Artículo de método

Alta Eficiencia Diferenciación de células madre pluripotentes humanas a cardiomiocitos y Caracterización por citometría de flujo

DOI:

10.3791/52010

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23 de septiembre de 2014

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1Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, 5Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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El artículo describe la metodología detallada para diferenciar eficazmente células madre pluripotentes humanas en cardiomiocitos mediante la modulación de la vía Wnt selectivamente, seguido por citometría de flujo análisis de marcadores de referencia para evaluar la homogeneidad e identidad de la población.

Resumen

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Hay una necesidad urgente de desarrollar enfoques para reparar el corazón dañado, el descubrimiento de nuevas drogas terapéuticas que no tienen efectos tóxicos sobre el corazón, y la mejora de las estrategias para modelar con precisión la enfermedad cardíaca. El potencial de la explotación de la tecnología humana inducida de células madre pluripotentes (hiPSC) para generar músculo cardiaco "en un plato" para estas aplicaciones sigue generando gran entusiasmo. En los últimos años, la capacidad de generar de manera eficiente las células cardiomiogénico partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) ha mejorado en gran medida, nos ofrece nuevas oportunidades para modelar etapas muy tempranas del desarrollo del corazón humano y no tengan acceso. En contraste con muchos métodos anteriores, el protocolo de diferenciación de cardiomiocitos describe aquí no requiere la agregación de células o la adición de activina A o BMP4 y robusta genera cultivos de células que son altamente positivos para la troponina cardíaca I y T (TNNI3, TNNT2), iroquois- proteína clase homeodominioIRX-4 (Irx4), reguladora de la miosina de cadena ligera 2, isoforma muscular ventricular / cardiaca (MLC2v) y miosina reguladora cadena ligera 2, isoforma auricular (MLC2a) por día 10 a través de todas las células madre embrionarias humanas (CMEH) y líneas hiPSC probado para fecha. Las células pueden ser pasados ​​y mantenidos por más de 90 días de cultivo. La estrategia es técnicamente simple de implementar y rentable. Caracterización de los cardiomiocitos derivados de células pluripotentes a menudo incluye el análisis de marcadores de referencia, tanto a nivel de ARNm y proteína. Para el análisis de proteínas, citometría de flujo es una poderosa herramienta analítica para evaluar la calidad de las células en cultivo y la determinación de la homogeneidad subpoblación. Sin embargo, la variación técnica en la preparación de muestras puede afectar significativamente la calidad de citometría de flujo de datos. Por lo tanto, la estandarización de los protocolos de tinción debería facilitar las comparaciones entre diversas estrategias de diferenciación. En consecuencia, optimizado los protocolos de tinción para el análisis de Irx4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, y TNNT2 por citometría de flujo se describen.

Introducción

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La generación de cardiomiocitos de hPSCs, incluyendo células madre y hiPSC, puede funcionar como un modelo in vitro de los procesos de desarrollo cardíacas humanas muy tempranas, proporcionando información sobre las etapas de otra manera no accesibles para los estudios mecanicistas. Este sistema modelo ofrece oportunidades únicas para estudiar los mecanismos moleculares que controlan el compromiso de linaje cardiaco y la especificación del destino celular. En los últimos años, la capacidad de generar eficazmente células cardiomiogénico de hPSCs ha mejorado en gran medida 1-15. Sin embargo, entre los protocolos hay una variación línea celular con respecto a la eficiencia en la generación de células cardiomiogénico y temporización en la que las células expresan marcadores específicos para cada cámara (por ejemplo, ventrículo y aurículas). Idealmente, para futuras aplicaciones de este sistema de modelo, se desean más poblaciones homogéneas de células funcionalmente definidos. En contraste con los métodos anteriores, el protocolo de diferenciación de cardiomiocitos describe aquí no requiere ceagregación ll o la adición de proteínas activina A o morfogenética ósea 4 (BMP4) y robustamente genera culturas altamente positivo para TNNI3 TNNT2, Irx4, MLC2v y MLC2a por día 10 células en todas las líneas de células madre y hiPSC probados hasta la fecha. La estrategia es técnicamente fácil de implementar, especialmente en comparación con cultivos tridimensionales, la cultura de masas, o estrategias basadas cuerpo embrioide 4-9, y se definió recientemente en un estudio que describe una molécula pequeña con toxicidad selectiva a hPSCs (Boheler et al. ) 65. Las características de este protocolo incluyen la diferenciación de hPSCs en cultivo en monocapa utilizando una sola capa de una matriz calificado hESC (Matrigel), medios completamente definidos que utilizan pequeñas moléculas que modulan la señalización Wnt (similar, pero distinta de 1,2,7,13), y flujo optimizado citometría de métodos de tinción para la evaluación de la eficiencia de la diferenciación y la identidad de la célula. En resumen, las ventajas de este protocolo en comparación con los informes anteriores incluyen su costo-efectividad, reproducibilidad y su alta eficiencia para la generación de cardiomiocitos entre múltiples líneas de HPSC, incluyendo células madre y hiPSC líneas.

