Desarrollamos un protocolo de hibridación fluorescente in situ (FISH) fluorescente específico de cadena fácilmente personalizable combinado con inmunofluorescencia. Esto permite un examen detallado de la dinámica del ARN con información simultánea sobre la estructura de la cromatina, la organización nuclear y la regulación transcripcional a nivel de célula individual.
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Artículo de método
Fluorescente Rápida In Situ Protocolo de hibridación para Xist ARN combinado con inmunofluorescencia de histona Modificación de inactivación del cromosoma X.
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Resumen
Resumen
La combinación de ARN hibridación in situ fluorescente (FISH) con inmunofluorescencia (inmuno-FISH) crea una técnica que se puede emplear en el nivel de células individuales para detectar la dinámica espacial de la localización del ARN con la penetración simultánea en la localización de las proteínas, las modificaciones epigenéticas y otros detalles que puede ser resaltado mediante inmunofluorescencia. Inactivación del cromosoma X es un paradigma para largo ARN no codificante (lncRNA) mediada por silenciamiento génico. Transcripción específico (Xist) la acumulación lncRNA-X inactivo (llamado una nube de Xist) sobre uno de los dos cromosomas X en las hembras de mamíferos es un paso crítico para iniciar X-inactivación del cromosoma. ARN Xist interactúa directamente o indirectamente con diversas enzimas de la cromatina modificar y presenta distintos paisajes epigenéticos al cromosoma X inactivo (Xi). Una conocida seña de identidad de la epigenética Xi es la histona H3 trimetil-lisina 27 (H3K27me3) modificación. A continuación, describimos una forma sencilla y rápida inmuno-FISHProtocolo para la detección de Xist ARN utilizando ARN FISH con múltiples sondas de oligonucleótidos junto con inmunofluorescencia de H3K27me3 a examinar la localización de Xist ARN y modificaciones epigenéticas asociadas. El uso de sondas de oligonucleótidos resultados en un tiempo de incubación más corto y la detección más sensible de Xist ARN en comparación con el transcrito in vitro sondas de ARN (ribosondas). Este protocolo proporciona una poderosa herramienta para la comprensión de la dinámica de lncRNAs y su modificación epigenética asociada, la estructura de la cromatina, organización nuclear y la regulación transcripcional.
Introducción
Mamíferos inactivación del cromosoma X (XCI) es una estrategia para compensar el desequilibrio en la dosificación del gen ligado al cromosoma X entre XX y XY, en el que uno de los dos cromosomas X en las mujeres es transcripcionalmente inactiva 1. Inactivación del cromosoma X es un gran modelo para el sistema a largo ARN no codificante (lncRNA) investigación. Inactivación del cromosoma X está regulado por múltiples lncRNAs, y ha sido ampliamente estudiado en los últimos decenios para descubrir los mecanismos de diafonía entre lncRNAs, transcripción, estructura de la cromatina y la organización nuclear 2, 3.
El centro de la inactivación X (XIC), ubicado en el cromosoma X es un locus genético complejo compuesto de un número de genes que producen ARN no codificantes 4. -X inactivo transcripción específico (Xist) lncRNA en los mamíferos euterios es uno de esos lncRNA que desempeña un papel crucial en la inactivación del cromosoma X 5,6. Transcripciones Xist rodean la ubicación de la futura Xi para iniciar inactivación del cromosoma X, y aparece como una nube cuando se visualizan utilizando ARN FISH; esta formación se denomina como el "Xist nube" 7. Desde Xist ARN interactúa con varias enzimas de modificación de la cromatina, se observa co-localización de las nubes Xist con diferentes modificaciones epigenéticas de la cromatina y la transcripción en silencio durante represivo X-inactivación del cromosoma 8. Por ejemplo, Xist ARN interactúa con polycomb complejo represivo 2 (PRC2) que es responsable de H3K27me3 e induce un estado represivo cromatina 9. La aparición de la nube Xist en el Xi y su co-localización con la modificación intensiva H3K27me3 representa un paisaje heterocromatina facultativa de la Xi 10,11.
