Se desarrolla un protocolo para examinar los efectos de un fármaco epigenético DZNep en el desarrollo, la fecundidad y la supervivencia de los mosquitos. Aquí describimos los procedimientos para la exposición acuosa de DZNep a mosquitos inmaduros y una exposición sanguínea de DZNep a mosquitos adultos, además de medir la inhibición de la hidrolasa SAH.
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Artículo de método
Los ensayos toxicológicos para efectos de prueba de un epigenética de Drogas sobre el Desarrollo, Fecundidad y Sobrevivencia de los mosquitos de malaria
En este artículo
Resumen
Resumen
Resistencia insecticida plantea un problema importante para los programas de control de la malaria. Los mosquitos se adaptan a una amplia gama de cambios en el entorno rápidamente, haciendo la malaria controlar un problema omnipresente en los países tropicales. La aparición de poblaciones resistentes a los insecticidas garantiza la exploración de nuevas vías objetivo de drogas y compuestos para el control del mosquito vector. Fármacos epigenéticos están bien establecidos en la investigación del cáncer, sin embargo, no se sabe mucho acerca de sus efectos sobre los insectos. Este estudio proporciona un protocolo sencillo para el examen de los efectos toxicológicos de 3-Deazaneplanocin A (DZNep), un fármaco epigenético experimental para el tratamiento del cáncer, en el vector de la malaria, Anopheles gambiae. Se observó un aumento dependiente de la concentración de la mortalidad y disminución en el tamaño en los mosquitos inmaduros expuestos a DZNep, mientras que el compuesto reduce la fecundidad de mosquitos adultos en relación con los tratamientos de control. Además, hubo una disminución dependiente de la droga en S -adenosilhomocisteına (SAH) la actividad hidrolasa en los mosquitos tras la exposición a DZNep en relación con los tratamientos de control. Estos protocolos proporcionan al investigador un procedimiento simple, paso a paso para evaluar varios puntos finales toxicológicos para una droga experimental y, a su vez, demuestran un enfoque único multi-conductor se utiliza para explorar los efectos toxicológicos de drogas o compuestos de epigenéticos solubles en agua intereses contra los mosquitos vectores y otros insectos.
Introducción
La malaria es responsable del mayor número de muertes relacionadas con insectos en el mundo. Se estima que unos 219 millones de casos cada año se producen en todo el mundo, lo que resulta en aproximadamente 660.000 muertes, principalmente en África 1. A pesar de los esfuerzos concertados, programas contra la malaria se enfrentan a varios retos. Mientras que los mosquiteros tratados con insecticida y componentes clave formulario pulverización residual del programa, la resistencia a los insecticidas en poblaciones locales impiden estos esfuerzos 2. El rápido aumento de las poblaciones de mosquitos resistentes a los insecticidas se atribuye en gran medida a la capacidad de los mosquitos de la malaria para adaptarse rápidamente a los cambios en su entorno y explotar nichos diferentes 3,4,5. Para superar los actuales mecanismos de resistencia a los insecticidas, la exploración de nuevos objetivos insecticidas y compuestos de la próxima generación se justifica. Un protocolo simple, paso a paso para determinar la eficacia de los insecticidas experimentales sobre las diversas etapas de la vida de la malaria mosquitoes mejorarían significativamente estos esfuerzos.