La citometría de flujo es una poderosa herramienta de análisis para evaluar la calidad de las células en cultivo y determinar la homogeneidad subpoblación, y con un diseño experimental adecuado, pueden proporcionar mediciones cuantitativas. Al igual que con todas las estrategias basadas en anticuerpos, la interpretación precisa de los resultados experimentales requiere que los elementos del diseño del ensayo, incluyendo la concentración de anticuerpo y la fijación y las condiciones de permeabilización (cuando dirigidas a antígenos intracelulares) son cuidadosamente probados para cada anticuerpo como condiciones sub-óptimas afectan significativamente la eficiencia del anticuerpo vinculante, y por lo tanto, la interpretación de los resultados. Es importante destacar que, si se requiere la cuantificación, los anticuerpos monoclonales son esenciales, como los anticuerpos policlonales pueden reconocer epítopos múltiples y son propensas a la variación de lote a lote. Actualmente, una variedad de anticuerpos (polyclonal protocolos y monoclonales) y tinción se han descrito para la evaluación de la diferenciación in vitro, por lo que es difícil comparar la eficiencia de cardiomyogenesis entre protocolos 1,2,9,11. Por esa razón, los anticuerpos monoclonales se utilizan cuando esté disponible para todos los análisis de citometría de flujo. De cara al futuro, se espera que la normalización de estos protocolos de tinción, especialmente con respecto a la cuantificación, deben permitir una mejor comparación entre las estrategias de diferenciación.

La elección de los marcadores, y sus correspondientes anticuerpos, que se utiliza para evaluar la pureza de in vitro cardiomyogenesis varía entre los informes. TNNT2 se ha considerado un indicador de las células comprometidas con el destino cardiomiogénico y se utiliza habitualmente para evaluar la eficacia de los protocolos de diferenciación cardíacas. Sin embargo, TNNT2 también se expresa en el músculo esquelético durante el pollo y rata desarrollo temprano 16,17 y está presente en el músculo liso humano 18 . Por lo tanto, TNNT2 no es necesariamente un marcador específico de cardiomyogenesis humana in vitro. MLC2v y MLC2a se utilizan habitualmente como marcadores indirectos de subtipos ventriculares y auriculares, respectivamente. Sin embargo, los retos con confiar en MLC2v y MLC2a para determinar el subtipo de cardiomiocitos en el contexto de la diferenciación in vitro surgen del hecho de que estos productos génicos no se puede restringir a una cámara específica largo del desarrollo cardíaco, del tubo de corazón a través de adulto. En el roedor bucle corazón, MLC2a ARNm es predominante en la / zona de tracto de entrada auricular y MLC2v ARNm es predominante en las regiones del tracto ventricular / flujo de salida. En el corazón de bucle, co-expresión de MLC2a y MLC2v ARNm se observó en el tracto de entrada, canal atrioventricular y el tracto de salida 19,20. A los 3 días después del nacimiento, MLC2v ARNm está restringida al ventrículo y por 10 días después del nacimiento, MLC2a se limita a las aurículas en el corazón de rata neonatal 19. Por lo tanto, la interpretaciónde los datos relativos a la eficiencia y la identidad de subtipo cardiomyogenesis no sólo deben considerar la presencia y cantidad de los niveles de marcadores de referencia, pero deben tener en cuenta la etapa de desarrollo (s) a la que los puntos de tiempo de la diferenciación que se analizan corresponden. Esto es especialmente importante teniendo en cuenta que la etapa de maduración de las células cardiomiogénico generados por diferenciación in vitro de hPSCs se asemeja más estrechamente a los del desarrollo fetal / embrionario 21-25. Por lo tanto, basándose en la expresión espacial de un marcador en el corazón postnatal puede no ser apropiado para la evaluación de células derivadas de HPSC, al menos en algunos casos.

En un esfuerzo por facilitar el desarrollo de criterios más específicos para la definición de la identidad de los cardiomiocitos in vitro, TNNI3 se considera que es un marcador útil para evaluar cardiomyogenesis in vitro, ya que se limita al músculo cardiaco a lo largo de la embriogénesis en el pollo y pez cebra 15,20y está ausente en el músculo esquelético fetal humano 26. Mientras TNNI1 está presente en el corazón fetal humano, TNNI3 es la única isoforma TNNI presente en el corazón adulto normal 27,28. En cuanto a la identidad subtipo de cardiomiocitos, Irx4 29-31 es un marcador informativo de las células con un destino ventricular. En el nivel de proteína, Irx4 ha demostrado recientemente ser restringido al ventrículo del corazón del tubo lineal a través de etapas neonatales en el ratón 32. En consecuencia, se describen los protocolos de tinción optimizados para el análisis de TNNI3 y Irx4 por citometría de flujo. Para nuestro conocimiento, esta es la primera descripción de un método para la tinción basada en anticuerpos eficiente y análisis de los niveles Irx4 en cardiomiocitos humanos por citometría de flujo.

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Protocolo

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1. Solución y Preparación de Medios

