Etiquetado específico de secuencia de ácidos nucleicos y proteínas con metiltransferasas y el cofactor Análogos

Summary

ADN y las proteínas se marcan secuencia específicamente con afinidad o grupos indicadores fluorescentes usando ADN o de proteínas metiltransferasas y análogos sintéticos de cofactor. Dependiendo de la especificidad de cofactor de las enzimas, aziridina o dobles análogos de cofactores activados se emplean para el etiquetado de uno o dos pasos.

Abstract

S -Adenosyl-L-metionina (AdoMet o SAM) metiltransferasas dependientes (MTase) catalizan la transferencia del grupo metilo activado a partir de AdoMet a posiciones específicas en el ADN, ARN, proteínas y pequeñas biomoléculas. Esta reacción de metilación natural puede ampliarse a una amplia variedad de reacciones de alquilación utilizando análogos cofactor sintéticos. La sustitución del centro de sulfonio reactiva de AdoMet con un anillo de aziridina conduce a cofactores que se pueden acoplar con el ADN por varios MTases de ADN. Estos cofactores de aziridina pueden ser equipados con grupos informadores en diferentes posiciones del resto de adenina y se utilizan para S-equence específica M ethyltransferase- I nduced L Abel ING de ADN (DNA sonriendo). Como un ejemplo típico damos un protocolo para la biotinilación de ADN del plásmido pBR322 en la secuencia 5'-ATCG A T-3 'con el MTase M.BseCI ADN y el cofactor aziridina en 6BAzun solo paso. Extensión del grupo metilo activado con grupos alquilo insaturados resultados en otra clase de análogos de AdoMet que se utilizan para m ethyltransferase dirigida TRANSFERENCIA DE UN ctivated rupos G (MTag). Dado que las cadenas laterales largos son activados por el centro de sulfonio y el enlace insaturado, estos cofactores son llamados análogos de AdoMet doble activadas. Estos análogos no sólo funcionan como cofactores para MTases de ADN, como los cofactores de aziridina, sino también para el ARN, proteínas y pequeños MTases molécula. Se utilizan típicamente para la modificación enzimática de sustratos MTase con grupos funcionales únicos que se etiquetan con grupos informadores en una segunda etapa química. Esto se ejemplifica en un protocolo para el marcaje de fluorescencia de la proteína histona H3. Un grupo propargilo pequeña se transfiere desde el SeAdoYn análogo cofactor de la proteína por la histona H3 lisina 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 seguido por clic etiquetado de lahistona H3 alkynylated con TAMRA azida. Etiquetado mediada MTase con análogos cofactor es una tecnología que permite muchas aplicaciones interesantes, como la identificación y el estudio funcional de sustratos MTase así como el genotipado de ADN y detección de metilación.

Introduction

Un etiquetado específico de los ácidos nucleicos y proteínas ^{1,2 3,4} es de gran interés para las caracterizaciones funcionales, diagnóstico médico y (nano) biotecnología. Aquí presentamos un método de marcaje enzimático para estos biopolímeros que se basa en S -adenosyl-l-metionina (AdoMet o SAM) metiltransferasas dependientes (MTases). Esta clase de enzimas (EC 2.1.1.) Se dirige a posiciones individuales nucleófilos (nitrógeno, oxígeno, azufre y átomos de carbono) dentro de los residuos específicos de ácidos nucleicos y proteínas y, naturalmente, transfiere el grupo metilo activado de la AdoMet cofactor (Figura 1A) ^5. ....

Protocol

1. Instrucciones generales

1. Aziridínico tienda cofactor 6BAz (en DMSO) y la proteína MTase Set7 / 9 a -80 ° C y todos los demás reactivos incluidos cofactor doble activado SeAdoYn y ADN MTase M.BseCI (en el 50% de glicerol) a -20 ° C.
2. Determinar la concentración de 6BAz y SeAdoYn mediante espectroscopia UV / Vis utilizando los coeficientes de extinción ε _{269 nm} (6BAz) = 16,000 cm ^-1 M ^-1 y ε _{260 nm} (SeAdoYn) = 15,400 cm ^-1 M ^-1 en agua desionizada. Determinar la concentración de MTases por el ensayo de Bradford o, si el coeficiente de extinción está disponible, a través....

Results

Un paso Etiquetado de ADN a través de aziridina cofactores

Esta reacción se lleva a cabo ejemplo con el ADN MTase M.BseCI, que se modifica el segundo residuo de adenina en el extremo 5 'ATCG A T-3' secuencia de doble cadena y tiene un sitio de reconocimiento en el plásmido pBR322 (Figura 4A). Para probar etiquetado plásmido, pBR322 es desafiado con la endonucleasa de restricción (REase) R.TaqI (5'-TCGA-3 '). R.TaqI tiene siete sitios en pBR322, uno .......

Discussion

Un paso etiquetado de ADN con MTases ADN y cofactores aziridina (ADN sonriendo) es un método robusto pero algunos aspectos se debe considerar al planear el experimento.

Cofactor Aziridine: La concentración 6BAz para el etiquetado de ADN con M.BseCI fue de 60 mM. Cuando se utilizan otros MTases la concentración de ADN cofactor debe optimizarse, por ejemplo, concentraciones tan bajas como 20 mM han sido empleados con el ADN MTase M.TaqI ^19. Las bajas concentracione.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6BAz			Sintetizado según Weinhold et al., Patente número US 8.129.106, publicada el 6 de marzo de 2012.
β-Mercaptoetanol	Serva	28625
Ácido acético	Fisher Scientific	10304980
Acrylamida/Bis Solución, 37.5:1	Serva	10688
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500100
Persulfato de amonio (APS)	Serva	13375
Bis-Tris	Gerbu	1304
Ácido bórico	Gerbu	1115
Azul de bromofenol Sal de Na	Serva	15375
Sulfato de cobre (II)	Aldrich	C1297
Cloroformo	Fisher Scientific	10020090
Coomassie Azul Brillante	Serva	17525
Sal disódica EDTA	Gerbu	1034
Etanol	Merck	100983
GelRed (10.000x en agua)	Biotio	41003
Glicerol (99,5%)	Gerbu	2006
FastRuler Escalera de ADN de bajo rango	Thermo Scientific	SM1103
Histone H3			Expresión plásmido obtenida del Dr. Philipp Voigt y el Prof. Danny Reinberg; expresión y aislamiento según T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311.
M.BseCI			Plásmido de expresión obtenido del Dr. Michael Kokkinidis; expresión y aislamiento según Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14.
Metanol	Fisher Scientific 10675112
Cloruro de magnesio	J.T. Baker	4003
MOPS	Gerbu	1081
Cloruro de sodio	Gerbu	1112
Tira de pH (Neutralit)	Merck	1,095,330,001
pBR322	Thermo Scientific	SD0041
R.TaqI (10 u/µ l)	Thermo Scientific	ER0671
SeAdoYn			sintetizado según Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
Set7/9			Plásmido de expresión obtenido del Prof. Danny Reinberg, expresión y aislamiento según D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489.
Estreptavidina	Gerbu	3058
(+)-L-ascorbato de sodio	Sigma Life Science	A7631
SDS Gerbu		granular 1833
hidrogenofosfato di-sódico	Merck	106,586
TAMRA azida			Sintetizado según la referencia 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
Tampón TaqI (10x)	Thermo Scientific	B28
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED)	Acros Organics	42058
Tris-HCl	Gerbu	1028
Tris-X (TRIS-base)	Gerbu	1018
Tris(3-hidroxipropiltriazolil-metil)amina (THPTA)	Sigma-Aldrich	762342