Los estudios farmacológicos de efectos del fármaco sobre las líneas celulares y modelos animales han establecido el uso de fármacos epigenéticos como una herramienta útil para la modulación de la genética y la fisiología de las células y los organismos. Metilación del ADN y modificación de las histonas son dos mecanismos epigenéticos que afectan la expresión génica en los organismos multicelulares sin cambiar la secuencia de ADN subyacente 6. Las modificaciones post traduccionales como la metilación juegan un papel crucial en el mantenimiento de la integridad celular y la expresión génica, y pueden afectar a varios procesos fundamentales 7,8,9. Investigación en algunas especies de insectos han puesto de relieve la importancia de la epigenética en procesos que implican la ovogénesis y células madre de mantenimiento 10, así como la compensación de dosis 11. Sin embargo, están todavía por explorar esos aspectos en los vectores de enfermedades. El uso de un compuesto para modular este sistema en los mosquitos puede proporcionarnos enmonumentos en las nuevas vías de destino insecticida. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) es un inhibidor de la metilación de la histona conocido, que impacto en diversos tipos de cánceres se han estudiado 12,13,14,15,16. DZNep es un fármaco soluble en agua estable epigenética que inhibe indirectamente la lisina de la histona metiltransferasa N (EZH2), un componente del complejo represivo polycomb 2 (PRC2) en células de mamífero. PRC2 juega un papel importante en la regulación del crecimiento de las células madre en los organismos multicelulares, y la metilación de la histona es un aspecto clave de la PRC2 mediada por silenciamiento génico. En ratones inmunodeprimidos, las células pre-tratadas con DZNep han demostrado ser menos tumorígena 17. Esta droga se está utilizado para el estudio de otras enfermedades, como la enfermedad de hígado graso no alcohólico, en el que está implicado EZH2 18. DZNep es un establecido S -adenosylhomocysteine (SAH) inhibidor hidrolasa 19, 20. La inhibición de los resultados de SAH hidrolasa en unaacumulación de SAH y, a su vez, conduce a la inhibición de la actividad metiltransferasa mediante la limitación de los grupos de donantes de metilo disponibles. SAH es un derivado de aminoácido utilizado por muchos organismos, incluyendo los insectos, en sus vías metabólicas. Un estudio reciente ha demostrado que DZNep en dosis bajas pueden afectar la diapausa y retrasar el desarrollo de insectos 21.
Aquí, un protocolo robusto para investigar los efectos de un compuesto soluble en agua en varias etapas de la vida de los mosquitos se desarrolla. Las tres partes de este protocolo incluyen instrucciones para examinar los efectos de un compuesto soluble en agua sobre los mosquitos inmaduros, adultos hembras se alimentan de sangre, y la actividad enzimática de adulto de sexo masculino y los mosquitos hembra. En primer lugar, DZNep se disuelve en agua para estudiar el desarrollo de mosquitos inmaduros y la supervivencia. Esto se realiza a dos concentraciones para comparar las diferencias que surjan de aumento de 10 veces en la exposición al fármaco. Para explorar el efecto de las drogas en adultos hembras de los mosquitos, DZNepse añade a sangre de oveja desfibrilación y alimentados artificialmente la sangre a las hembras. Posteriormente, se examina el resultado de la droga sobre la fecundidad. Finalmente, un ensayo de actividad enzimática se realiza usando 5,5'-ditiobis- (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) como un indicador para determinar el efecto de DZNep en la inhibición de hidrolasa SAH en machos adultos y hembras de los mosquitos. Mientras que este protocolo se desarrolla con un mosquito de la malaria, Anopheles gambiae, puede ser fácilmente adaptado al estudio de los efectos de los compuestos de interés en cualquier especie de mosquito u otros insectos. Las técnicas que se detallan en este protocolo no se pueden aplicar de manera eficiente a un fármaco con poca o ninguna solubilidad en agua o medios acuosos.
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Protocolo
NOTA: Las tres partes del protocolo de describir la exposición acuosa del fármaco DZNep a los mosquitos, larvas de una exposición a base de sangre de DZNep a hembras adultas para estudiar su efecto de fecundidad, y la inhibición de hidrolasa SAH por DZNep midieron usando una técnica colorimétrica simple. Una representación esquemática de estos ensayos se muestra en la Figura 1.
1. inmaduros Mosquito Desarrollo y Sobrevivencia ensayos
NOTA: En esta sección se explica el uso de un fármaco soluble en agua que afecta el desarrollo de larvas de mosquitos y la supervivencia.
- Hatch A. gambiae huevos a 28 ° C en agua destilada (dH2O) y trasera estadio las larvas a 2º.
- Tome un DNAsa seis pocillos, RNAsa placa de cultivo celular libre y verter 10 ml dH2O a cada pocillo.
- Seleccione las larvas de mosquitos en 2º instar y añadir 15 larvas por pocillo. Antes de añadir larvas 2ª a la placa, put en una toalla de papel para 2-3 segundos para eliminar el exceso de agua.
