Ensayo sencillo para cuantificación de Prevención Social en Drosophila melanogaster

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar la evitación de individuos estresados. Este paradigma es potente y fácil de usar y puede utilizarse para evaluar la influencia de los genes y el medio ambiente en un tipo de interacción social en Drosophila melanogaster.

Resumen

Drosophila melanogaster es un modelo emergente para estudiar diferentes aspectos de las interacciones sociales. Por ejemplo, las moscas evitan las áreas previamente ocupadas por congéneres estresados debido a un odorante liberado durante el estrés conocido como odorante de estrés de Drosophila (dSO). Mediante el uso del aparato de laberinto en T, se puede cuantificar la evitación de la dSO por parte de las moscas respondedoras en un ensayo muy asequible y robusto. Aquí se presentan las condiciones necesarias para obtener un rendimiento sólido. Es necesaria una experiencia estresante para que las moscas emitan dSO, así como suficientes moscas emisoras para causar una respuesta de evitación robusta a la presencia de dSO. Los antecedentes genéticos, pero no el tamaño de su grupo, alteraron fuertemente la evitación de la dSO por parte de las moscas respondedoras. Canton-S y Elwood muestran un mayor rendimiento en la evitación de la dSO que las cepas de Oregón y Samarcanda. Este ensayo conductual permitirá identificar los mecanismos que subyacen a este comportamiento social y evaluar la influencia de los genes y las condiciones ambientales tanto en la emisión como en la evitación del dSO. Un ensayo de este tipo puede incluirse en baterías de pruebas diagnósticas sencillas que se utilizan para identificar las deficiencias sociales de los mutantes o las condiciones ambientales de interés.

Introducción

El objetivo de este método es cuantificar fácilmente un nuevo aspecto de la conducta social sencilla en Drosophila melanogaster, independiente desde el cortejo y la agresión.

Las interacciones sociales son cruciales para el buen desarrollo y la salud de los individuos dentro de una sociedad, así como la funcionalidad de un grupo social en su conjunto. La alta complejidad de estas interacciones requiere grandes tamaños de muestra y un sistema que permite la simplificación del comportamiento como las bases genéticas y neuronales del comportamiento social son aún poco conocidos. Drosophila melanogaster es un modelo genético de gran alcance que se puede utilizar para identificar la genética y bases neurales de las interacciones sociales. De hecho, D. melanogaster tiene un repertorio de comportamientos sociales complejos y algunas mediciones directas de socialización ya se han hecho ^1-7. Sin embargo, la mayoría de estos esfuerzos se han centrado en los comportamientos sociales relativamente complejas, como los aggresinteracciones sive ^3,6, diversos aspectos de cortejo ^3,8-12, y cómo la experiencia social afecta a otros comportamientos tales como el aprendizaje, o ritmo circadiano ^13-17. Además, muchos de estos ensayos se basan en el análisis de los patrones de interacción complejas de grupos de moscas, mediante el seguimiento de vídeo y software de computadora para analizar la abundancia de datos resultante. Estos análisis son muy valiosos, y dar lugar a nuevas e importantes ideas tales como la dinámica de las interacciones con mosca mosca en grupos de ^7. Una limitación, sin embargo, es la falta de acceso a estos ensayos a la comunidad en general, y el limitado conocimiento de los mecanismos subyacentes reconocimiento de los demás. En otras palabras, la base de la emisión de una señal por un individuo y su reconocimiento por otro aún es poco conocido ^18.

Por el contrario, también vuela exhibir un comportamiento simple, evitación social, donde las personas se alejan de una señal emitida por las moscas estresados: el D. melanogaster Estrés Odorante o DSO ^19. En un ensayo de alto rendimiento, este comportamiento se puede cuantificar como la evitación de una señal de tensión emitida por otras moscas, o evitación social ^19. Las moscas se colocan en un aparato de laberinto en T y se les da la opción de evitar un vial que contiene DSO. Utilizando este ensayo, CO ₂ ha demostrado ser un componente de la DSO, y parte de la circuitería neural necesaria para responder a CO ₂ se disecó ^19.