Técnicas citogenéticas, como el ADN / ARN FISH han recorrido un largo camino desde el método tradicional utilizando sondas radiomarcado 12 a las técnicas más recientes y avanzados con mayor sensibilidad yimágenes fluorescentes utilizando múltiples sondas de oligonucleótidos 13,14. ADN / ARN FISH junto con inmunofluorescencia se ha utilizado de forma rutinaria como una herramienta citológico de entender la organización espacio-temporal nuclear, la localización del ARN, la estructura de la cromatina y modificaciones. La preparación de la sonda estándar de la mayoría de ARN FISH implica el uso de plásmido o cromosoma artificial (BAC) clones bacterianos y su posterior etiquetado ya sea con la traducción nick o cebado aleatorio 15. Sin embargo, casi el 70% de los genes en ratones y 40% de los genes en los seres humanos muestran una superposición de sentido y antisentido transcripciones 16, por lo que requieren un método FISH específica de hebra a fin de distinguir sentido y antisentido transcripciones. In vitro sondas de ARN transcritos (ribosonda ) se utilizan a menudo para el capítulo específico de ARN FISH 17,18; sin embargo, esto implica la preparación de un clon de plásmido o producto de PCR con T7, SP6, o el promotor T3 y sintetizar ribosondas. Además, ribosondas derivado de genomaic ADN o ADNc a menudo contienen regiones no específicas y elementos repetitivos, que resultan en alto ruido de fondo. Otra cuestión es que ribosondas, que son unos pocos cientos de nucleótidos de longitud y contienen múltiples fluoróforos, no pueden penetrar de manera eficiente en el núcleo. Para evitar esto, múltiples sondas de oligonucleótidos más cortos marcados con un solo fluoróforo en el extremo han sido desarrollados que tienen una buena sensibilidad, potencia de la señal uniforme, y la facilidad de purificación y el manejo de 14. Además, los oligonucleótidos de ADN son generalmente más estable que el ARN. Se aplicó una estrategia similar de utilizar oligonucleótidos en Xist ARN FISH 19 con inmunofluorescencia para comprender la dinámica epigenéticas de la Xi inducidos por Xist lncRNA durante el proceso de inactivación del cromosoma X. Este protocolo describe la creación de sondas de oligonucleótidos y la preparación apropiada de las células, así como la utilización de inmunofluorescencia y ARN FISH. Xist ARN FISH utilizando múltiples oligonucleOtides es enfoque rentable en el largo plazo si Xist ARN FISH se realiza de forma rutinaria en el laboratorio de uno. Esta técnica se puede utilizar para identificar lncRNAs en las células mientras que la cartografía simultáneamente su co-localización con modificaciones o factores epigenéticos. Una ventaja importante del protocolo es la capacidad de modificar fácilmente para adaptarse a los propios intereses de investigación.
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Protocolo
1. Preparación de la sonda
- Obtener múltiples oligonucleótidos únicos en Xist (oligonucleótidos 20-30 nucleótidos de longitud, 63-65 ºC de temperatura de fusión, Tabla 1) con una modificación 5'-amino y suspender en agua.
- Piscina cantidades equimolares de los oligonucleótidos con 5'-amino modificación (en total 4,5 g) y la etiqueta con colorante fluorescente-amina reactiva siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Disolver los oligonucleótidos agrupados en últimos 5 l de agua libre de nucleasa y añadir 3 l de 1 M de bicarbonato de sodio a la solución de oligonucleótidos.
- Añadir 2 l DMSO al vial de tinte y de vórtice-amina reactiva brevemente.
- Mezclar la solución de oligonucleótido con el colorante reactivo en DMSO y se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad.
- Purificar las sondas de oligonucleótidos marcados con fluorescencia por la columna G-25 seguido por precipitación con etanol.
- Centrifugar la columna G-25 a 750 xg durante 1 min para eliminar el exceso de tampón de almacenamiento.
- Añadir 40 l de agua libre de nucleasa a la mezcla de etiquetado producido en la Etapa 1.2.3 y aplicar a la columna G-25. Centrifugar a 750 xg durante 2 min.
- Añadir 50 l de agua libre de nucleasa, 10 l 3 M acetato de sodio (pH 5,2) y 250 l de etanol a la sonda purificada de la etapa 1.3.2. Conservar a -80 ° C durante 30 minutos y se centrifuga a 21.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Lavar los oligonucleótidos precipitados una vez con 1 ml de etanol al 70%.
- Vuelva a suspender en 50 l de agua libre de nucleasa o TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; EDTA 1 mM) para una concentración final de aproximadamente 10 mM.
- Diluir las sondas de oligonucleótidos marcados con fluorescencia a una concentración final de 250 nM con tampón de hibridación (10% formamida; 2x SSC [NaCl 300 mM; citrato de sodio 30 mM]; 2 mg / ml BSA; sulfato de dextrano al 10%).
