Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

La cuantificación de fenotipos en Orofacial Xenopus

9.3K vistas

⸱

DOI:

10.3791/52062

⸱

6 de noviembre de 2014

 , 
1Biology Department, Virginia Commonwealth University

En este artículo

Resumen

Un método para cuantificar el tamaño orofacial y la forma de los embriones de Xenopus laevis ha sido desarrollado. En este protocolo, las mediciones de tamaño tradicionales se combinan con morfometría geométrica para permitir análisis más sofisticados de desarrollo y defectos orofacial.

Resumen

Xenopus se ha convertido en una herramienta importante para la disección de los mecanismos que rigen el desarrollo y defectos craneofaciales. Un método para cuantificar el desarrollo orofacial permitirá análisis más riguroso de fenotipos orofaciales en derogación con sustancias que genéticamente o molecularmente pueden manipular la expresión génica o la función de proteínas. El uso de dos imágenes dimensionales de las cabezas de embriones, se miden las dimensiones tradicionales de tamaño-tales como orofacial anchura, altura y zona-. Además, una medida de la redondez de la abertura de la boca embrionario se utiliza para describir la forma de la boca. Morfometría geométrica de estas dos imágenes dimensionales también se realiza para proporcionar una visión más sofisticada de los cambios en la forma de la región orofacial. Puntos de referencia se asignan a puntos específicos en la región orofacial y coordenadas se crean. Un análisis de componentes principio se utiliza para reducir coordenadas señal a los componentes principales que discriminan entonces el tratamientogrupos. Estos resultados se muestran como un gráfico de dispersión en el que los individuos con formas orofaciales similares se agrupan. También es útil para llevar a cabo un análisis de función discriminante, que compara estadísticamente las posiciones de los puntos de referencia entre dos grupos de tratamiento. Este análisis se muestra en una rejilla de transformación donde los cambios en la posición de punto de interés se consideran como vectores. Una rejilla se superpone a estos vectores a fin de que se muestra un patrón de deformación para mostrar dónde posiciones hitos significativos han cambiado. Cambios en la forma en el análisis de la función discriminante se basan en una medida estadística, y por lo tanto pueden ser evaluados por un valor de p. Este análisis es sencillo y accesible, que sólo requiere un estereoscopio y software freeware, y por lo tanto será una investigación y la enseñanza valiosa de recursos.

Introducción

Entre los tipos más frecuentes y devastadores de defectos de nacimiento en humanos son los que afectan a la boca y la cara, como hendiduras orofaciales 1. Los niños con estructuras orofaciales malformados se someten a múltiples cirugías durante toda su vida y luchan con desfiguraciones faciales, el habla, la audición y problemas de alimentación. Por lo tanto, lo que facilita una nueva investigación en el desarrollo de craneo y orofacial es de suma importancia para la prevención y el tratamiento de estos tipos de defectos de nacimiento en seres humanos. Xenopus laevis ha surgido como una nueva herramienta para la disección de los mecanismos que rigen el desarrollo craneofacial (algunos ejemplos incluyen 2,3,4 -11). Por lo tanto, un método cuantitativo para analizar los cambios de tamaño y forma durante el desarrollo de la cabeza y la cara de esta especie podría ser muy poderosa 3.

A continuación, presentamos un método de este tipo; la combinación de mediciones de tamaño tradicional con morfometría geométrica adaptados de un estudio de Xenopus 12 y una gran cantidad de estudios que analizan la forma facial humana 13-15. El objetivo de este protocolo es permitir a los investigadores para cuantificar el tamaño de la cara y las formas de distinguir entre los diferentes fenotipos orofaciales durante el desarrollo normal y anormal. Este análisis permitirá una mejor diferenciación entre los defectos craneofaciales sutiles tales como las derivadas de los efectos sinérgicos de los genes y / o factores ambientales. Además, este método de cuantificación también podría revelar incluso leve mejora o rescate de un defecto orofacial. Por lo tanto, esto hace que sea una guía útil en el análisis de productos terapéuticos potenciales.

La combinación de medidas faciales y morfometría geométrica que aquí presentamos permite un análisis estadístico más exhaustivo del tamaño y forma de la región orofacial que los protocolos actuales que utilizan en gran medida sólo uno o el otro 15-18. Además, se presenta una forma sencilla de evaluar tanto el medial y planos laterales dela cara sin necesidad de equipos de imagen tridimensional sofisticada utilizada en los estudios actuales 13,19.