  1. hESC Matrix Calificado Coating Stock Solution
    1. Lentamente descongelar hESC matriz cualificado (5 ml) en hielo a 4 º C durante la noche. Prescindir de alícuotas en tubos de microcentrífuga pre-refrigerados, 1,5 ml estéril y almacenar inmediatamente a -20 º C.
      NOTA: El volumen de la alícuota variará dependiendo de la cantidad y por lo general oscila desde 270 hasta 350 l. Fabricante proporciona detalles con respecto a volumen de alícuota requerida para alcanzar una concentración 1x tras la dilución en 25 ml como se describe en el paso 2.1.
  2. HPSC media Stock Soluciones
    1. Use agua ultrapura como diluyente a menos que se indique lo contrario. Esterilizar todos los componentes utilizando un filtro de 0,22 micras. Guarde lo siguiente como soluciones a granel a 4 ° C: bicarbonato de sodio (75 mg / ml); ácido cítrico (10 mM, pH = 3).
    2. Esterilizar todos los componentes que utilizan filtro de jeringa de 0,2 micras y almacenar cada uno como alícuotas a -20 ° C: Rho quinasa (ROCK) inhibidor Y-27632 (10mM en DPBS, 100 l alícuota); Ácido L-ascórbico 2-fosfato (64 mg / ml, alicuota de 500 ml); selenito de sodio (70 g / ml, 100 l alícuota); transferrina (50 mg / ml, 107 l alícuota); factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2; 200 ng / l en DPBS, 250 l alícuota); factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFß1, 100 ng / l en ácido cítrico frío 10 mM, 10 l alícuota).
  3. Composición HPSC Solución Media E8
    1. Preparar los medios de comunicación utilizando alícuotas preparadas en el Paso 1.2: DMEM / F12 (con L-glutamina y HEPES; 500 ml), bicarbonato de sodio (3,62 ml; final: 543 mg / ml), ácido L-ascórbico 2-fosfato (500 l; finales : 64 g / ml), selenito de sodio (100 l; final: 140 ng / ml), transferrina (107 l; final: 10,7 g / ml), insulina (1 ml; final: 20 mg / ml), FGF2 (250 l; final: 100 ng / ml), TGFß1 (10 l; final: 2 ng / ml).
    2. Combinar todas las componentes, esterilizar filtro y se almacena a 4 º C durante un máximo de 2 semanas.
  4. HPSC Medios E8 con Inhibidor ROCA
    1. Añadir inhibidor ROCA 15 l a 12 ml de medio E8 preparadas como anteriormente y mezclar bien. Asegúrese de que la concentración final es de 10 M después de la adición de las células / los medios de comunicación en el paso 3.7.
  5. Soluciones madre de Wnt moduladores
    1. Guarde las siguientes alícuotas a -20 º C. CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; 10 mM en DMSO, 15 l alícuotas). IWR-1 (4 (1,3,3a, 4,7,7a-hexahidro-1,3-dioxo-4,7-metano-2H-isoindol-2-il)-N-8-quinolinil benzamida; 10 mM en DMSO, 6 l alícuotas).
  6. Diferenciación de Medios
    1. Preparar los medios de diferenciación # 1 con RPMI 1640 (con L-glutamina) con 2% de suplemento de insulina menos B27.
    2. Preparar los medios de diferenciación # 2 con RPMI 1640 (con L-glutamina) con 2% B27 más suplemento de insulina y 2% de FBS.
  7. Cell Solución de Lavado fo cultivo celular
    1. Utilizar tampón fosfato salino de Dulbecco (DPBS), sin calcio o magnesio.
  8. Cell Solución de Lavado de Citometría de Flujo
    1. Utilizar tampón fosfato salino (PBS, sin calcio o magnesio) con 1% de FBS. Almacenar a 4 ° C.
  9. Solución de mantenimiento celular para citometría de flujo
    1. Utilice solución salina equilibrada de Hank (HBSS; sin calcio o magnesio) con 5% de FBS. Almacenar a 4 ° C.
  10. Soluciones de fijación para citometría de flujo
    1. Utilice tampón Cytofix como solución de fijación de anticuerpos TNNI3 y Irx4.
    2. Utilice 4% de paraformaldehído en PBS 1x (hacer fresco) como solución de fijación para anticuerpos y TNNT2 MLC2a.
    3. Utilice metanol al 70% / 30% de acetona como solución de fijación para anticuerpos MLC2v.
    4. Almacene todas las soluciones a 4 ° C.
  11. Soluciones para la permeabilización de Citometría de Flujo
    1. Utilice PhosFlow Perm Buffer III como solución de permeabilización fo anticuerpos TNNI3 y Irx4. Conservar a temperatura ambiente (25 ° C).
    2. Use 0,2% de Triton X-100 en PBS 1x como solución de permeabilización de anticuerpos TNNT2, MLC2v, y MLC2a. Almacenar a 4 ° C.
  12. Solución de bloqueo
    1. Utilice un 10% de suero de cabra en PBS 1x. Hacer fresco y almacenar a 4 ° C hasta su uso.

Revestimiento 2. Plate

  1. Lentamente descongelar 1 alícuota de matriz calificado hESC a 4 ° C durante 30 minutos, añadir 25 ml de frío DMEM / F12 y mezclar bien en esterilizada campana de cultivo de tejido inmediatamente antes de recubrir placas de 6 pocillos.
  2. Añadir 1 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos en esterilizada campana de cultivo de tejidos (1 alícuota de la matriz calificado células madre es suficiente para revestir cuatro placas de 6 pocillos).
  3. Permita matriz calificado hESC se asiente durante 30 minutos a temperatura ambiente bajo el capó. Aspirar el exceso de matriz calificado hESC y añadir 2 ml de medio E8 con inhibidor ROCA a cada pocillo. Use platos inmediatamente, o si desired, almacenar a 4 ° C inmediatamente después de la siembra hasta por 1 semana y equilibrar a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de su uso.