El ensayo de evitación social que aquí se presenta es conceptualmente similar a los ensayos de comportamiento simples desarrollados en el laboratorio de Seymour Benzer que permitieron a generaciones de investigadores para diseccionar conductas complejas ^20. Análisis de evitación social puede llevarse a cabo de forma rentable utilizando el ensayo de laberinto en T, lo que permite un estudio más generalizado de comportamiento social. Por ejemplo, el uso de este ensayo hemos demostrado que los diferentes riesgos genéticos para el autismo tienen efectos contrastantes en b socialesensayos ehavior. Los mutantes de un gen candidato para el autismo - neurobeachin ^21,22 - deficiencias presentes tanto en el espacio social (describen en otra parte ²³⁾ y evitación social ^24. También se propone la señalización dopaminérgica anormal para jugar un papel en la etiología del autismo en los seres humanos ^25,26. En contraste con los resultados obtenidos con neurobeachin, se encontró que el rendimiento evitación social no se vio afectada por el aumento o disminución de los niveles de la Drosophila vesicular de monoamina Transporter (VMAT) en células dopaminérgicas, aunque el espacio social se correlacionó directamente a estos niveles de VMAT ^27. Los resultados obtenidos con contrastantes neurobeachin y VMAT subrayan la posibilidad de identificar diversas formas de comportamiento asocial, y por lo tanto los diferentes trazados de circuito neuronales subyacentes modulación de la respuesta a otros.

Protocolo

1. Equipos y Reactivos de creación propia (véase lista de los demás)

1. Preparar un aparato de anestesia frío Drosophila para realizar el trabajo con mosca.
   1. Cortar una hoja de polietileno poroso para cubrir una pequeña caja de plástico (12,7 cm de largo, 10,2 cm de ancho), típicamente la cubierta superior de una caja de puntas de pipeta (12,7 cm de largo, 10,2 cm de ancho, 3,8 cm de profundidad).
   2. Llene la caja con hielo picado, cubrir con la lámina de polietileno poroso.
2. Preparar un aparato de laberinto en T; adaptar el aparato descrito anteriormente en detalles ^28-31.
3. Preparar un aspirador de mosca como se describe ^32.
4. Preparar un mecanismo de respuesta phototaxis para desplazar moscas dentro y fuera de viales de prueba sin estrés:
   1. Utilice un aparato de contracorriente, como se describe por ^29,33.

NOTA: El laberinto en T también puede utilizarse para otros fines, como se describe por ^28.

5. Asegurar homcondiciones de iluminación ogeneous: realizar el experimento en un banco cubierto con una tapa banquillo blanco, y delante de una pizarra blanca.
   NOTA: Para estos experimentos, las cepas de moscas Drosophila melanogaster utilizados fueron tipos silvestres: Canton-S, Oregon y Samarcanda vuela desde nuestras reservas de laboratorio ^34; Elwood moscas se recolectaron en el otoño de 2011 en el barrio de Elwood de Huntington, en Long Island, Nueva York, EE.UU..

2. Preparación de las moscas antes de que el experimento

1-2 días antes de realizar el experimento:

1. Mantener moscas en medio de harina de maíz-agar-melaza-levadura estándar a 25 ° C en un 12 horas de luz / oscuridad ciclo.
2. Recoger las moscas de respuesta bajo anestesia frías 1-2 días antes de realizar el experimento
   1. Transferir las moscas de las botellas en las que han sido planteadas en 50 ml tubos Falcon, usando un embudo.
   2. Coloque el tubo Falcon con las moscas bajo el nivel del hielo, en uncubo de hielo aislado.
   3. Coloque el aparato de anestesia fría con hielo picado a -4 ° C para relajarse.
   4. Espere 5 minutos para que las moscas entren en un estado de coma escalofrío.
   5. Transferencia de las moscas sobre la hoja de polietileno poroso del aparato de anestesia frío.
   6. Recoge las moscas de respuesta sobre el aparato de anestesia frío. A temperatura ambiente, bajo un microscopio estereoscópico, separar 3-7 días de edad de sexo masculino de moscas hembras y mantener estas moscas en grupos de 40.
3. Recoge las moscas emisor 1-2 días antes de realizar el experimento.
   1. Recoger suavemente Canton-S de ambos sexos vuela de sus botellas, utilizando un aspirador bucal, controlando su número.
   2. Mantener estas moscas en el grupo de 60 a 100, ya que serán los emisores.
   3. Preparar tantas muestras de emisores como puntos de datos necesarios.
4. Deje al menos una noche de recuperación después de la recolección de los respondedores y emisores, para minimizar cualquier efecto de confusión de la anestesia fríoy la boca de recogida aspirador en el comportamiento.
5. Abra la bolsa de viales de prueba, para permitir el aire de plástico con olor a rancio en la bolsa para ser reemplazado por aire fresco, por lo menos 1 día antes del experimento.

