Después de la exocitosis, la membrana plasmática fusionada se recupera a través de un proceso conocido como endocitosis. Este mecanismo reforma las nuevas vesículas sinápticas para la siguiente ronda de liberación. Los eventos endocíticos individuales se capturan y analizan mediante el uso de los registros de capacitancia adjuntos a la célula en células cromafines suprarrenales de ratón.
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Artículo de método
Los métodos para mediciones de capacitancia celulares inscritos en ratón suprarrenal Cromafín Cell
En este artículo
Resumen
Resumen
La transmisión neuronal es una parte integral de la comunicación celular dentro del cerebro. La despolarización de la membrana presináptica conduce a la fusión de vesículas conocida como exocitosis que media la transmisión sináptica. La recuperación posterior de las vesículas sinápticas es necesaria para generar nuevas vesículas llenas de neurotransmisores en un proceso identificado como endocitosis. Durante la exocitosis, la fusión de las membranas de las vesículas dará lugar a un aumento de la superficie y la endocitosis posterior da lugar a una disminución de la superficie. Aquí, nuestro laboratorio demuestra una introducción básica a los registros de capacitancia conectados a la célula de eventos endocíticos individuales en la célula cromafín suprarrenal del ratón. Este tipo de registro eléctrico es útil para registros de alta resolución de exocitosis y endocitosis a nivel de vesícula única. Si bien esta técnica puede detectar tanto la exocitosis como la endocitosis de vesículas, el enfoque de nuestro laboratorio es la endocitosis de vesículas. Además, esta técnica nos permite analizar la cinética de eventos endocíticos individuales. Aquí se describen los métodos para la disección del tejido de la glándula suprarrenal de ratón, el cultivo de células cromafines, las técnicas básicas de adhesión a células y ejemplos posteriores de trazas individuales que miden eventos endocíticos singulares.
Introducción
La transmisión sináptica es mediada por exocitosis de vesículas sinápticas que contienen neurotransmisores, y estas vesículas debe someterse a endocítica reciclado local dentro de la terminal nerviosa para mantener la comunicación neuronal en el largo plazo. Dado el papel esencial de la transmisión sináptica en el cerebro, la comprensión de la maquinaria molecular que constituye el ciclo de la vesícula sináptica es una base esencial para lograr una mejor comprensión en la comunicación celular en su conjunto. Entre los sistemas modelo de célula, la célula cromafines adrenales ha proporcionado algunas de la visión más definitivo en la maquinaria molecular subyacente de....
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Protocolo
NOTA: Todo el procedimiento se realizó de conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud, aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Illinois en Chicago.
1. Soluciones y Medios de Cultivo Preparados
- Mantenga todas las soluciones a -20 ° C durante un máximo de seis meses. Mantenga los medios de cultivo a 4 ° C durante un máximo de 3 meses.
- Preparar 100 ml de medio de cultivo mediante la mezcla de 1 ml de solución-pen estreptocócica y 1 ml de ITSX (insulina-transferrina-selenio-suplementación) a 100 ml con DMEM.
- Preparar la solución de enzima mediante la me....
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Resultados
La viabilidad celular y la calidad del sello gigaohmio son críticos en la determinación de la calidad de las grabaciones capacitancia de célula-adjunto. Por lo tanto, es fundamental procurar un cultivo celular eficaz y eficiente antes de registros electrofisiológicos y células viables típicos se ilustran en la Figura 1. Práctica y la hora serán útiles en la consecución de un sello gigaohmio con alta calidad. Si uno puede ver claramente la deformación celular cuando la pipeta parche está acercando a la c.......
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Discusión
Mediciones de capacitancia celular conectado requieren varios pasos críticos a fin de recabar las grabaciones de alta calidad: 1) células viables y saludables preparados a partir de las glándulas suprarrenales; 2) recubrimiento PDL de los cubreobjetos; 3) la formación de sello gigaohmio; 4) nivel de ruido del sistema; y 5) de corrección de fase.
Para la cirugía animal, modificaciones potencialmente uno puede hacer es ajustar el abordaje quirúrgico de la mejor destreza traje y para evitar cua.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo está respaldado por un premio de la Fundación Nacional de Ciencias (1145581) a LWG.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | |
| DMEM | 15066024 | Mantener alejado de los rayos UV | |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium | Life Technologies | ||
| Carolina | Biological | 633029 | 12 mm |
| Penicilina Estreptomicina | Life Technologies | 15140122 | 100 ml |
| Insulina-Trans-Sel-X | Life Technologies | 51500056 | ¡Solo descongelar en ICE! |
| Papain | Worthington | 39S11614 | |
| EPC-7 plus amplificador de parche | HEKA | ||
| BNC-2090 placa de adquisición de datos | Instruments | ||
| software de adquisición de datos Igor | Wavemetrics | ||
| P-97 extractor de pipetas | Sutter Instruments | ||
| Microforge | Scientific Instruments | ||
| Capilares de vidrio de borosilicato | Sutter Instruments | B150-110-10 | Diámetro exterior: 1,5 mm Diámetro interior: 1,10 mm Longitud: 10 cm |
Referencias
- Rettig, J., Neher, E. Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis. Science. 298, 781-785 (2002).
- Gong, L. W., et al. Phosphatidylinositol phosphate....
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Reimpresiones y permisos