- Pozos de etiquetas con las cintas con códigos de colores para aleatorizar experimento. Etiquetar 2 pocillos por concentración de ensayo en cada placa (Figura 2).
- Preparar un hidrocloruro de 1 mM DZNep (PM = 298,73) solución madre disolviendo 0,3 mg DZNep en 1 ml de dH 2 O. Añadir solución madre de DZNep.HCl a los pocillos marcados para alcanzar una concentración final de 0,5 mM y 5,0 mM.
NOTA: La solución madre se puede almacenar a 4 ° C para el corto plazo (1 día a un mes) o -20 ° C para el largo plazo (más de un mes).
NOTA: La adición de la solución madre para las concentraciones antes mencionadas no va a cambiar el volumen de agua en los pozos de manera significativa. Sin embargo, en caso de concentraciones mucho más altas, es aconsejable para disolver el compuesto en el medio larval para evitar cualquier dilución innecesaria del compuesto. - Añadir la misma cantidad de alimento para peces de escamas a cada pocillo. Cubrir la placas y los incuban a 28 ° C en una incubadora.
- Registre la mortalidad de las larvas de mosquitos DZNep-tratadas y sin tratar después de un período de exposición de 24 horas. Retire y deseche cualquier larvas muertas. Repita esta grabación todos los días hasta que todo larvas mueren o pupar y emerger como adultos. Registre el tamaño de las larvas de cada segundo día, es decir, días 0, 2, 4, 6, 8, hasta que se convierten en crisálidas.
- Analizar el desarrollo y la mortalidad de larvas de datos utilizando un software de análisis estadístico adecuado.
NOTA: Un gráfico de barras puede ser utilizado para representar los datos de mortalidad en Microsoft Excel. Análisis multivariado de varianza (MANOVA) realiza con un software tal como JMP o SPSS revelará si diferentes dosis de la droga como resultado significativamente diferente supervivencia de larvas de mosquitos.
2. La fecundidad de ensayo mediante la administración de drogas a través del alimentador artificial a Femeninos mosquitos
NOTA: En esta sección se detalla la adición del fármaco a la sangre unnd de dársela a los mosquitos hembras adultas utilizando un sistema de alimentación artificial.
- Configure jaulas de mosquitos adultos con igual número de mosquitos machos y hembras para el control y la caja de prueba. Proporcionar una solución de azúcar al 10% impregnado en las bolas de algodón a ambos las jaulas hasta que las hembras están listas para la alimentación (3-5 días es óptimo para Anopheles gambiae).
- 2 horas antes de la alimentación de la sangre, eliminar las bolas de algodón para garantizar hembras tienen hambre.
- Montar dos alimentadores sanguíneos artificiales que consisten en un embudo invertido amplia fondo de vidrio (diámetro = 50 mm, longitud = 70 mm) y un plástico que rodea sellado con pegamento industrial. Conecte los tubos de plástico (diámetro = 7 mm) para dos salidas alimentadores '(diámetro = 10 mm) a través de conectores para entrada y salida de agua. Etiquetar los dos alimentadores como "Control" y "5 mM DZNep."
- El uso de un elemento de calefacción disponible en el mercado, configurar el programa para la alimentación. En "Menú" ir a "Configuración"y seleccione "Consignas"; aparecerán los programas precargados. Seleccione "SP1" y ajustar la temperatura de 37 ° C.
NOTA: El elemento de calentamiento asegura que la sangre administrada se mantiene a una temperatura constante. Ajustes adicionales de programa pueden ser utilizados para diferentes especies de mosquitos o insectos. - Llene un cubo con agua y sumergir el elemento de calefacción en el agua.
- Corte un pedazo cuadrado de Parafilm (50 mm x 50 mm) y se extienden para hacer una película delgada membranosa. Cubrir el fondo de los alimentadores artificiales con el Parafilm. Corte otro pedazo de Parafilm (50 mm x 10 mm), estirar y sellar los bordes de los alimentadores.
- Ensamblar el sistema, la conexión de los alimentadores y elemento de calentamiento por los tubos. Una vez terminado, encienda el sistema y seleccione "SP1". Pulse el botón "Enter" para iniciar el sistema.