Demostramos este protocolo en Xenopus laevis embriones tratados con un inhibidor del receptor del ácido retinoico que induce el desarrollo orofacial anormal y una mediana de 2,3 paladar hendido. La cuantificación de las dimensiones y la forma de la región orofacial en estos embriones han revelado cambios en el tercio medio facial que es análogo a los seres humanos con hendiduras palatinas similares y modelos de ratón 20,21. Sin embargo, este protocolo puede utilizarse para evaluar los efectos de otros compuestos sobre el desarrollo orofacial tales como sustancias naturales, herbicidas, o proteínas tales como factores de crecimiento. Además, el tamaño y forma cambia orofaciales derivados de la perturbación de la expresión génica a través de la pérdida o ganancia de experimentos de función (utilizando morfolinos antisentido o Crispers / Talens) también pueden ser cuantificados usando este protocolo. Por último, hemos desarrollado este método specificaLLY para evaluar la morfología de Xenopus; sin embargo, se puede modificar fácilmente para el análisis de cualquier vertebrado. Otras aplicaciones también podrían incluir el uso de este protocolo para la comparación de especies estrechamente relacionadas para los estudios evolutivos o ecológicos. Aunque el ejemplo que ofrecemos aquí utiliza este protocolo para describir el análisis de la región orofacial, que fácilmente podría ser modificado para el análisis de otras regiones, órganos o estructuras.

Este protocolo cuantificación orofacial se convertirá en un recurso valioso para la comunidad de investigación, así como una excelente herramienta de enseñanza para los estudiantes de pregrado como una demostración en video.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los experimentos realizados utilizando Xenopus laevis han sido aprobados por IACUC (protocolo # AD20261).

1. Reactivos Preparación y materiales necesarios

  1. Reactivos:
    1. Hacer 1 L de 10x MBS (Modificado salinos de Barth) solución 22. Añadir NaCl (880 mM), KCl (10 mM), MgSO4 (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7,8) y NaHCO3 (25 mM) a 1 L de agua destilada. Ajustar el pH a 7,8 con NaOH.
    2. Hacer 1 L de 1x MBS por dilución de 100 ml de 10x solución de MBS en 900 ml de agua destilada. Añadir 0,7 ml de solución M CaCl 2 1.
    3. Hacer 1 L de 0,1X MBS por dilución de 100 ml de solución 1x MBS en 900 ml de agua destilada. Para 1 L de solución de 0,1x MBS, añadir 1 ml de solución de gentamicina 10 mg / ml para su uso en el cultivo de embriones.
    4. Hacer MBS elevadas de sal por disolución de 4 ml de NaCl 5 M en 100 ml de 10x MBS. A continuación, añadir agua destilada hasta que el volumen total es de 1 L.
    5. Hacer etanol al 70% diluyendo 100% eTHANOL de etanol al 70% con agua destilada.
    6. Hacer BMS-543 mediante la preparación de una solución madre 10 mM en sulfóxido de dimetilo (DMSO).
    7. Hacer 4% de paraformaldehído (PFA) mediante la adición de 4 g de polvo de paraformaldehído a 50 ml de agua destilada. Calentar en una placa caliente a aproximadamente 65 ° C, momento en el que agregar 5 M NaOH gota a gota hasta que la solución se aclare.
      1. Una vez que la solución se aclara, retirar del fuego y añadir 50 ml 2x PBS y 100 l de Tween-20. Deje que se enfríe a temperatura ambiente en el hielo. Ajustar el pH a entre 7,2 y 7,5 usando HCl.
    8. Hacer una solución salina tamponada con fosfato con Tween (PBT) disolviendo 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, y 0,24 g de KH 2 PO 4 en 800 ml de agua destilada. Usando HCl, ajustar el pH a 7,4. Añadir 2 ml de Tween-20. Ajustar el volumen final con agua destilada a la igualdad de 1 L.
    9. Prepare una solución de cisteína disolviendo 1 g de cisteína en 50 ml de agua destilada o 0,1x MBS. Añadir 1,5 ml de NaOH 5 M unnd ajustar el pH a 7,8.
    10. Hacer una solución madre Benzocaína 10% mediante la adición de 10 g de Benzocaína polvo a 100 ml 100% EtOH. Para la eutanasia de los varones y embriones listos para la fijación de adultos, diluir a una solución al 0,05%.
    11. Hacer una solución de almacenamiento de los testículos mediante la adición de 1 ml de suero de ternera a 9 ml de tampón L15.
  2. Herramientas y equipos necesarios:
    1. Obtener el equipo listado en la Tabla de Materiales y Equipos, que se muestra en la Figura 1.
    2. Modificar una herramienta pipeta. Coloque la punta de una pipeta Pasteur de vidrio en una llama de un mechero Bunsen. Gire la punta de la pipeta hasta que se derrite y forma un extremo sellado redondeado.
    3. Aplanar el modelado arcilla en el fondo de una placa Petri de plástico, suavizando para cubrir toda la placa (de cualquier tamaño se puede utilizar) (Figura 1Aiv).
      1. Presione ligeramente una aguja burlas directamente en la cazuela de barro forradas en un ángulo de 45 °. Sostenga la aguja allí, y lentamente mover la Petrirepartir horizontalmente para crear una línea deprimida (Figura 1Bi). Repita el procedimiento para el número deseado de filas.
      2. Use la punta de una herramienta de pipeta de vidrio para hacer, depresiones circulares superficiales en cada fila de la cazuela de barro forradas para colocar cabezas de embriones (Figura 1Bii) y ayuda en la organización de los embriones mientras fotografiaba.
      3. Para la fotografía, llenar el plato con PBT (Figura 1Biii). Entre usos, lave completamente el plato y la superficie de la arcilla con agua estéril, seguido de etanol al 70%.

