Alta Eficiencia Diferenciación de células madre pluripotentes humanas a cardiomiocitos y Caracterización por citometría de flujo

Subarna Bhattacharya; Paul W. Burridge; Erin M. Kropp; Sandra L. Chuppa; Wai-Meng Kwok; Joseph C. Wu; Kenneth R. Boheler; Rebekah L. Gundry

doi:10.3791/52010

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Artículo de método

Alta Eficiencia Diferenciación de células madre pluripotentes humanas a cardiomiocitos y Caracterización por citometría de flujo

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DOI:

10.3791/52010

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23 de septiembre de 2014

Subarna Bhattacharya^*¹ , Paul W. Burridge^*² , Erin M. Kropp¹ , Sandra L. Chuppa¹ , Wai-Meng Kwok³ , Joseph C. Wu² , Kenneth R. Boheler⁴^,⁵ , Rebekah L. Gundry¹^,⁶

¹Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, ²Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, ³Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, ⁴Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, ⁵Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, ⁶Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El artículo describe la metodología detallada para diferenciar eficazmente células madre pluripotentes humanas en cardiomiocitos mediante la modulación de la vía Wnt selectivamente, seguido por citometría de flujo análisis de marcadores de referencia para evaluar la homogeneidad e identidad de la población.

Resumen

Hay una necesidad urgente de desarrollar enfoques para reparar el corazón dañado, el descubrimiento de nuevas drogas terapéuticas que no tienen efectos tóxicos sobre el corazón, y la mejora de las estrategias para modelar con precisión la enfermedad cardíaca. El potencial de la explotación de la tecnología humana inducida de células madre pluripotentes (hiPSC) para generar músculo cardiaco "en un plato" para estas aplicaciones sigue generando gran entusiasmo. En los últimos años, la capacidad de generar de manera eficiente las células cardiomiogénico partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) ha mejorado en gran medida, nos ofrece nuevas oportunidades para modelar etapas muy tempranas del desarrollo del corazón humano y no tengan acceso. En contraste con muchos métodos anteriores, el protocolo de diferenciación de cardiomiocitos describe aquí no requiere la agregación de células o la adición de activina A o BMP4 y robusta genera cultivos de células que son altamente positivos para la troponina cardíaca I y T (TNNI3, TNNT2), iroquois- proteína clase homeodominioIRX-4 (Irx4), reguladora de la miosina de cadena ligera 2, isoforma muscular ventricular / cardiaca (MLC2v) y miosina reguladora cadena ligera 2, isoforma auricular (MLC2a) por día 10 a través de todas las células madre embrionarias humanas (CMEH) y líneas hiPSC probado para fecha. Las células pueden ser pasados y mantenidos por más de 90 días de cultivo. La estrategia es técnicamente simple de implementar y rentable. Caracterización de los cardiomiocitos derivados de células pluripotentes a menudo incluye el análisis de marcadores de referencia, tanto a nivel de ARNm y proteína. Para el análisis de proteínas, citometría de flujo es una poderosa herramienta analítica para evaluar la calidad de las células en cultivo y la determinación de la homogeneidad subpoblación. Sin embargo, la variación técnica en la preparación de muestras puede afectar significativamente la calidad de citometría de flujo de datos. Por lo tanto, la estandarización de los protocolos de tinción debería facilitar las comparaciones entre diversas estrategias de diferenciación. En consecuencia, optimizado los protocolos de tinción para el análisis de Irx4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, y TNNT2 por citometría de flujo se describen.

Introducción

La generación de cardiomiocitos de hPSCs, incluyendo células madre y hiPSC, puede funcionar como un modelo in vitro de los procesos de desarrollo cardíacas humanas muy tempranas, proporcionando información sobre las etapas de otra manera no accesibles para los estudios mecanicistas. Este sistema modelo ofrece oportunidades únicas para estudiar los mecanismos moleculares que controlan el compromiso de linaje cardiaco y la especificación del destino celular. En los últimos años, la capacidad de generar eficazmente células cardiomiogénico de hPSCs ha mejorado en gran medida ^1-15. Sin embargo, entre los protocolos hay una variación línea celular con r....