3. Propagación y Mantenimiento de indiferenciados hPSCs en monocapa cultura

  1. Mantener hPSCs en cultivo monocapa en placas de 6 pocillos y realizar todos los pasos bajo una campana de cultivo de tejidos estéril.
  2. Utilice líneas HPSC que están bien establecidas (> p20) y exhiben una morfología homogénea sin la presencia de células con un neural, morfología epithelial- o similar a fibroblastos. Asegúrese de células proliferan robusta, y, en promedio, el paso cada tres días a 75% de confluencia cuando se sembraron a 0,75 x 10 6 por pocillo.
  3. HPSCs pasaje con la disociación a nivel de células individuales por lo menos 5 veces antes del inicio de la diferenciación para asegurar la máxima eficiencia de la diferenciación. Para hPSCs de paso, los medios de comunicación aspirado E8 y se lavan las células dos veces con 4 ml de 1x DPBS (precalentada a temperatura ambiente). Añadir 1 ml de la desconexión celularsolución ción (pre-calentado a temperatura ambiente) a cada pocillo y salir del pozo en reposo durante 3-7 minutos, hasta que los bordes de células comienzan a round-up.
  4. Usar una pipeta de vidrio de algodón conectado con el bulbo para desalojar las células y transferir a un tubo cónico de 15 ml que contiene 1 ml de medio DMEM / F12 (para inactivar la solución de desprendimiento de las células).
  5. Retire 10 l alícuota de solución de células y mezclar con 10 l de azul de tripano en un tubo de microcentrífuga. Recuento de células (por ejemplo, automatizado o manual de hemocitómetro), mientras que el resto de las células se recogen por centrifugación a 130 xg durante 5 min a temperatura ambiente. El uso de este protocolo, esperar 70-80% de viabilidad utilizando un hemocitómetro automatizado y en el futuro, la base de todos los números de teléfonos en el total de células.
  6. Aspirar los medios de comunicación y resuspender el botón celular en DMEM / F12 a una concentración final de 0,75 x 10 6 células por 500 l.
  7. Añadir 500 l de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de 6 pocillos donde cada contai asíns 2 medios ml E8 con inhibidor de ROCK, preparada en el paso 2.3. Dejando placa sobre la encimera, mover suavemente en una de delante hacia atrás y el movimiento de lado a lado para dispersar uniformemente a través de las células del pozo. Células retorno a la incubadora en el 5% de CO 2, 37 º C.
  8. A partir de las 24 horas después de los pases, sustitución de los medios todos los días usando 2 ml / pocillo E8 sin inhibidor ROCA. Optimizar densidad de siembra para lograr el 100% de confluencia antes del inicio de la diferenciación. Seed 0.75 x 10 6 células / pocillo cuatro días antes del inicio de la diferenciación, sino optimizar para cada línea celular según sea necesario.

4. cardiomiocitos Inducción de hPSCs por Selective modulación de la vía Wnt

  1. Actualizar medios de comunicación (2 ml / pocillo) al día durante 0-7 días, y cada dos días después del día 8.
  2. En el día 0, comenzar el proceso de diferenciación mediante la sustitución de los medios de comunicación E8 con medio de diferenciación # 1. Añadir 1,2 l CHIR (6 M final) a cada pocillo. Repita en el día 1.
  3. En los días 2-3, reemplace con dife frescamedios ciación # 1.
  4. El día 4, sustituir con la diferenciación fresca para los medios # 1. Añadir 1 l IWR-1 (5 mM final) a cada pocillo. Repita en el día 5.
  5. En los días 6-7, sustituir con la diferenciación fresca para los medios # 1.
  6. El día 8, reemplace con la diferenciación fresca para los medios # 2.
  7. Continuar para reemplazar con medio de diferenciación # 2 cada dos días durante el tiempo deseado de la cultura.
  8. Si se desea, los cardiomiocitos de paso utilizando la solución de desprendimiento celular siguiendo los pasos descritos en 3.3-3.6, pero sustituyendo los medios de comunicación con los medios de diferenciación # 2. Durante los pases, disociar los cardiomiocitos en pequeños racimos de células ~ 3-10. Semilla en ~ 6 x 10 5 células por pocillo utilizando células madre pocillos recubiertos de matriz cualificado y diferenciación para los medios # 2.

5. Recolección de Células para citometría de flujo

  1. Lleve a cabo todos los aspectos restantes de los pasos 5-9 en la mesa de laboratorio (es decir, no estéril).
  2. Medios de cultivo Aspirar y lavar las células dos veces con PBS 1x.Añadir 1 ml de la solución de desprendimiento de las células (pre-calentado a la temperatura ambiente) a cada pocillo y dejar en reposo durante 3-7 min, hasta los límites celulares comienzan a round-up. Utilice un desechable "pipeta de vidrio de borosilicato de algodón-9 conectado con el bulbo para desalojar las células y transferir a un tubo cónico de 15 ml en hielo.
  3. A lo largo de resto de protocolo, mantener las células en hielo y realizar centrifugaciones a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
  4. Recoger las células por centrifugación y la solución aspirada. Resuspender las células en solución de lavado celular 10 ml usando una pipeta serológica de 10 ml con la trituración repetida para garantizar grupos de células se dispersan en células individuales. Contar las células como en el paso 3.5, mientras que el resto de las células se recogen por centrifugación.
  5. Resuspender las células en solución de lavado celular cuidando desagregar completamente sedimento celular y alícuota de 1 x 10 6 células por tubo de fondo redondo. Recoger las células por centrifugación y la solución aspirada.

6. La fijación yPermeabilización de células para la tinción intracelular de antígenos

  1. Añadir solución de fijación 100 l de sedimento celular. Añadir la solución gota a gota con agitación vorticial suave continua y a continuación, establezca en hielo durante 15 min.
  2. Añadir la solución de lavado de células 3 ml. Recoger las células por centrifugación y la solución aspirada.
  3. Añadir solución de permeabilización 100 l de sedimento celular. Añadir la solución gota a gota con agitación vorticial suave continua a continuación, establezca en hielo durante 30 min. Utilice las condiciones de fijación y permeabilización como se indica para cada anticuerpo en la Tabla 1.
  4. Añadir la solución de lavado de células 3 ml. Recoger las células por centrifugación y la solución aspirada. Repita para un total de dos lavados después de permeabilización.
Anticuerpo Primario (Clon) Inmunógeno / epítopo reconocido Control de Istotype La cantidad de anticuerpo primario por 1 x 10 6 células en 100 l Solución de fijación Solución de permeabilización Anticuerpo secundario Cantidad de anticuerpo secundario / 1 x 10 6 células en 100 l
Para medidas positivas por ciento Para el antígeno de cuantificación
TNNI3 (284 (19C7) ISASRKLQL (humana) Ratón IgG2b 1,0 g 3,0 g BD Cytofix BD PhosFlow perm III De cabra anti-ratón de IgG2b-Alexa488 600 ng
TNNT2 (1C11) Longitud completa purificada T proteína troponina humana nativa. Ratón IgG1 1,0 g 2,0 g 4% PFAen el 1% de PBS 0,2% de Triton X-100 en PBS 1% Cabra IgG1 anti-ratón - Alexa 488 600 ng
MLC2v (330G5) FDPEGKG Ratón IgG2a 2,0 g 3,0 g 70% de metanol / 30% de acetona 0,2% de Triton X-100 en PBS 1% Anti-ratón de cabra IgG2a - Alexa 647 600 ng
MLC2a (4E7) proteína recombinante humano de longitud completa de MYL7 humana producida en E. coli Ratón IgG1 0,5 g 3,0 g 4% PFA en PBS 1% 0,2% de Triton X-100 en PBS 1% Cabra IgG1 anti-ratón - Alexa 488 600 ng
Irx4 LQEHRKNP
YPTKGEKI
MLAIITKM
TLTQVST 		IgG de conejo 0,5 g 0,5 g BD Cytofix BD PhosFlow perm III Cabra anti-raBBIT IgG-PE 600 ng

