Un manual de la pantalla pequeña molécula Acercarse De Alto Rendimiento Utilizando embriones de pez cebra

Summary

El pez cebra es un organismo experimental excelente para estudiar los procesos de desarrollo de vertebrados y la enfermedad humana modelo. A continuación, describimos un protocolo sobre cómo realizar una pantalla manual de alto rendimiento químico en embriones de pez cebra con todo el montaje hibridación in situ (ojalá) de lectura.

Abstract

El pez cebra se han convertido en un organismo modelo ampliamente utilizado para investigar los mecanismos que subyacen a la biología del desarrollo y para estudiar la patología de la enfermedad humana debido a su considerable grado de conservación genética con los humanos. Genética químicos implica probar el efecto de que las pequeñas moléculas tienen en un proceso biológico y se está convirtiendo en un método popular de la investigación traslacional para identificar compuestos terapéuticos. El pez cebra son atractivos específicamente a utilizar para la genética química debido a su capacidad para producir grandes garras de embriones transparentes, que son fertilizados externamente. Además, embriones de pez cebra pueden ser fácilmente tratado con fármaco por la simple adición de un compuesto a los medios embrión. El uso de todo el montaje hibridación in situ (DESEOS), la expresión del ARNm puede ser claramente visualizado en embriones de pez cebra. Juntos, el uso de la genética química y desea, el pez cebra se convierte en un contexto de todo el organismo potente en el que para determinar el celular y fisiológicoefectos de moléculas pequeñas. Innovadores avances se han hecho en las tecnologías que utilizan procedimientos de detección basados ​​en máquinas, sin embargo, para muchos laboratorios dichas opciones no son accesibles o que permanecen costo prohibitivo. El protocolo descrito aquí se explica cómo ejecutar una pantalla genética manual de química de alto rendimiento que requiere recursos básicos y se puede lograr por un solo equipo individual o en pequeños en un período de tiempo eficaz. Por lo tanto, este protocolo proporciona una estrategia viable que puede ser implementado por grupos de investigación para llevar a cabo la genética química en el pez cebra, que puede ser útil para obtener conocimientos fundamentales en los procesos de desarrollo, mecanismos de la enfermedad, y para identificar nuevos compuestos y vías de señalización que tienen aplicaciones médicamente relevantes .

Introduction

La identificación de los fármacos terapéuticos eficaces para el tratamiento de enfermedades humanas es el final del juego para muchos investigadores biomédicos. Si bien la identificación y caracterización de agentes farmacológicos potenciales para aplicaciones clínicas tiene un valor evidente para la salud, ha seguido siendo un reto importante. En última instancia, el desarrollo de muchos compuestos terapéuticos proviene del conocimiento de cómo tipos de células específicos o bien desarrollan o función. El pez cebra, Danio rerio, es un teleósteo de agua dulce de la familia de los ciprínidos que se ha convertido en un organismo modelo dominante en la biología del desarrollo ^1. El pez cebra son tratables genéticamente vertebrados que son fáciles de mantener y manipular para los estudios científicos ^2,3. El embrión de pez cebra es transparente, fertilizado externamente, y puede ser producido por los cientos de un solo par de acoplamiento adulto en sólo una semana ^2,3. Por otra parte, los principales sistemas y órganos comparten pez cebra poseen un gran degree de similitud genética con los mamíferos, incluyendo seres humanos ^4. Sorprendentemente, el 70% de los genes humanos tienen un ortólogo de pez cebra ^4. Debido a esta similitud, el pez cebra haber sido un sistema experimental muy relevante para el estudio de los mecanismos de desarrollo de los vertebrados y de la fisiología, y se han empleado para recapitular una multitud de enfermedades humanas ^5-7. Estas razones, entre otras, han hecho que el pez cebra un candidato ideal para continuar interrogatorios genéticos y ha dado lugar a un reconocimiento cada vez mayor para la utilidad de pez cebra en la investigación biomédica ^6,7.

Durante las últimas décadas, una gran cantidad de herramientas genéticas se han desarrollado en el pez cebra. El genoma pez cebra es susceptible de mutagénesis y la transgénesis ^3. Hasta la fecha, se han realizado una gran cantidad de avance y retroceso estudios genéticos, lo que lleva a la generación de más de 9.000 mutantes ^3. Por otra parte, numerosas líneas transgénicas tienen seres creado, que han permitido el etiquetado y el aislamiento de los tipos de células específicas ^3. Se han realizado esfuerzos continuos para centralizar y distribuir estos recursos a la comunidad de investigación, que son accesibles para los laboratorios en un lugar bajo costo a través del Centro Internacional de Recursos de pez cebra (ZIRC) ^8. Además, un amplio repositorio de información biológica y herramientas moleculares, que van desde los patrones de expresión de genes de morfolino secuencias y protocolos, se han anotado progresivamente en la Red de Información de pez cebra (ZFIN) ^9-11. Se han hecho posible estas infraestructuras de investigación de pez cebra a través de un apoyo significativo de los NIH y la defensa de este modelo animal ^8. Esta caché de mutantes de pez cebra, las líneas transgénicas, y la información pertinente sigue siendo de un valor excepcional a la comunidad de investigación biológica en general. Sin embargo, mientras que el pez cebra son ahora un organismo modelo bien establecido y preeminente, que representan a largely yacimiento sin explotar para el estudio de la biología del desarrollo y la enfermedad mediante el uso de pantallas genéticos químicos.

