez de las respuestas alérgicas tras la exposición de alérgenos, incluyendo cambios en los niveles de histamina circulantes, la producción de citocinas Th2, y el reclutamiento de células en el líquido broncoalveolar en el ajuste de la impugnación de las vías respiratorias. Mientras seguimiento de los cambios en estos parámetros es importante para el estudio de las reacciones alérgicas, marcadores biológicos no siempre se correlacionan con la .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BALB/c Ratones	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbúmina	Sigma	A5503-10G
Imject Alumbre	Thermo Scientific	77161	Mezclar bien antes
de usar Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamide	Sigma 295876		99%+ Isoflurano de grado espectrofotométrico
, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
Jeringas de insulina de 1 cc	BD	329654
3/10 cc Jeringa de insulina con aguja de 31 G	Terumo	NDC 100861
Agujas de 27 g	BD	de 305109
	F.S.T.	11000-12
Tijeras quirúrgicas	F.S.T.14070-12
5 ml Tubos de poliestireno de fondo redondo	BD Falcon	352058
1,5 ml Tubos de microcentrífuga	Supply Partners	15-1151
15 ml Tubos cónicos BD	Falcon	352097
Placa de 96 pocillos de fondo plano	Costar	3590
Cinta
RC2 Sistema de anestesia para roedores	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Modelo G560 con plataforma de 3 pulgadas

Pinzas Medical adhesiva