NOTA: El agua se calienta a conseguir 37 ° C y se mantiene a esa temperatura. - Monitorear ªtemperatura e de agua usando un termómetro en el cubo de agua.
NOTA: Los conectores y tubos ayudan a mantener una circulación constante de agua a través del sistema de modo que la temperatura de la sangre se mantiene en 37 ° C. - Llene una bandeja de fondo plano con una solución de lejía al 10% que será utilizado para descontaminar cualquier derrame de sangre.
- Añadir 2 ml de sangre de oveja desfibrilar a un tubo de microcentrífuga. Etiquetar esto como "Control". Repita el proceso para el tubo experimental etiquetado como "5 mM DZNep" .Add 6 l de solución madre DZNep (véase el paso 1.5) en el tubo experimental llamado "5 mM DZNep" Mezclar suavemente la sangre y drogas invirtiendo varias veces. Incubar el tubo 10 min a TA.
- Con una pipeta, añadir 2 ml de control y análisis de sangre a la parte superior de los alimentadores correspondientemente etiquetados. Deseche la pipeta en la solución de cloro. Cubra la jaula con una bolsa oscura y respirar aire en jaula periódicamente para fomentar females para la alimentación.
- Deje que los mosquitos se alimentan durante aproximadamente 30 min. Una vez que se haya completado la alimentación, apague el elemento calefactor, tomar los alimentadores y pelar el Parafilm. Remoje el alimentador en la solución de lejía durante unos 5 minutos y enjuagar bien con agua desionizada.
- Quite los alimentadores y poner las bolas de algodón con agua de azúcar en las jaulas durante 48 horas. Publicar un plato de huevos que contiene agua y papel de filtro en las jaulas durante la noche para facilitar la puesta de huevos. Etiqueta de cada plato de huevos con la respectiva concentración de ensayo o de control.
- Retire el plato de huevos al día siguiente y examinar el número y la estructura de los huevos en un microscopio estéreo. Obtener imágenes mediante el software Q-colors5. Cuente el número de huevos. Analizar la diferencia en el número de huevos obtenidos de jaulas de ensayo y de control.
NOTA: Una prueba t no pareada se puede utilizar para determinar si el número de huevos son significativamente diferentes (p ≤0.05).
3. Ensayo bioquímico de Mosquito Enzyme Inhibitionpor Drogas
NOTA: En esta sección se describe un ensayo de actividad enzimática utilizando DTNB como indicador para determinar el efecto de DZNep sobre la inhibición hidrolasa SAH en machos adultos y hembras de los mosquitos.
- Preparar un M Na 2 HPO 4 solución (fosfato de sodio dibásico) 0,1 mediante la adición de 14,19 g de Na 2 HPO 4 a 1 l de dH 2 O. A continuación, preparar un M NaH 2 PO 4 solución (fosfato de sodio monobásico) 0,1 mediante la adición de 13,79 g de NaH 2 PO 4 a 1 l de dH 2 O.
- Valorar el M Na solución 0,1 2 HPO 4 con el 4 solución 0,1 M NaH 2 PO a pH 8,5.
NOTA: Este será la solución madre de trabajo de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). - Preparar una solución de homogeneización de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) mediante la adición de 0,3% Triton X-100.
NOTA: La solución de homogeneización se puede almacenar a 4 ° C. - Prepare un 1,6 mM SAH (PM = 384,4) solución disolviendo 6,15 mg de HSA en 10 ml de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5).
- Preparar una solución 1,6 mM DTNB (PM = 396,4) disolviendo 6,3 mg de DTNB en 10 ml de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). Mantenga la solución DTNB fresco en hielo hasta su uso.
- Preparar una solución 1 mM DZNep.HCl (PM = 298,73) disolviendo 0,3 mg de DZNep en 1 ml de dH2O A continuación, se diluye la solución 1 mM DZNep en una serie de concentraciones de 1,000 M a 0,002 mM en dH 2 O.