2. Xenopus laevis cultivo de embriones y el inhibidor Tratamientos

  1. La fertilización in vitro y la cultura de los huevos de Xenopus:
    1. Obtenga y cultura Xenopus laevis embriones utilizando métodos estándar publicado 22,23.
    2. En pocas palabras, la eutanasia a un hombre adulto por inmersión en una solución de benzocaína 0,05%. Diseccionar testículos y almacenar en la memoria de almacenamiento de los testículos. Inyectarhembras adultas con gonadotropina coriónica humana (HCG), recoge los huevos en MBS altos de sal, y fertilizan in vitro con testículos disecados (Figura 2A, B).
    3. Embriones Cultura en 0,1x MBS a 15 ° C hasta que el escenario deseado se alcanza (embriones en estadio de acuerdo a la tabla normal de Xenopus laevis por Nieuwkoop y Faber 24,25).
      1. Aquí, los embriones de cultivo hasta la etapa 22 (después de la fertilización de 24 horas (HPF)), y quitar la membrana vitelina bajo un microscopio estereoscópico usando dos pares de pinzas afiladas. Embriones de transferencia con un estándar, pipeta de transferencia desechable para un plato de Petri limpia (100 mm de diámetro) que contienen 30-40 ml de 0,1X MBS.
  2. Inhibidor de tratamientos de embriones de Xenopus (ilustradas en la Figura 2):
    1. Llenar los pocillos necesarios de una placa de cultivo de 24 pocillos con 1 ml de 0,1X MBS utilizando una pipeta calibrada-hombre. Demarcar el exterior del pozo con una marca de punto finoer (Figura 2D, recuadro). Use el marcador para etiquetar también los contenidos que se añaden a cada pozo de la tapa de 24 pocillos placa de cultivo. Copie esta información en una página de 24 pocillos de configuración en el cuaderno de laboratorio.
    2. Transferencia 5-10 embriones en cada pocillo utilizando un estándar, pipeta de transferencia desechable (Figura 2C). Coloque el mismo número de embriones en cada pocillo.
    3. Rellene o eliminar los MBS 0,1x para que esté a nivel con la línea marcada 1 ml (Figura 2D). Añadir el volumen apropiado de DMSO (de modo que el volumen final de DMSO es 1%) y homogeneizar suavemente. Tenga cuidado de no añadir DMSO demasiado cerca de los embriones, y evitar el contacto de los embriones con la superficie de la memoria intermedia.
    4. Añadir el volumen adecuado de productos químicos a los pocillos designados y agitar suavemente de nuevo. Aquí, añadir 1 l de 10 mM BMS-453 (un antagonista del receptor de ácido retinoico) y 9 l de DMSO a 1 ml de 0,1x MBS.
    5. Si el producto químico es sensible a la luz, sin apretar envolver el callejónplato tura en papel de aluminio. Embriones de cultivo en una incubadora a 15 ° hasta que la etapa deseada. En este ejemplo, el tratamiento de los embriones de 16 a 18 h.
  3. Lavarse embriones fuera del tratamiento y la crianza hasta etapas renacuajo:
    1. Retire de la mitad a las tres cuartas partes de la solución con una pipeta de transferencia desechable. Tenga cuidado de no molestar a los embriones. Utilizando una nueva pipeta de transferencia, vuelva a llenar el pozo con 0,1x MBS. Repita esto 3-6 veces.
    2. Embriones de transferencia a una gran placa de Petri (150 mm de diámetro) que contiene 100 ml de 0,1x MBS con gentamicina (1 ml / l). Incubar los embriones a 15 ° C hasta que alcanzan la etapa 42-45 (82-100 HPF).
    3. Cambie el MBS 0,1x solución que contiene gentamicina diariamente, y eliminar embriones muertos con prontitud para evitar la contaminación o muerte de otros embriones. Anote el número de embriones muertos en el cuaderno de laboratorio.
  4. Fijación embriones en paraformaldehído (PFA):
    1. Fijar los embriones entre las etapas 42 y 45 (82 y 100HPF, respectivamente) mediante la transferencia en una nueva placa de cultivo de 24 pocillos que contenía 1-2 ml de MBS 0,1X. Etiqueta de la tapa con la misma información que el tratamiento de configuración descrito anteriormente (apartado 2.2.1).
    2. Retire MBS 0,1x tanto de cada pocillo como sea posible, al mismo tiempo dejan embriones cubiertos y asegurar un contacto mínimo para evitar lesiones. Añadir 1-2 ml de solución de benzocaína 0,05% en 0,1x MBS e incubar los embriones hasta que ya no responden a los estímulos.
    3. Añadir 1-2 ml de PFA al 4%. Como alternativa, colocar los embriones en tubos de microcentrífuga etiquetados para la fijación, si se prefiere.
    4. Incubar los embriones en PFA durante 24 horas a 4 ° C en un agitador rotatorio. Retire PFA mediante la realización de 3-4 lavados con PBT durante un periodo de 3-5 horas.

