Desarrollamos un protocolo de hibridación fluorescente in situ (FISH) fluorescente específico de cadena fácilmente personalizable combinado con inmunofluorescencia. Esto permite un examen detallado de la dinámica del ARN con información simultánea sobre la estructura de la cromatina, la organización nuclear y la regulación transcripcional a nivel de célula individual.
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Artículo de método
Fluorescente Rápida In Situ Protocolo de hibridación para Xist ARN combinado con inmunofluorescencia de histona Modificación de inactivación del cromosoma X.
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En este artículo
Resumen
Resumen
La combinación de ARN hibridación in situ fluorescente (FISH) con inmunofluorescencia (inmuno-FISH) crea una técnica que se puede emplear en el nivel de células individuales para detectar la dinámica espacial de la localización del ARN con la penetración simultánea en la localización de las proteínas, las modificaciones epigenéticas y otros detalles que puede ser resaltado mediante inmunofluorescencia. Inactivación del cromosoma X es un paradigma para largo ARN no codificante (lncRNA) mediada por silenciamiento génico. Transcripción específico (Xist) la acumulación lncRNA-X inactivo (llamado una nube de Xist) sobre uno de los dos cromosomas X en las hembras de mamíferos es un paso crítico para iniciar X-inactivación del cromosoma. ARN Xist interactúa directamente o indirectamente con diversas enzimas de la cromatina modificar y presenta distintos paisajes epigenéticos al cromosoma X inactivo (Xi). Una conocida seña de identidad de la epigenética Xi es la histona H3 trimetil-lisina 27 (H3K27me3) modificación. A continuación, describimos una forma sencilla y rápida inmuno-FISHProtocolo para la detección de Xist ARN utilizando ARN FISH con múltiples sondas de oligonucleótidos junto con inmunofluorescencia de H3K27me3 a examinar la localización de Xist ARN y modificaciones epigenéticas asociadas. El uso de sondas de oligonucleótidos resultados en un tiempo de incubación más corto y la detección más sensible de Xist ARN en comparación con el transcrito in vitro sondas de ARN (ribosondas). Este protocolo proporciona una poderosa herramienta para la comprensión de la dinámica de lncRNAs y su modificación epigenética asociada, la estructura de la cromatina, organización nuclear y la regulación transcripcional.
Introducción
Mamíferos inactivación del cromosoma X (XCI) es una estrategia para compensar el desequilibrio en la dosificación del gen ligado al cromosoma X entre XX y XY, en el que uno de los dos cromosomas X en las mujeres es transcripcionalmente inactiva 1. Inactivación del cromosoma X es un gran modelo para el sistema a largo ARN no codificante (lncRNA) investigación. Inactivación del cromosoma X está regulado por múltiples lncRNAs, y ha sido ampliamente estudiado en los últimos decenios para descubrir los mecanismos de diafonía entre lncRNAs, transcripción, estructura de la cromatina y la organización nuclear 2, 3.
El centro....
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Protocolo
1. Preparación de la sonda
- Obtener múltiples oligonucleótidos únicos en Xist (oligonucleótidos 20-30 nucleótidos de longitud, 63-65 ºC de temperatura de fusión, Tabla 1) con una modificación 5'-amino y suspender en agua.
- Piscina cantidades equimolares de los oligonucleótidos con 5'-amino modificación (en total 4,5 g) y la etiqueta con colorante fluorescente-amina reactiva siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Disolver los oligonucleótidos agrupados en últimos 5 l de agua libre de nucleasa y añadir 3 l de 1 M de bicarbonato de sodio a la solución de oligonucleótidos.
- Añadir 2 l DMSO al vial de tint....
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Resultados
Imágenes representativas de rápida inmuno-FISH se muestran en la Figura 1A. Se detectó co-localización de la nube y H3K27me3 señal de Xist ARN en el Xi en la diferenciación de las células femeninas. Al día 12 de la diferenciación, más del 90% de las células EB tenía una nube Xist (Figura 1B). Sondas de oligonucleótidos corto penetraron de manera eficiente en los núcleos, que conduce a una visualización de casi todas las señales H3K27me3 co-localizada con Xist ARN (Figura 1C;
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Discusión
En este trabajo, hemos presentado un protocolo de inmuno-FISH rápida que tarda menos de 5 horas para completar la preparación de diapositivas, Xist ARN FISH, y la inmunofluorescencia para H3K27me3. En comparación con el enfoque general de inmuno-FISH para Xist ARN de detección, que por lo general tiene una noche de incubación de ARN FISH, este protocolo no sólo reduce significativamente el tiempo pasado sino que también mejora la sensibilidad inmune-FISH usando sondas de oligonucleótidos.
De.......
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Divulgaciones
No se declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a Hongjae Sunwoo por sus útiles consejos para el diseño de oligonucleótidos en ARN FISH. También agradecemos a Serenity Curtis por editar el manuscrito. N.Y. contó con el apoyo de una beca postdoctoral para investigación en el extranjero de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS). Este trabajo contó con el apoyo de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH, por sus siglas en inglés) (RO1-GM102184), la Fundación de Investigación de March of Dimes (#6-FY12-337) y el Fondo de Desarrollo y Subvención Fiduciaria del Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati a Y.O.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| oligonucleótidos con modificación de 5'-amino | IDT | ||
| Alexa Fluor 488 Colorante reactivo | Life Technologies | A32750 | |
| MicroSpin G-25 columnas | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| Cytospin 2 | Shandon | 59900102 | |
| Albúmina sérica bovina, grado de biología molecular (para tampón de hibridación) | Roche | ||
| Anticuerpo de histona H3K27me3 | Active Motif | 61017 | |
| Alexa Fluor 555 Cabra Anti-Ratón, altamente adsorbido | cruzado Life Technologies | A21424 | |
| ProLong Gold reactivo antidecoloración | Life Technologies | P36931 |
Referencias
- Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
- Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control.
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Reimpresiones y permisos