NOTA: Con este protocolo FISH rápida, oligonucleótido pbatas en Xist fueron diseñados y utilizados a una concentración mayor que el protocolo normal de FISH usando sondas de oligonucleótidos con el fin de acortar el tiempo de incubación para la hibridación.
2. Preparación de los portaobjetos
NOTA: Los portaobjetos se puede preparar para la inmuno-FISH utilizando madre de ratón embrionarias (ES) o el cuerpo embrioide (EB) diferenciación de las células 20, 21 ya sea por crecimiento de ellos directamente en un portaobjetos tratados con poli-lisina o utilizando cytospin con suspensión celular. Aquí, se muestra la preparación de diapositivas cytospin.
- Aspirar el medio de cultivo en una placa de 6 pocillos. Lavar con PBS (temperatura ambiente), y aspirar a fondo.
- Añadir 0,5 ml de tripsina al plato de 6 pocillos, se incuba durante 5-10 minutos a 37 ° C.
- Añadir 5 ml de medio y dispersar las células pipeteando suavemente hacia arriba y abajo varias veces.
- Transferir las células a un tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 min a 200 xg a temperatura ambiente.
- Deseche el medio de unad suspender suavemente las células en 2 ml de PBS.
- Contar las células usando un hemocitómetro, y se diluye la suspensión celular en 4 x 10 5 células / ml de PBS.
- Montar una diapositiva, una tarjeta de filtro y una cámara con un clip y colocarlos en las ranuras correspondientes en el rotor de la cytospin. Añadir 250 l de cada muestra preparada en el paso 2.6 en cada cámara de las unidades ensambladas en el cytospin. Centrifugar a 1500 rpm durante 10 min a temperatura ambiente.
- Llenar 3 frascos de Coplin en hielo con 40 ml cada uno de tampón PBS, CSK enfriado con hielo (tubos 10 mM, pH 6,8; NaCl 100 mM; sacarosa 300 mM; 3 mM de MgCl 2), y de amortiguamiento CSKT (tampón CSK con 0,5% Triton X-100), respectivamente.
- Después de que se terminó la cytospin, transferir rápidamente el portaobjetos en PBS enfriado con hielo y se incuba durante 5 min.
- Transferir el portaobjetos en tampón de CSK enfriado con hielo y se incuba durante 1 min.
- Transferir el portaobjetos en tampón de CSKT enfriado con hielo y se incuba durante 5 min.
- Transferir el portaobjetos de nuevo en helada CSK buffer e incubar durante 1 min.
- Transferir el portaobjetos en 4% de paraformaldehído en PBS y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente.
3. La inmunofluorescencia
- Colocar los portaobjetos en un tarro Coplin con PBST (1x PBS con 0,1% de Tween-20) durante varios segundos.
- Colocar los portaobjetos en una inclinación que permite buffer restante a fluir por el tobogán. Limpie cuidadosamente el exceso de líquido fuera de la diapositiva y colocarla en una caja de pipeta de punta vacío con agua. Superposición de la diapositiva con 40 l de solución de bloqueo (1x PBS, 1% de BSA, 0,1% de Tween-20), colocar suavemente un cubreobjetos, y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente.
- Retire el cubreobjetos, eliminar la solución de bloqueo, y añadir 40 l de anticuerpo primario diluido H3K27me3 histona a una concentración de 1: 500 en solución de bloqueo. Coloque el cubreobjetos de nuevo en el porta y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente.
NOTA: Un inhibidor de RNasa en la solución de bloqueo podría ser útil para preservar ARN en este ARN FISProtocolo H cuando se utilizan anticuerpos policlonales. - Lave deslice 2 veces en frascos Coplin llenos de PBST, durante 5 minutos cada uno, agitando suavemente durante el lavado.
- Colocar los portaobjetos en una inclinación que permite buffer restante a fluir por el tobogán. Limpie cuidadosamente el exceso de líquido y coloque el portaobjetos de nuevo en la caja de propina. Superposición con 40 l de anticuerpo secundario (1: 500) diluido en solución de bloqueo, colocar un cubreobjetos, y se incuba durante 15 min en la oscuridad. Para los pasos siguientes, mantenga la diapositiva en la oscuridad en todo momento.
- Lavar 2 veces en Coplin frascos con PBST como en el paso 3.4.