Tabla 1 Concentraciones de anticuerpos. Listado son el anticuerpo primario, el clon (si monoclonales), concentraciones optimizadas y condiciones de fijación y permeabilización para cada anticuerpo primario y secundario utilizan para los análisis de citometría de flujo. Como las concentraciones de anticuerpo de valores pueden variar entre los proveedores del mismo clon, las concentraciones finales de cada anticuerpo por 1 x 10 6 células en un volumen de ensayo fija, en lugar de diluciones, se proporcionan. El inmunógeno utilizado para generar el anticuerpo, o epítopo reconocido por el anticuerpo, según lo previsto por el fabricante, está en la lista, pero no fue verificado experimentalmente aquí.

7. tinción de anticuerpos

  1. Para cada experimento, incluir un control sin teñir por fijación / permeabilización y la condición de control de isotipo apropiado para cada anticuerpo primario utilizado. Incluya tipos de células no cardiomiocitos como controles negativos (por ejemplo, las células madre pluripotentes o fibroblastos). Use controles de isotipo a la misma concentración que el anticuerpo primario correspondiente (véase la Tabla 1).
  2. Resuspender las células en 100 l de solución de bloqueo con una pipeta P200 desagregar las células. Set muestras en hielo durante 25 minutos con agitación suave.
  3. Sin retirar la solución de bloqueo, añadir el anticuerpo primario o isotipo control según las directrices de la Tabla 1. Incubar 45 min en hielo con suave balanceo.
  4. Añadir la solución de lavado de células 3 ml. Recoger las células por centrifugación y la solución aspirada. Repetir para un total de dos lavados después del marcaje del anticuerpo primario.
  5. Si se utiliza un anticuerpo primario conjugado con fluoróforo, proceder a 8.1. Cuando se utiliza un anticuerpo primario sin conjugar (como para todos los marcadores descritos aquí), realizar un etiquetado con el anticuerpo secundario que está conjugado con un fluoróforo como sigue.
  6. Resuspender las células en 100 l de solución de bloqueo utilizando una pipeta P200 a disacélulas ggregate.
  7. Añadir anticuerpo secundario según las pautas de la Tabla 1. Incubar 30 min en hielo con suave balanceo.
  8. Añadir la solución de lavado de células 3 ml. Recoger las células por centrifugación y la solución aspirada. Repetir para un total de dos lavados después del marcaje del anticuerpo secundario.

8. Preparación de las células para citometría de flujo

  1. Resuspender las células en 400 l solución de mantenimiento de las células utilizando una pipeta P1000 desagregar las células.
  2. Prepare una tapa filtro de células en un tubo de fondo redondo de pre-humectación con solución de mantenimiento de la célula 50 l. Ajuste el tubo en hielo. Utilice la tapa del filtro de células para evitar que los agregados de células se obstruya el citómetro de flujo.
  3. Transferir la solución de célula a célula tapón del filtro y permitir la suspensión de células se escurra por gravedad. Toque parte inferior de tubo suavemente en el banco de la parte superior según sea necesario para que las células se recogen en el tubo y un retroceso en hielo tan pronto como sea posible. Colador enjuague con el mantenimiento de células de 250 l por lolución para asegurar la recuperación máxima de las células.
  4. Mantener células en hielo y proteger de la luz hasta que se analizaron por citometría de flujo.

9. Flow Analysis Citometría

Configuración de adquisición detallados varían entre los instrumentos. Parámetros fundamentales a tener en cuenta para la recolección de datos óptima se describen a continuación.

  1. Para una estabilidad óptima corriente, asegúrese de que el tamaño de la boquilla supera 5-6 veces está analizando el diámetro de la célula.
    NOTA: Esto puede variar entre los instrumentos, pero es una consideración importante, tanto para los analizadores y seleccionar el tamaño de la boquilla adecuada para la clasificación de células. El diámetro medio de 10 días cardiomiocitos es 11 micras (que van 8-14 micras); Por lo tanto, un tubo de inyección de la muestra estándar 150 micras en un analizador funciona bien.
  2. Inmediatamente antes de análisis de datos, cada tubo de vórtice brevemente para dispersar los agregados de células.
  3. Optimizar adelante y ajustes de voltaje de dispersión lateral para cada tipo de células basadas ensin teñir de control para cada condición de fijación / permeabilización usado en el experimento de tal manera que las poblaciones de interés son a escala y centrado (Figura 2A).
    1. Mantener estos valores a lo largo de un solo experimento y ser consistentes de un experimento a otro en el mismo instrumento, como cambios importantes pueden indicar posibles problemas con el citómetro de flujo o la preparación de muestras.
  4. Para cada fluoróforo, analizar el control de isotipo y ajustar el voltaje de láser adecuado para determinar la intensidad mínima requerida para obtener un histograma de fluorescencia que muestra bordes izquierdo y derecho del pico. Mantener los ajustes del láser para cada isotipo de control cuando la adquisición de datos en las correspondientes muestras de anticuerpos manchado.
    NOTA: la deriva de la señal a menudo se produce con el tiempo en el mismo instrumento. Es crítico para ajustar la configuración de láser en el comienzo de cada experimento basado en el control de isotipo apropiado.
  5. Reunir un mínimo de10,000 eventos. Se prefieren 50.000 eventos.
  6. Para los análisis estadísticos, puerta la población de células vivas para excluir los desechos (Figura 2A). Determinar porcentaje de células positivas dentro de la población cerrada sobre la base de colocación de marcador que permite ≤2% contribución de control de isotipo, como se muestra en la Figura 2B, C.

