Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

Summary

Los principales tipos de células adherentes derivadas del músculo humano son las células miogénicas y los fibroblastos. Aquí, las poblaciones celulares se enriquecen mediante la clasificación de células activadas magnéticamente basadas en el antígeno CD56. El posterior inmunomarcaje con anticuerpos específicos y el uso de técnicas de análisis de imagen permiten cuantificar las características citoplasmáticas y nucleares de las células individuales.

Abstract

La reparación y la regeneración del músculo esquelético requiere la acción de las células satélite, que son las células madre de músculo residente. Estos se pueden aislar a partir de muestras de biopsia de músculo humano usando digestión enzimática y sus propiedades miogénicas estudiados en cultivo. Cuantitativamente, los dos principales tipos de células adherentes obtenidas a partir de la digestión enzimática son: (i) las células satélite (denominadas células miogénicas o células precursoras del músculo), identificado inicialmente como CD56 ⁺ y más tarde como desmina ⁺ / CD56 ⁺ células y (ii) músculo- fibroblastos derivados, identificadas como CD56 ^- y TE-7 ^+. Los fibroblastos proliferan de manera muy eficiente en la cultura y en las poblaciones de células mixtas estas células pueden invadir células miogénicas de dominar la cultura. El aislamiento y purificación de diferentes tipos de células de músculo humano es por lo tanto una consideración metodológica importante cuando se trata de investigar el comportamiento innato de cualquiera de los tipos de células en cultivo. Aquí DescrIbe un sistema de clasificación basada en la digestión enzimática suave de las células utilizando colagenasa y dispasa seguido por clasificación magnética de células activadas (MACS), que da a la vez una alta pureza (> 95% de células miogénicas) y buen rendimiento (~ 2,8 x 10 ⁶ ± 8,87 x 10 ⁵ células / g de tejido después de 7 días in vitro) de experimentación en la cultura. Este enfoque se basa en la incubación de la población de células derivadas de músculo mezclado con microperlas perlas magnéticas conjugadas con un anticuerpo contra CD56 y luego pasar las células a través de un campo magnético. Células CD56 ⁺ unidos a microperlas son retenidos por el campo mientras que CD56 ^- células pasan sin impedimentos a través de la columna. Las suspensiones celulares de cualquier etapa del proceso de clasificación pueden ser en placas y se cultivaron. A raíz de una intervención dada, la morfología celular, y la expresión y localización de proteínas, incluyendo factores de transcripción nuclear puede cuantificarse utilizando el etiquetado de inmunofluorescencia con anticuerpos específicos y una imagen Processing y el paquete de análisis.

Introduction

La reparación y la regeneración del músculo esquelético requiere la acción de las células satélite ^1, las células madre miogénicas ^2,3. In vivo estas células existen en un estado quiescente reversible situado entre el sarcolema y la lámina basal de cada miofibrillas, pero se activan para proliferar, fusibles y diferenciarse como el tejido muscular están dañados, reparar y regenerar ^3. Las células satélite se pueden aislar a partir de muestras de biopsia de músculo humano joven y de edad avanzada utilizando digestión enzimática ⁴ y sus propiedades miogénicos posteriormente se pueden estudiar en la cultura primaria <....

Protocol

NOTA: Para los estudios realizados en nuestro laboratorio de todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito para participar y todos los experimentos se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Ética de Servicio Nacional de Salud del Reino Unido (Comité Ético de Investigación Londres; referencia: 10 / H0718 / 10) y de acuerdo con la Ley de Tejidos Humanos y la Declaración de Helsinki.

1. Preparación inicial antes de la biopsia muscular (15 min)

1. Hacer medio de crecimiento de músculo esquelético humano. Para un tubo cónico de 50 ml estéril graduado añadir 2,5 ml de la mezcla de suplemento, 10 ml de suero d....

Results

Células miogénicas y fibroblastos purificadas pueden ser cultivadas en un medio de diferenciación adipogénica durante tres días seguidos por medio de la nutrición adipogenic desde cualquier lugar entre 7-30 días para evaluar su potencial para la adipogénesis. Uso de las poblaciones de células purificadas, la tinción con Oil Red O en combinación con inmunotinción para marcadores de linaje adipogénicos y miogénicas mostró que sólo la fracción de fibroblastos era capaz de diferenciación adipogénica (Figura 2).

Discussion

Hemos descrito un procedimiento de clasificación immunomagentic para el enriquecimiento selectivo de precursores derivadas de músculo humanos a partir de pequeñas muestras de material de biopsia muscular. Esta técnica ha sido muy valiosa en nuestro laboratorio para superar la pérdida de cultivos de músculo humanos derivados de los fibroblastos, sino también para la comprensión del comportamiento único de poblaciones distintas de células progenitoras derivadas de músculo. Células miogénicas Una vez purificados pueden ser.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Colagenasa  D	Roche
Dispasa II	Sigma	D4693-1G	Debe ser esterilizado con filtro antes de usar
Tripsina/EDTA	(Gibco) Invitrogen	15400-054
100 μ filtro de células m	BD Biosciences	352360
Solución de colágeno (3 mg/ml en ácido acético al 0,1%)	Sigma, Dorset, Reino Unido	C8919
Filtro de jeringa Minisart SRP15 (0.2 μ m)	Sartorius	17573ACK	Membrana de politetrafluoretileno (PTFE)
CD56 microperlas humanas	Miltenyi Biotech	130-050-401	Tenga en cuenta la vida útil limitada de las microperlas
Microperlas anti-fibroblastos humanas	Miltenyi Biotech	130-050-601
40 μ m Filtros de preseparación	Miltenyi Biotech	130-041-407
Columnas de células grandes	Miltenyi Biotech	130-042-202	Estas columnas vienen con una resistencia de flujo. El uso de la resistencia de flujo no es necesario para obtener las altas purezas miogénicas descritas aquí.
Columnas LS	Miltenyi Biotech	130-042-401
MiniMacs Separador	Miltenyi Biotech	130-042-102	Este separador se adapta a la columna de celdas grandes pero no a la columna LS.
MidiMACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
BSA	Sigma		Debe ser esterilizado con filtro antes de usar
Aceite Red O	Sigma	O0625
Fosfato de trietilo	Sigma 538728
Whatman Paper	Sigma	Z241121-1PAK	Nº 42, Sin cenizas. Para preparar el filtro, dobla el papel de filtro circular para hacer un semicírculo, luego vuelve a doblar el semicírculo por la mitad para formar un cono. Coloque el cono en un embudo para filtrar.
de reactivo antidecoloración ProLong Gold	, Invitrogen	P36930	Esto se puede comprar con o sin DAPI y no apaga la fluorescencia inicial.
AxioVision	Carl Zeiss	Contacto Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended	Adobe (comprado en Pugh Computers)	ADPH16982*