2 hr antes de realizar el experimento:

6. Asegúrese de que la temperatura de la habitación en la que se realiza el experimento es de alrededor de 23 a 25 ° C, incluso con la luz y la humedad por encima del 30%.
7. La transferencia de los respondedores y moscas de la fruta emisores en viales de alimentos frescos para asegurar que estas moscas no están hambrientos.
8. Deje que las moscas de la fruta se ajustan al medio ambiente durante 2 horas, en el banco en el que se llevará a cabo el experimento.

3. Realizar el Experimento Prevención Social

1. Realizar cada experimento en el mismo momento del día, en un rango de 3 a 4 horas de la tarde entre el tiempo Zeitgeber ZT5 y ZT9.
2. Coloque el laberinto en T en el teclado de golpes, y apretar la pinza tornillo para tél ascensor es estable.
3. Transferir las moscas de respuesta en un vial de la prueba fresca. Ajustar este vial que contiene las moscas de respuesta sobre la parte superior de la T-laberinto.
4. Incline el aparato T-laberinto y golpecitos sobre el tapete golpeando por lo que las moscas de la fruta caen en el ascensor.
5. Mover la parte superior del elevador hacia abajo de modo que las moscas son entre la sección superior e inferior de la T-laberinto, pero prestar atención a mantener el ascensor encima del punto de elección - para evitar que las moscas escapen.
6. Obtener los viales con la DSO (véase la Sección 5 para generar DSO libre viales que fueron ocupados previamente por las moscas).
   1. Mientras que las moscas de respuesta se están adaptando a este nuevo entorno, coloque las moscas de emisor en un vial de la prueba.
   2. Coloque un pedazo de algodón para cerrar el vial por lo que las moscas de la fruta no se escapen.
   3. Mecánicamente agitar este vial en un mini-vórtice de la siguiente manera: vórtice durante 15 segundos, retire el vial del vórtice durante 5 segundos. Repita 3 veces para un total de 55 seg.
   4. Remove las moscas emisor del frasco fresco - mediante la transferencia en un vial de alimentos - y rápidamente colocar este vial lleno DSO en uno de los dos lados del aparato T-laberinto.
   5. Alterne el lado de colocación para el vial DSO lleno en cada nueva ejecución.
7. Colocar un vial de ensayo fresco en el otro lado de la T-laberinto.
8. Traiga el ascensor hasta el fondo, por lo que las moscas de la fruta pueden elegir entre el vial de la prueba fresca y el vial de la prueba con DSO, e iniciar el temporizador.
9. Deje que las moscas eligen entre el vial y el vial fresco DSO, durante 1 min, a menos que se indique lo contrario.
10. Después de 1 min, mover el ascensor hasta separar las moscas en el vial nuevo, DSO vial, y aquellos atrapados en el ascensor.
11. Cuente el número de moscas en cada vial, y en el ascensor.
12. Repita esto para cada genotipo / condición.

4. Análisis de los datos evitación social

1. Cuente el número de moscas de la fruta en cada vial para cada genotipo, y transferir los datos a una hoja de cálculo.
2. Utilizando un programa de hoja de cálculo, calcular el Índice de Rendimiento (PI) para cada genotipo restando el número de moscas en el vial DSO partir del número de moscas en el vial DSO-libre, y luego dividiendo por el número total de moscas.
3. Comparación de las IP medios utilizando software de análisis estadístico para el análisis de los resultados.
   1. Lo ideal es preparar 2-3 repeticiones internas para cada experimento, y 3 repeticiones independientes, realizadas en días diferentes, con diferentes botellas o cruza ^30.
   2. Utilice pruebas estadísticas distribución gaussiana, como los datos siguen una distribución normal.
   3. Al probar un efecto (es decir, la densidad de - la Figura 2), utilizar un ANOVA de una vía, con post-test para la comparación múltiple (columna por columna), o una simple prueba t para comparar cada resultado a un control.
   4. Cuando se llevan a cabo experimentos de grupo, prueba ambas condiciones y géneros (viales vacíos, subrayó und moscas un-estresado; y el efecto de género - la Figura 1), utilizando un ANOVA de dos vías.