4. ARN FISH con sondas de oligonucleótidos
- Pre-calentar un cuadro de pipeta de punta vacío con agua en la parte inferior para evitar que las diapositivas de secado a 37 ° C para el ARN FISH en el paso 4.3.
- Colocar los portaobjetos en una inclinación que permite buffer restante a fluir por el tobogán. Limpie cuidadosamente el exceso de líquido fuera de la diapositiva desde el paso 3.6 y colocar la placa en la caja de pipeta de punta con water en la parte inferior. Añadir 500 l de tampón de lavado FISH (10% de formamida en 2x SSC) en la diapositiva y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente.
- Retire la solución de lavado FISH, añadir 8 l de sondas de oligonucleótidos en la diapositiva, coloque una hoja de la cubierta, y la transferencia de la diapositiva a una caja de pipeta de punta pre calentado con agua en el fondo; incubar a 37 ° C durante 1-2 horas.
- Coloque 3 frascos pre-calentado Coplin en un baño de agua a 37 ° C con tampón de lavado FISH, FISH tampón de lavado con DAPI, y 2x SSC.
- Después de 1-2 horas de incubación de ARN FISH, poner la diapositiva en el tampón de lavado FISH precalentado.
- Incubar el portaobjetos durante unos minutos hasta que el cubreobjetos se cae de la diapositiva.
- Colocar el portaobjetos de nuevo en el tampón de lavado, y continuar la incubación durante 5 min.
- Transferir la diapositiva a otra jarra Coplin con tampón de lavado pre-calentado FISH con 0,5 ng / ml DAPI y se incuba durante 5 min.
- Transferir la diapositiva a otra jarra Coplin con pre-calentado 2x SSC y se incuba durante 5 millasn.
- Colocar los portaobjetos en una inclinación que permite buffer restante a fluir por el tobogán. Limpie cuidadosamente el exceso de líquido y coloque el portaobjetos de nuevo en una caja de punta seca. Añadir 4 l de antifade con DAPI sobre el portaobjetos y colocar un cubreobjetos.
- Sellar el cubreobjetos con esmalte de uñas y observar con un microscopio. La corredera se puede almacenar a 4 ° C en la oscuridad durante unos pocos meses.
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Resultados
Imágenes representativas de rápida inmuno-FISH se muestran en la Figura 1A. Se detectó co-localización de la nube y H3K27me3 señal de Xist ARN en el Xi en la diferenciación de las células femeninas. Al día 12 de la diferenciación, más del 90% de las células EB tenía una nube Xist (Figura 1B). Sondas de oligonucleótidos corto penetraron de manera eficiente en los núcleos, que conduce a una visualización de casi todas las señales H3K27me3 co-localizada con Xist ARN (Figura 1C;
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Discusión
En este trabajo, hemos presentado un protocolo de inmuno-FISH rápida que tarda menos de 5 horas para completar la preparación de diapositivas, Xist ARN FISH, y la inmunofluorescencia para H3K27me3. En comparación con el enfoque general de inmuno-FISH para Xist ARN de detección, que por lo general tiene una noche de incubación de ARN FISH, este protocolo no sólo reduce significativamente el tiempo pasado sino que también mejora la sensibilidad inmune-FISH usando sondas de oligonucleótidos.
De...
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Divulgaciones
No se declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a Hongjae Sunwoo por sus útiles consejos para el diseño de oligonucleótidos en ARN FISH. También agradecemos a Serenity Curtis por editar el manuscrito. N.Y. contó con el apoyo de una beca postdoctoral para investigación en el extranjero de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS). Este trabajo contó con el apoyo de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH, por sus siglas en inglés) (RO1-GM102184), la Fundación de Investigación de March of Dimes (#6-FY12-337) y el Fondo de Desarrollo y Subvención Fiduciaria del Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati a Y.O.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| oligonucleótidos con modificación de 5'-amino | IDT | ||
| Alexa Fluor 488 Colorante reactivo | Life Technologies | A32750 | |
| MicroSpin G-25 columnas | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| Cytospin 2 | Shandon | 59900102 | |
| Albúmina sérica bovina, grado de biología molecular (para tampón de hibridación) | Roche | ||
| Anticuerpo de histona H3K27me3 | Active Motif | 61017 | |
| Alexa Fluor 555 Cabra Anti-Ratón, altamente adsorbido | cruzado Life Technologies | A21424 | |
| ProLong Gold reactivo antidecoloración | Life Technologies | P36931 |
Referencias
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