3. Fotografía de la región orofacial de Xenopus renacuajos

  1. Preparación previa a la fotografía (esto se ilustra en la Figura 3):
    1. Coloque embriones fijos en una gran placa de Petri (150mm de diámetro) que contenía aproximadamente 100 ml de PBT.
    2. Haga dos incisiones para cortar la cabeza del cuerpo (Figura 3A, líneas negras sólidas). En primer lugar, sujetar el embrión con un par de pinzas y hacer una incisión en el lado posterior de la tripa con un bisturí estéril (Figura 3B). Hacer una segunda incisión en el lado anterior del intestino, cerca del corazón, para eliminar por completo la cabeza (Figura 3C).
    3. Pipeta cortó las cabezas de embriones en una cazuela de barro forradas (parte 1.2.2) utilizando un estándar, pipeta de transferencia desechable.
      1. Para las vistas frontales, utilizar dos pares de pinzas para posicionar las cabezas de embriones lado posterior por el interior de las depresiones circulares. Usando las pinzas para manipular tanto la cabeza del embrión y la arcilla que rodea, los embriones posición tal que los que se enfrentan la cámara y no están inclinados hacia atrás o hacia los lados (Figura 3D). Empuje suavemente la arcilla que rodea alrededor de la cabeza con unas pinzas y / o el cristalherramienta de pipeta para asegurar la cabeza en su lugar.
      2. Para las vistas laterales, utilizar pinzas para colocar las cabezas de embriones dentro de las depresiones circulares de manera que sean de su lado, frente a la misma dirección, y son planas contra la arcilla. Manipular la cabeza del embrión y la arcilla que rodea de manera que las glándulas de cemento de todos los embriones se colocan hacia abajo en el mismo ángulo (Figura 3E). Utilice las filas extraídas con la aguja burlas como una guía para asegurar la precisión al tomar medidas laterales.
  2. La captura de imágenes de la cabeza renacuajo:
    1. Fotografiar la cabeza del renacuajo utilizando cualquier microscopio de disección con una cámara digital conectada y el software de la cámara correspondiente. Utilice el máximo aumento que se puede mantener constante para todos los embriones.
    2. Centrar los embriones y se enfrentan a todos en la misma dirección. Captura de imágenes utilizando las mejores condiciones de iluminación que permiten la imagen más precisa de la región orofacial. Posiciónluces para evitar sombras excesivas. Guarde las imágenes como archivos .tiff con la mayor resolución posible.