- Para medir la inhibición de hidrolasa SAH por DZNep, preparar un extracto de enzima en bruto de mosquitos: Homogeneizar 10 mosquitos adultos no sanguíneos alimentado en 1 ml de helado 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), que contiene 0,3% de Triton X- 100, utilizando un homogeneizador de tejidos de vidrio. Transferir el homogenado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Centrifugar el homogeneizado durante 5 min a 10.000 xg a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un limpia1,5 ml tubo de microcentrífuga. Utilice el sobrenadante como la fuente de enzima para el ensayo bioquímico SAH.
- Para el tratamiento en blanco (es decir, no DZNep, sin enzima), añadir 50 l mM SAH 1,6, 50 mM DTNB 1,6 l, y 100 l 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) a los pocillos individuales de una de 96 pocillos, microplaca de fondo plano.
- Para el control (es decir, no DZNep), añadir 50 l mM SAH 1,6, 50 mM DTNB 1,6 l, 50 l 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) y 50 l de la enzima (SAH hidrolasa obtiene a partir de extracto bruto) para el individuo pozos.
- Para los tratamientos DZNep, añadir 50 l mM SAH 1,6, 50 mM de DTNB 1,6 l, seleccionado concentración DZNep 50 l enzima y 50 l a pocillos individuales. Preparar 4 réplicas por tratamiento y control.
- Leer la densidad óptica (OD) de las muestras de enzima SAH a 405 nm durante 5 minutos a intervalos de 20 seg usando un lector de microplaca de 96 pocillos.
- Reste la DO en blanco del control de unnd tratamiento DO obtenida de cada pocillo. Se calcula el porcentaje restante actividad hidrolasa SAH usando la siguiente ecuación:% de actividad residual = (OD Tratamiento / Control OD) x 100.
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Resultados
La Figura 1 es una representación esquemática de los ensayos; que describe las diversas etapas del procedimiento indicado en este artículo. A medida que el protocolo se basa en diferentes etapas de la vida de los mosquitos, no hay una secuencia particular que deba seguirse para los experimentos se detallan aquí. El usuario puede elegir para llevar a cabo uno o más ensayos al mismo tiempo, dependiendo de la disponibilidad de la muestra.
La figura 2 mue...
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Discusión
Hay varios pasos vitales para la aplicación exitosa de este protocolo. Para el ensayo de las larvas, se debe tener cuidado para etiquetar y replicar cada concentración de ensayo correctamente. La aleatorización de las muestras de ensayo y la adición de la cantidad designada de fármaco a los pocillos de ensayo respectivos es una parte importante de este montaje experimental. Antes de añadir 2º larvas de mosquitos instar a una microplaca de 96 pocillos, cada larva se puede poner en una toalla de papel para 2-3 ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Víctor Márquez por proporcionar DZNep.HCl y a Scotty Bolling por fabricar los alimentadores de sangre. Las cepas Mopti y SUA2La de An. gambiae se obtuvieron del Centro de Recursos de Investigación y Reactivos de Referencia contra la Malaria (MR4). Este trabajo contó con el apoyo del Instituto Fralin de Ciencias de la Vida y la subvención de los Institutos Nacionales de Salud 1R21AI094289 a Igor V. Sharakhov.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microplaca de 96 pocillos | Fisher Scientific | 12565561 | |
| Placa de cultivo celular | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Centrífuga | Sorvall Fresco 76003758 | Se puede utilizar una centrífuga diferente | |
| Rollos de cinta de colores | Fisher | S68134 | |
| Microscopio de disección | Olympus | SZ | |
| DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
| DZNep.HCl | Sigma Aldrich SMLO305 | ||
| Hueveras Papeles de | |||
| filtro | Fisher | 09-795E | |
| Alimentadores de vidrio | Virginia Tech | ||
| Homogeneizador | |||
| Elemento calefactor | Fisher Scientific | NC0520091 | |
| Incubadora | Percival scientific | I36VLC8 | Se puede utilizar una incubadora diferente |
| Tubo de microcentrífuga, 2 ml | Axygen | 22-283 | |
| Tubo de microcentrífuga, 1,5 ml | Micropipeta Axygen | MCT-150-C | |
| Eppendorf | 4910 000.069 | ||
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
| Medidor de pH | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
| Lector de placas | Spectramax | M2 | |
| SAH | Sigma Aldrich | A9384 | tienda en -20 ° C |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