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Resultados

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En el día 0, las células son 100% confluentes con morfología compacta y restos celulares mínima. En los días 1-2, es común observar una muerte celular significativa (40-50%), pero las células unidas retendrá la morfología compacta (Figura 1A). Durante este tiempo, los medios de comunicación es de color naranja y turbia. Medios Pink indica muerte celular excesiva, y en este caso, confirme con azul de tripano y suspender si la muerte celular supera el 70%. Las células se recuperarán durante los días 3-4 y...

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Discusión

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Crítico para el éxito del protocolo de diferenciación es el uso de cultivos de alta calidad de hPSCs que han sido sometidas a pases en el nivel de células individuales durante al menos cinco pasajes antes del inicio de la diferenciación. Eficiencias de diferenciación similares se observan rutinariamente entre varias líneas de HPSC si son 100% confluentes en el inicio de la diferenciación, independiente de la línea celular. Se observa la eficiencia subóptima si la confluencia de las células en el inicio de la diferenciac...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Esta investigación fue apoyada por el NIH 4R00HL094708-03, Asuntos de Investigación MCW Comité Nuevo Premio Facultad, y la fundación de Kern (fondos de inicio) en el Colegio Médico de Wisconsin (RLG); Investigación del Consejo de Becas basada tema de Hong Kong Esquema Investigación T13-706 / 11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM Dr2a-05394, y AHA Establecido Investigator Award (JCW); AHA Postdoctoral Fellowship 12POST12050254 (PLP). Damos las gracias a Esperanza Campbell en la Citometría de Flujo del Instituto de Investigación de la Sangre de Wisconsin para obtener ayuda con la recopilación de datos y de una cuidadosa revisión del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cell Culture
BD Matrigel, matriz calificada para hESCBD Biosciences354277
Solución de desprendimiento de células AccutaseStem Cell Technologies7920
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS), sin calcio, sin magnesioLife Technologies14190-136
Dimetilsulfóxido (DMSO, Hybri-Max, filtrado estéril)Sigma AldrichD2650
Bicarbonato de sodioSigma Aldrich53817
Ácido cítricoSigma AldrichC2404-100G
Y-27632 diclorhidrato selectivo p160ROCK inhibidorR& D Systems1254
L-Ácido ascórbico-2-fosfato sesquimagnesio sal hidratoSigma AldrichA8960-5G
Selenito de sodioSigma AldrichS5261-10G
Transferrina (Optiferrin – Definido, Libre de animales, Recombinante Humano)Invitria777TRF029
Factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2)R& D Systems4144-TC-01M
Factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFβ 1)Peprotech100-21
DMEM/F12 con L-Glutamina y 15 mM HEPESLife Technologies11330-032
InsulinaSigma AldrichI9278-5ML
CHIR-99021 HClSellekchemS2924
IWR-1Sigma AldrichI0161
RPMI 1640 con L-GlutaminaLife Technologies11875-093
B-27 Suplemento Menos InsulinaLife TechnologiesA1895601
B-27 Suplemento (con Insulina)Life Technologies17504-044
Suero fetal bovinoLife Technologies10437
Reactivos de citometría de flujo
salina tamponada >fosfato fuerte (10x)Quality Biological Inc.119-069-151
Solución salina equilibrada de Hank sin Ca2+ y Mg2+Life Technologies14175-095
BD CytofixBD Biosciences554655
BD Phosflow tampón permanente IIIBD Biosciences558050
16% ParaformaldehídoThermo Scientific28906
MetanolSigma Aldrich179957-4L
AcetonaMallenckrodt Chemicals 2440-16
Triton X-100AmrescoM236-10ML
Suero de cabraLife Technologies16210-064
Solución de azul de tripán, 0.4%Life Technologies15250-061
Materiales
5 ml Tubo de poliestireno de fondo redondo (sin tapón)Corning352008Para la preparación de células para citometría de flujo
5 ml Tubo de poliestireno de fondo redondo (con 35 µ Filtro de células M tapón a presión)Corning352235Para la preparación de células para citometría de flujo
ml bombillas de gomaFischer Scientific03-448-24
Vidrio destapado de borosilicato de 9" Pipetas PasteurBioExpressP-2904-2
0,65 ml Tubos de microcentrífuga, graduados, verdesGeneMateC-3259-G
1,5 ml Tubos de microcentrífuga, graduados, rojoGeneMateC-3260-R
TC20 contador de células automatizadoBioRad145-0102
Portaobjetos de recuento para TC20BioRad145-0011
6 pocillos Placa tratada de cultivo de tejidos de fondo planoCorning353046
20 ml JeringasBD Plastipak300613Para la esterilización por filtro de alícuotas
Filtros de jeringa estériles, 0,2 y micro; m polietersulfonaVWR28145-501Para la esterilización de filtros de alícuotas
250 ml Sistema de filtrado, 0,22 y micro; m polietersulfona, esterilizante, de baja fijaciónCorning431096Para la esterilización por filtros de medios a granel 
Sistema de filtro de 500 ml, 0,22 y micro; m de polietersulfona, esterilizante, de baja fijaciónCorning431097Para la esterilización por filtro de medios
Anticuerpos y controles de isotipo
Anti-TNNI3 (clon: 284 (19C7))Abcamab19615Anticuerpo primario
Anti-TNNT2 (clon: 1C11)Thermo ScientificMA1-16687Anticuerpo primario
Anti-MYL2 (MLC2v, clon: 330G5)Sistemas sinápticos310111Anticuerpo primario
Anti-MYL7 (MLC2a, clon: 4E7)AbcamAB131661Anticuerpo primario
Anti-IRX4   BiossBS-9464RAnticuerpo primario
Alexa Fluor 488 Cabra anti-ratón IgG1 Life TechnologiesA21121Anticuerpo secundario
Alexa Fluor 647 Cabra anti-ratón IgG2aLife TechnologiesA21241Anticuerpo secundario
Alexa Fluor 488 Cabra anti-ratón IgG2bLife TechnologiesA21141Anticuerpo secundario
Ficoeritrina (PE) Cabra anti-conejo IgGR& D SystemsF0110Anticuerpo secundario
Ratón IgG1BD Biosciences557273Ratón de control de isotipo
IgG2aeBiosciences16-4724-81Control de isotipo
de conejo IgG-PER& D SystemsIC105PIsotype Control
TaqMan Probesets para qRT-PCR
ACTBLife TechnologiesHs01060665
Brachyury TLife TechnologiesHs00610080
CASQ2Life TechnologiesHs00154286
IRX4Life TechnologiesHs01100809
ISL1Tecnologías de la VidaHs00158126
MESP1Tecnologías de la VidaHs01001283
MYH11 (SMMHC)Tecnologías de la VidaHs00224610
MYH6Tecnologías de la VidaHs01101425
MYL2 (MLC2v)Tecnologías de la VidaHs00166405
MYL7 (MLC2a)Tecnologías de la VidaHS01085598
MYOGTecnologías de la VidaHS01072232
NKX2.5Tecnologías de la VidaHs00231763
NPPATecnologías de la VidaHs01081097
POU5F1Tecnologías de la VidaHs04260367
SOX17Tecnologías de la VidaHS00751752
TNNI1Tecnologías de la VidaHS00913333
TNNI2Tecnologías de la VidaHs00268536
TNNI3Tecnologías de la VidaHS00165957
TNNT2Tecnologías de la VidaHs00165960
2 a granel