4. Medición y Análisis Facial Tamaño Dimensiones en Xenopus renacuajos

  1. Medir las dimensiones orofaciales (que se resumen en la figura 4):
    1. Determinar el ancho de la cara. Identificar los puntos en los que la parte ventral de cada ojo se encuentra con la periferia de la cara (Figura 4A, flechas), y medir la distancia entre estos puntos (Figura 4A, línea roja).
    2. Determinar la altura de la cara. En primer lugar, determinar la línea media por la medición de la distancia entre cada ojo y el cálculo de la mitad del recorrido. A continuación, dibuje líneas horizontales que marcan los dorsales mayoría de los bordes de los ojos y el dorsal más puntuales de la glándula de cemento (Figura 4B, líneas blancas). En la línea media, medir la distancia entre las líneas horizontales (Figura 4B, línea roja).
    3. Determinar tél área orofacial. Utilice las mismas líneas horizontales que marcan los bordes dorsales de los ojos y la glándula de cemento para guiar medición de área (Figura 4C, líneas blancas). Comience en el punto donde la línea horizontal marca la parte superior de la glándula de cemento se encuentra con la periferia de la parte izquierda de la cara (Figura 4ca).
      1. Seguir la pista a lo largo del borde de la cara que abarca el ojo hasta el punto donde la línea horizontal marca la parte superior de los ojos se encuentra con la periferia de la cara (Figura 4BC). Continuar para rastrear a lo largo de esta línea horizontal más dorsal hasta el punto donde se encuentra con la periferia de la parte derecha de la cara (Figura 4 cc).
      2. Seguir la pista hacia abajo a lo largo del borde de la cara que abarca el ojo hasta el punto en que la línea más horizontal ventral marcado la parte superior de la glándula de cemento cumple con la periferia de la parte derecha de la cara (Figura 4 cd). Continuar a rastrear a lo largo de esta línea de fondo unt horizontalil se encuentra con el punto en el que comenzó el rastreo. Utilice el software de edición de fotos para calcular el área dentro del trazado.
    4. Determinar la longitud hocico. En las imágenes laterales, hacer una línea vertical que marca la parte anterior del ojo. A continuación, medir la distancia horizontal desde el punto más anterior donde la cara se encuentra con el borde dorsal de la glándula de cemento a la línea vertical marca el anterior del ojo (Figura 4D).
    5. Determinar el ancho de la boca. Medir la distancia horizontal entre los puntos izquierdo y derecho, donde los superiores e inferiores "labios" de la apertura de la boca se encuentran (Figura 4E). Estos podrían ser considerados el equivalente rana de las comisuras labiales.
    6. Determinar la redondez boca. Calcular boca redondez como una relación inversa aspecto donde (4   ×   [Área]) / (π   ×   [Eje Mayor] 2 >).
      1. Utilice la herramienta Lazo en una foto-editor para trazar los bordes de la abertura de la boca, como se muestra en la Figura 4F. Seleccione Analizar en la barra de herramientas principal y seleccione Medir. Alternativamente, el cálculo de la redondez de la medición de área y el diámetro de la abertura de boca.
  2. Análisis de los datos de las dimensiones faciales:
    1. Entrada de las mediciones de las dimensiones faciales en un programa de análisis de datos para comparar el grupo de tratamiento con el control. Determinar la media de cada medición para ambos grupos experimentales y de control para crear gráficos de barras. Determinar la desviación estándar con el fin de crear barras de error. Realizar pruebas t de Student para comparar grupos estadísticamente.
      NOTA: Esta información puede ser muy variable debido a las ligeras diferencias en las tasas de desarrollo entre los embriones.