5. Generar viales previamente ocupado por las moscas no acentuadas - Realizar En lugar de 03.05 a 03.06

1. Utilice phototaxis para preparar viales ocupados por las moscas que no han sido estresadas, como control.
2. Transferir las moscas en un vial de la prueba, y que encaje dentro del aparato en contracorriente, con viales vacíos frescas en la posición opuesta.
3. Coloque el aparato en posición horizontal con el vial distal directamente delante de una luz blanca fría 15 W fluorescentes, y cubrir con un paño negro.
4. Deje que las moscas se mueven suavemente en el vial fresco. Esto puede tardar varios minutos. Una vez que la mayoría de las moscas están caminando hacia la luz en el vial distal, iniciar el temporizador durante 1 min.
5. Retire suavemente el paño negro, cambiar la ubicación de la luz, recuperarse con el paño negro, y permitir que las moscas a abandonar el vial de la prueba.
6. En ese momento, initiate el experimento de elección como en 3.2 a 3.5. Salta 3.6 y 3.7.
7. Mueva el control deslizante del aparato, para separar las moscas que liberar a partir del vial de prueba desde el otro lado.
8. Utilice el vial de la prueba que dejó vacante en el laberinto en T de inmediato para el experimento de elección, como en 3.7.

Resultados

El ensayo de evitación social es una prueba robusta cuantificar la capacidad de Drosophila melanogaster para reconocer una señal de estrés (DSO) emitida por otras moscas, y la evaluación de este modo uno de los aspectos de las interacciones sociales. El ensayo se realizó a través de un aparato de uso común en diversos ensayos de comportamiento conocido como un laberinto en T, que presentan las moscas con una elección entre dos opciones diferentes - izquierda o derecha ^19,28-31. En este caso, la efici...

Discusión

Este protocolo describe un procedimiento detallado para el ensayo de evitación social. Canton-S sólo evitará un vial en el que vuela han sido previamente tensionados mecánicamente, y que el sexo y el número de pacientes que respondieron no afecta que el rendimiento de evitación social. Sin embargo, los antecedentes genéticos de los respondedores tiene una gran influencia.

Los siguientes son varios pasos críticos para llevar a cabo este experimento con éxito: 1) siempre transferir las moscas ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio estereoscópico con zoom	Nikon	SMZ-645	Cualquier otro visor estándar para el manejo de moscas funcionaría
Pinceles pequeños			para empujar moscas
Polietileno poroso, 12" x 12" Hoja	de mosca - Genesee	46-100	http://www.flystuff.com/ProductInfo.php?productID=46-100 Lámina de plástico poroso para la caja de anestesia fría
Mini-Alarma Temporizador/Cronómetro
Bolígrafos
Cinta adhesiva
Mini vórtice	Fisher	14-955-151	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail Para la agitación mecánica de las moscas, cualquier vórtice funcionaría.
Corning Life Sciences DL No.:352017, Tubo de ensayo Falcon; fondo redondo; desechable; sin cierre, 14 ml; 17 x 100 mm	Fisher	14-959-8	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalogId=29104&productId=2771811&distype=0&highlightProductsItemsFlag=Y&fromSearch=1&searchType=PROD&hasPromo=0 Estos se encajan en su lugar en el laberinto en T de fabricación propia y en el
			bolas de algodón para cerrar los viales después del experimento.
Tablero tríptico y tapa			para proporcionar un fondo blanco y una luz homogénea.
			de banco blanca
almohadilla			Cualquier alfombrilla de ratón funciona.
Tela negra de gran tamaño			para cubrir el aparato a contracorriente en respuesta a la fototaxis.
luz blanca fría	Home Depot		1000516563 http://www.homedepot.ca/product/illume-26-fluorescent-plug-in-linear/911423 cualquier luz lineal similar con bombilla fluorescente de color blanco frío a 13-15 W funcionaría