Referencias

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  1. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
  2. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8, 162-175 (2013).
  3. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  4. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293(2011).
  5. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  6. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, 228-240 (2011).
  7. Willems, E., et al. Small-molecule inhibitors of the Wnt pathway potently promote cardiomyocytes from human embryonic stem cell-derived mesoderm. Circ Res. 109, 360-364 (2011).
  8. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
  9. Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8, 1037-1040 (2011).
  10. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  11. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21, 579-587 (2011).
  12. Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, e23657(2011).
  13. Hudson, J., Titmarsh, D., Hidalgo, A., Wolvetang, E., Cooper-White, J. Primitive Cardiac Cells from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells Dev. 21, 1513-1523 (2011).
  14. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111, 1125-1136 (2012).
  15. Ban, K., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons that target cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128, 1897-1909 (2013).
  16. Toyota, N., Shimada, Y. Differentiation of troponin in cardiac and skeletal muscles in chicken embryos as studied by immunofluorescence microscopy. J Cell Biol. 91, 497-504 (1981).
  17. Saggin, L., Gorza, L., Ausoni, S., Schiaffino, S. Cardiac troponin T in developing, regenerating and denervated rat skeletal muscle. Development. 110, 547-554 (1990).
  18. Kajioka, S., et al. Endogenous cardiac troponin T modulates Ca(2+)-mediated smooth muscle contraction. Sci Rep. 2, 979(2012).
  19. Franco, D., et al. Myosin light chain 2a and 2v identifies the embryonic outflow tract myocardium in the developing rodent heart. Anat Rec. 254, 135-146 (1999).
  20. Franco, D., Lamers, W. H., Moorman, A. F. Patterns of expression in the developing myocardium: towards a morphologically integrated transcriptional model. Cardiovasc Res. 38, 25-53 (1998).
  21. Poon, E., et al. Transcriptome-guided functional analyses reveal novel biological properties and regulatory hierarchy of human embryonic stem cell-derived ventricular cardiomyocytes crucial for maturation. PLoS One. 8, e77784(2013).
  22. Lieu, D. K., et al. Absence of transverse tubules contributes to non-uniform Ca(2+) wavefronts in mouse and human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 18, 1493-1500 (2009).
  23. Cao, F., et al. Transcriptional and functional profiling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. PLoS One. 3, e3474(2008).
  24. Satin, J., et al. Calcium handling in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 26, 1961-1972 (2008).
  25. Itzhaki, I., et al. Calcium handling in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. PLoS One. 6, e18037(2011).
  26. Bodor, G. S., Porterfield, D., Voss, E. M., Smith, S., Apple, F. S. Cardiac troponin-I is not expressed in fetal and healthy or diseased adult human skeletal muscle tissue. Clin Chem. 41, 1710-1715 (1995).
  27. Hunkeler, N. M., Kullman, J., Murphy, A. M. Troponin I isoform expression in human heart. Circ Res. 69, 1409-1414 (1991).
  28. Bhavsar, P. K., et al. Developmental expression of troponin I isoforms in fetal human heart. FEBS Lett. 292, 5-8 (1991).
  29. Christoffels, V. M., Keijser, A. G., Houweling, A. C., Clout, D. E., Moorman, A. F. Patterning the embryonic heart: identification of five mouse Iroquois homeobox genes in the developing heart. Dev Biol. 224, 263-274 (2000).
  30. Bruneau, B. G., et al. Cardiac expression of the ventricle-specific homeobox gene Irx4 is modulated by Nkx2-5 and dHand. Dev Biol. 217, 266-277 (2000).
  31. Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283, 1161-1164 (1999).
  32. Nelson, D. O., Jin, D., Downs, K., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Dev Dyn. 243, 381-392 (2013).
  33. Martin, A. F. Turnover of cardiac troponin subunits. Kinetic evidence for a precursor pool of troponin-I. J Biol Chem. 256, 964-968 (1981).
  34. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, 1991-2002 (2013).
  35. Farrell, H. M., et al. Nomenclature of the proteins of cows" milk--sixth revision. Journal of dairy science. 87, 1641-1674 (2004).
  36. Micusan, V. V., Borduas, A. G. Biological properties of goat immunoglobulins. G. Immunology. 32, 373-381 (1977).