5. Análisis cuantitativo de la forma Orofacial y Morfometría

  1. Coloque los puntos de referencia y CREAte coordinar archivo histórico (ilustrado en la Figura 5A).
    1. Elija puntos de referencia, que capturan la forma de la imagen de destino, y se pueden colocar en varias ocasiones en la misma ubicación relativa en todas las muestras que se analiza. Si una estructura no existe en todas las muestras, no coloque un punto de referencia en esta estructura.
      1. Aquí, colocar 24 puntos de referencia para representar el tercio medio facial con marcas distintivas tales como los ojos, la nariz y la boca. Para mantener la coherencia, lugar Lugares de interés a medio camino entre hitos colocados previamente (por ejemplo, la boca puntos de referencia, la figura 5ai).
    2. Captura de coordenadas históricas y crear "archivo histórico de coordenadas". Abrir la primera imagen de una cara de renacuajo (por ejemplo, el primer embrión de control).
      1. Seleccione la pestaña Plug-ins en la barra de herramientas principal y seleccione Pointpicker en el menú desplegable. Seleccione el complemento Puntos pestaña y colocar puntos de referencia en lugares deseados como puntos de referencia aparecerán como cruces multicolores ( Figura 5ai).
      2. Mueva lugares emblemáticos después de la colocación al seleccionar la herramienta Mover cruces. Cuando todas las señales se han colocado en la imagen, seleccione la ficha Presentación de Resultados a la barra de herramientas principal y seleccione Mostrar (Figura 5Aii) para mostrar las coordenadas históricas y copiar en un programa de hoja de cálculo (Figura 5Aiii).
      3. Al pegar estas coordenadas de este primer embrión en un programa de hoja de cálculo, dejar una fila vacía por encima de los datos. En la columna B de esta fila vacía (fila 1), tipo "LM =" con el número de puntos de referencia de la muestra. Aquí, introduzca "LM = 24", ya 24 puntos de referencia se crearon (Figura 5Aiii, caja roja).
      4. En la fila de abajo los puntos de datos, tipo "ID =" con un nombre de identificación de la muestra. Aquí en la figura 5Aiii, introduzca "ID = CON1" ya que este es el punto de referencia de coordenadas de los datos del primer embrión de control (Figura 5Aiii, flecha roja).
      5. Repita este proceso con las caras de cada embrión en el experimento (experimental y control) hasta que todas las coordenadas históricas han entrado en la hoja de cálculo.
        NOTA: Es importante que cada embrión se le da un nombre único en el "ID =" fila. Aquí por ejemplo, se da el siguiente conjunto de coordenadas emblemáticos de la ID de "CON2" ya que era el segundo embrión en el grupo de control.
      6. Copie todo la segunda y tercera columnas en un documento de texto y guardarlo como un archivo .txt.
  2. Configure el programa de software para el análisis de los datos morfométricos (ilustrado en la Figura 5B).
    1. Aquí, seleccione Crear nuevo conjunto de datos en el menú principal del programa de software morfométricos. Asigne un nombre al archivo y los datos que figuran en los cuadros correspondientes (por ejemplo, "ácido retinoico inhibición" y "puntos de referencia faciales", respectivamente) en la pantalla pop-up (Figura 5BI). Importe el archivo como un TPS, y select el archivo de texto de coordenadas para crear el conjunto de datos (Figura 5BI, flecha roja).
    2. La alineación de datos y Procusto encajan:
      1. Realizar un ajuste Procusto y la alineación. Resaltar los datos que figuran en la ficha Árbol de proyectos, elija Preliminares en la barra de herramientas principal, y Nueva Procusto Fit en el menú desplegable.
      2. Elija Alinear por la Directora Eje y seleccione Realizar Procusto Fit en la parte inferior de la caja (Figura 5Bii, flecha roja). Vuelta a la Preliminares en el menú desplegable, seleccione Generar matriz de covarianza (Figura 5Biii), y seleccione Ejecutar.
      3. Ver las correlaciones de la matriz de covarianza en la pestaña Resultados.
    3. Crear un "archivo clasificador" mediante la asignación de cada muestra en el conjunto de datos a la variable clasificador apropiado distinguir si pertenece en el grupo experimental o al grupo control.
      1. Etiquetar dos columnas en una hoja de cálculo. Etiquetar el encabezado de la primera column con "ID" y la entrada del mismo ID determinado para cada muestra (por ejemplo, CON1, RARINHIB1, y así sucesivamente; Figura 5Biv). Etiqueta de la cabecera de la segunda columna con "tratamiento" y la entrada dentro de cada celda el grupo de tratamiento que corresponde a la de ejemplo que aparece en la celda ID adyacente.
      2. En este caso, utilizar las etiquetas de "control y RAR INHIBIDOR" como clasificadores (Figura 5Biv). Copie en un archivo de texto y guardarlo como un archivo .txt. Variables Importación clasificador en el programa de software morfométricos. Elige Partido por identificador, y abrir el archivo de texto (Figura 5Bv).
  3. Crear un análisis de componentes principales (ACP) diagrama de dispersión seleccionando el menú desplegable Variación y la elección de Análisis de Componentes Principales (Figura 6AI). A continuación, seleccione la ficha Gráficos para ver tres pestañas adicionales: cambios en la forma de PC, valores propios, y las puntuaciones de PC (Figura 6Aii). La ficha puntuaciones PC muestra el bivariate director de dispersión componente de los datos emblemáticos aptos Procusto (Figura 6Aii).
    1. Para cambiar el que se representan los componentes principales, abrir el menú emergente en el espacio de parcela y seleccionar el eje deseado para cambiar (Figura 6Aiii, flecha roja).
    2. Seleccione la herramienta Puntos de datos de color (Figura 6Aiii). Seleccione clasificadores importados previamente (Sección 5.2.2) en el segundo menú emergente que aparece para determinar el color de cada categoría (Figura 6Aiv).
    3. Ver la cantidad de varianza capturada por cada componente principal en la pestaña Resultados (Figura 6AV). Gráfico Exportar como un archivo .bmp.
  4. Crear un análisis de la función discriminante (DFA) de rejilla de transformación en el programa de software morfométricos eligiendo Análisis de función discriminante en la ficha Comparación (Figura 6BI). En el menú emergente, asegúrese de que el conjunto de datos adecuado es seleja y el tipo de datos es las coordenadas Procusto-fit.
    1. Resaltar los pares de grupos que deben compararse, y ejecutar 1.000 pruebas de permutación (Figura 6Bii).
    2. En Gráficos, ver el mapa del vector de las coordenadas en la pestaña Diferencia Forma (Figura 6Biii). Si se invierte la imagen, abrir el menú emergente en el espacio complot para darle la vuelta al diagrama en la orientación correcta (Figura 6Biii).
    3. La dirección de los vectores de forma refleja la diferencia del primer grupo en comparación con el segundo, que se muestra en el menú de funciones discriminante antes de ejecutar el análisis (Figura 6Bii). Para invertir la dirección de los vectores, que aparezca el menú emergente en el espacio de parcela y cambiar el signo del factor de escala por lo que es negativo (Figura 6Biii, iv). El valor del valor de la escala se establece en un factor de diez que mejor representa las diferencias estadísticas en posición hito between los dos grupos sin distorsión, y se suele dejar en el valor predeterminado (Figura 6Biv).
    4. También en el menú emergente, cambiar el gráfico a una rejilla de transformación para superponer los vectores sobre una rejilla (Figura 6Biii, v).
    5. Especifique el número de líneas horizontales y verticales de la cuadrícula en el menú emergente (Figura 6Biii, v).
    6. Exportar el gráfico como un archivo .bmp.
    7. Ver las distancias Procusto y Mahalinobis y los valores de p en la ficha Resultados (Figura 6Bvi).
  5. Análisis adicionales morfométricos que son útiles para la evaluación de más de un grupo de tratamiento
    1. Crear una red de transformación análisis de componentes principales. La Forma PC Cambia ficha muestra el mapa vectorial de cambios en la forma que representan la variación dentro de cada grupo de muestra. Utilice el menú emergente en el área de trazado para orientar la imagen correctamente y superponer vectores sobre una rejilla de transformación. Ajuste el factor de escalaal valor en el eje x de la gráfica de las puntuaciones de PC que corresponde al centro estimado del grupo de control. Exporta la imagen como un archivo .bmp.
    2. Crear un diagrama de dispersión de CVA. En la ficha Comparación de la barra de herramientas principal, seleccione Análisis de variación canónica, y poner de relieve el clasificador conjunto de variables que se importó anteriormente (véase la Sección 5.2.3). Seleccione 1.000 iteraciones de pruebas de permutación, y seleccione Ejecutar. Seleccione la pestaña de calificaciones CV para ver el diagrama de dispersión CVA bivariado. Este es un código de color basado en los clasificadores subidos. Cambiar el esquema de color al traer el menú emergente en el espacio de parcela (véase la Sección 5.3.3). Exportar como un archivo .bmp.
    3. Crear una red de transformación de CVA. Una rejilla de transformación de los resultados en materia de VAC se puede generar cuando se comparan más de dos grupos. En la ficha Gráficos, seleccione Cambios Forma CV para visualizar la red de transformación de las coordenadas históricas. Abra el menú emergente en el espacio de parcela para cambiarla dirección del vector, superponer los resultados en una rejilla de transformación, y especificar el número de líneas de división. Exportar el gráfico como un archivo .bmp.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Aquí, se demostró un análisis cuantitativo de tamaño y forma orofacial para comparar los embriones tratados con un inhibidor de receptor de ácido retinoico (RAR inhibidor) a los controles no tratados. Los embriones se trataron con una concentración 1 M de este inhibidor químico de la etapa 24 a 30 (26-35 HPF), eliminado, y se fijaron en la etapa 42 (82 HPF). Luego fueron procesados ​​y analizados como se describe en el protocolo. Los resultados son los datos originales, pero consistente con las observaciones en las publ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Xenopus laevis se ha convertido en una herramienta útil para la disección de los mecanismos de desarrollo de desarrollo orofacial subyacente; sin embargo, actualmente no existen protocolos que describen los cambios de tamaño y forma de esta región en las ranas. El método aquí descrito contribuirá significativamente a la esfera del desarrollo orofacial al permitir una cuantificación más rigurosa de fenotipos orofaciales en Xenopus y otros vertebrados.