  37. Lyons, G. E. In situ analysis of the cardiac muscle gene program during embryogenesis. Trends Cardiovasc Med. 4, 70-77 (1994).
  38. Nakagawa, O., Nakagawa, M., Richardson, J. A., Olson, E. N., Srivastava, D. H. R. T. 1 HRT2, and HRT3: a new subclass of bHLH transcription factors marking specific cardiac, somitic, and pharyngeal arch segments. Dev Biol. 216, 72-84 (1999).
  39. Xin, M., et al. Essential roles of the bHLH transcription factor Hrt2 in repression of atrial gene expression and maintenance of postnatal cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7975-7980 (2007).
  40. Davis, L. M., Rodefeld, M. E., Green, K., Beyer, E. C., Saffitz, J. E. Gap junction protein phenotypes of the human heart and conduction system. J Cardiovasc Electrophysiol. 6, 813-822 (1995).
  41. Minamisawa, S., et al. Atrial chamber-specific expression of sarcolipin is regulated during development and hypertrophic remodeling. J Biol Chem. 278, 9570-9575 (2003).
  42. Larsen, T. H. Atrial natriuretic factor in the heart of the human embryo. Acta Anat (Basel. 138, 132-136 (1990).
  43. Claycomb, W. C. Atrial-natriuretic-factor mRNA is developmentally regulated in heart ventricles and actively expressed in cultured ventricular cardiac muscle cells of rat and human). Biochem J. 255, 617-620 (1988).
  44. Franco, D., et al. Divergent expression of delayed rectifier K(+) channel subunits during mouse heart development. Cardiovasc Res. 52, 65-75 (2001).
  45. Hoogaars, W. M., et al. The transcriptional repressor Tbx3 delineates the developing central conduction system of the heart. Cardiovasc Res. 62, 489-499 (2004).
  46. Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol Cell Biol. 15, 3813-3822 (1995).
  47. Srivastava, D., Cserjesi, P., Olson, E. N. A subclass of bHLH proteins required for cardiac morphogenesis. Science. 270, 1995-1999 (1995).
  48. Firulli, A. B., McFadden, D. G., Lin, Q., Srivastava, D., Olson, E. N. Heart and extra-embryonic mesodermal defects in mouse embryos lacking the bHLH transcription factor Hand1. Nat Genet. 18, 266-270 (1998).
  49. Calejo, A. I., et al. Differences in the expression pattern of HCN isoforms among mammalian tissues: sources and implications. Mol Biol Rep. 41, 297-307 (2013).
  50. Stevens, S. M., Pu, W. T. HCN4 charges up the first heart field. Circ Res. 113, 350-351 (2013).
  51. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 15, 1098-1106 (2013).
  52. Davis, R. P., vanden Berg, C. W., Casini, S., Braam, S. R., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell models of cardiac disease and their implication for drug discovery and development. Trends Mol Med. 17, 475-484 (2011).
  53. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. , 107-2733 (2003).
  54. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  55. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 1011-1018 (2011).
  56. Samal, R., et al. OMICS-based exploration of the molecular phenotype of resident cardiac progenitor cells from adult murine heart. J Proteomics. 75, 5304-5315 (2012).
  57. Van Hoof, D., et al. Identification of cell surface proteins for antibody-based selection of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. J Proteome Res. 9, 1610-1618 (2010).
  58. Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics Clin Appl. 2, 892-903 (2008).
  59. Gundry, R. L., Burridge, P. W., Boheler, K. R. Pluripotent Stem Cell Heterogeneity and the Evolving Role of Proteomic Technologies in Stem Cell Biology. Proteomics. 11, 3947-3961 (2011).
  60. Gundry, R. L., et al. A Cell Surfaceome Map for Immunophenotyping and Sorting Pluripotent Stem Cells. Mol Cell Proteomics. , 303-316 (2012).
  61. Bryder, D., Rossi, D. J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cells: the paradigmatic tissue-specific stem cell. Am J Pathol. 169, 338-346 (2006).
  62. Kondo, M., et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol. 21, 759-806 (2003).
  63. Shizuru, J. A., Negrin, R. S., Weissman, I. L. Hematopoietic stem and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system. Annu Rev Med. 56, 509-538 (2005).
  64. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112, 3543-3553 (2008).
  65. Boheler, K. R., Bhattacharya, S., Chuppa, S., Riordon, D. R., Kropp, E., Burridge, P. W., Wu, J. C., Wersto, R. P., Wollscheid Rao,, Gundry, B., L, R. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals New Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Reports. , 185-203 (2014).

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