El primer aspecto, más ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Fondos para la instalación de A. Dickinson de VCU apoyaron este trabajo.

Los autores desean agradecer a Dan Nacu por su talento artístico en la creación de la ilustración esquemática.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microscopio de disecciónZeissequipado con cámara AxioCamICC1
Pinza Dumont #5 InoxFine Science Tools11251-10
Bisturí estéril y desechableSklar06-2015
Placa de 24 pocillosFisher Scientific087721
Standard Pipetas de transferencia desechablesFisher Scientific13-711-7M
Placas de Petri de 150 mm x 15 mmIncubadoras de 351058
Ectothermajustadas a 15 & grados; C o 20 ° C
Arcilla para modelarPremo, u otra arcillaen blanco o negro
Aguja de burla rectaThermo Scientific19010
Tubo capilar (para agujas)FHC30-30-1Borosil 1,0 mm de diámetro exterior x 0,5 mm de diámetro interior/fibra, 100 mm cada
Extractor de agujas, modelo P-97Sutter Instrument Co.Extractor de agujas: P-97 Tirador de micropipetas Flaming/ Bown Filamento: FB300BPara los filamentos, utilice filamentos de caja cuadrada Sutter de 3,00 mm, 3,0 mm de ancho.
PipettemenGilsonF144802, F123600, F123602
BMS-453Tocris3409
DMSOAmerican BioanalyticalAB00435-01000
CisteínaSigma-Aldrich52-90-4
Polvo de paraformaldehídoSigma-Aldrich158127
placas de PetriFalcom353003, 351058100 mm de diámetro y 150 mm de diámetro
100% etanolVWR89125-170
Falcon para modelar no tóxica uno

Referencias

  1. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
  2. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev Biol. 365, 229-240 (2012).
  3. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis. Anat Rec (Hoboken). , (2014).
  4. Dickinson, A., Sive, H. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).
  5. Dickinson, A. J., Sive, H. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev Biol. 295, 700-713 (2006).
  6. Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Development. 136, 1071-1081 (2009).
  7. Barnett, C., et al. Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis. Mech Dev. 129, 324-338 (2012).
  8. Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product. Gene. 359, 73-80 (2005).
  9. Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus. Development. 137, 2927-2937 (2010).
  10. Schuff, M., et al. FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis. Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).
  11. Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development. PLoS One. 4, (2009).
  12. Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology. Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).
  13. Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. 3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts. Cleft Palate Craniofac J. , (2013).
  14. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).
  15. Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate. J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).
  16. Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo. Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).
  17. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).
  18. Cooper, W. J., et al. Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes. PLoS One. 5, (2010).
  19. Klingenberg, C. P., et al. Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry. Alcohol. 44, 649-657 (2010).
  20. Zhao, Y., et al. Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).
  21. Allam, K. A., et al. The spectrum of median craniofacial dysplasia. Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).
  22. Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  23. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. (1967).
  25. Nieuwkoop, P. D. aF. J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. , Garland Publishing Inc. (1994).
  26. Abdi, H., Williams, L. J. Principal Component Analysis. WIREs Computational Statistics. 2, (2010).
  27. Hill, T. L. P. STATISTICS: Methods and Applications. , StatSoft, Inc. Tulsa, OK. (2013).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Embriones de Xenopusmorfometr a geom tricaan lisis de dimensiones facialesmapeo de puntos de referenciaan lisis de componentes principalesan lisis de funci n discriminanterejilla de transformaci nim genes con estereoscopiosoftware gratuito
La cuantificación de fenotipos en Orofacial Xenopus
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.