La genética química es el uso de pequeñas moléculas, tales como fármacos u otros compuestos, para afectar a un proceso biológico dentro de un sistema vivo ^12. Genética química pueden ser implementadas para comprender los mecanismos moleculares de la función de genes, tales como para identificar agentes que rescate o exacerbar un defecto genético específico ^12. Además, la genética química representa una vía importante para llevar a cabo la investigación traslacional ^12. Mientras que las pantallas adelante genéticos tradicionales en modelos animales han sido tremendamente poderosa en la vinculación de los genes específicos para las enfermedades, carecen de una dimensión temporal, por lo que es difícil oa veces imposible observar fenotipos que surgirían después de la embriogénesis temprana. Además, la redundancia de genes puede hacer que los resultados observados desde la genética a plazo difíciles de interpretar. Alternativamente, pantallas genéticos químicospermitir el control temporal fina y proporcionar al mismo tiempo un valioso punto de partida para el descubrimiento de fármacos ^12,13.

Genética química se puede realizar utilizando sistemas in vitro (por ejemplo, líneas celulares, proteínas) o usando un sistema in vivo, tal como un organismo completo. Utilizando un sistema in vitro para la genética química puede ser beneficioso, ya que es más sencillo que un sistema de organismo completo, más fácil trabajar con a gran escala, menos costoso, y que consuma menos tiempo. Como resultado, los sistemas in vitro permiten tanto para cribado de alto rendimiento (HTS) y cribado de alto contenido (HCS). Hay un número de ventajas de utilizar un sistema in vitro que se debe considerar cuando se aproxime a la genética química, pero también limitaciones significativas. Una limitación importante para el uso de una línea celular es que las pequeñas moléculas pueden ser eficaces y no tóxicos en una línea celular específica, sin embargo, llegar a ser tóxicos cuando se introduce en un organismo completo. Por lo tanto, el quidde la cuestión es que los sistemas in vitro no reflejan el amplio contexto de un organismo y, por tanto, no siempre son capaces de imitar con exactitud lo que ocurre en un organismo completo. Mientras que las pruebas de compuesto en organismos enteros puede eludir estas cuestiones, el uso de modelos de todo el organismo de mamíferos plantea una serie de limitaciones físicas y éticas. Por ejemplo, la detección de drogas en el ratón es logísticamente obstaculizada por el espacio y los gastos necesarios para probar un tamaño de muestra adecuado. Además, las cuestiones de desarrollo pueden ser difíciles de estudiar, debido al hecho de que los mamíferos se desarrollan en el útero. Por último, mientras que la realización de la investigación biomédica tiene un inmenso valor para la sociedad, no obstante, son necesidades importantes para proteger el bienestar animal mediante la limitación de intensos estudios y aliviar el dolor y el sufrimiento de los animales utilizados para la investigación. El pez cebra proporcionar un sustituto viable para el trabajo con los vertebrados superiores, como los mamíferos, y además, muchos temas se puede estudiar utilizando la genética química enlas etapas embrionarias y larvarias cuando el procesamiento neurológico está ausente u operativa a un bajo nivel de ^12,13.

Hasta la fecha, una gran variedad de pantallas genéticos químicos se han realizado utilizando embriones de pez cebra en particular, como la entrega compuesto puede llevarse a cabo mediante la inmersión de los embriones en medios que contienen el fármaco de interés ^12-15. Además, se han producido numerosos avances científicos y tecnológicos para hacer pantallas genéticos químicas posible y manejable ^16-20. Peterson y sus colegas fueron los primeros en utilizar el pez cebra en una pantalla genética química en 2000, y más tarde en 2004 identificaron un compuesto que suprime una mutación coartación aórtica en el pez cebra ^21,22. Pantallas químicos ya se han aplicado para estudiar varios tejidos en desarrollo (por ejemplo, el corazón, los vasos sanguíneos, ^23-25), las funciones fisiológicas (por ejemplo, bases neurológicas del comportamiento) ^26, la regeneración de adultos ^27,28, y diseas modelos e (por ejemplo, distrofia muscular y cáncer) ^29,30. De entre estas pantallas químicas de pez cebra, el descubrimiento de que las prostaglandinas regulan las células madre hematopoyéticas se ha tomado a los ensayos clínicos en seres humanos, lo que demuestra el poder de pasar de "tanque de cabecera" ^23,31-33 (NIH, Trials.gov Clínica, NCT00890500; NCT01627314). Más recientemente, con la promesa terapéutica candidatos han surgido de órganos complejos como el riñón, que remedien la patología celular en la enfermedad renal poliquística (PKD) ³⁴ y la lesión renal aguda ^27,35, aunque sin embargo, estos tienen que pasar a los ensayos clínicos. Estas pantallas genéticos químicos ampliamente demuestran la utilidad de la prueba pequeños compuestos en el pez cebra en desarrollo y la capacidad de aplicar la genética química para interrogar a la función del tejido adulto. Por otra parte, hay una creciente lista de colecciones de farmacología disponibles en el mercado que están disponibles para estudios académicos ^19.

ove_content "> En los últimos años, se han producido avances importantes en la tecnología de detección genética química, incluido el uso de sistemas automatizados de robots para la dispensación de medicamentos y manejo, junto con sistemas de imágenes automatizados ^36-38. Estos sistemas permiten la posibilidad de probar muchos miles de compuestos para lograr ambos HTS y HCS ^36-38. Por desgracia, la empresa de pantallas genéticos químicos con estas empresas robóticas innovadoras suelen requerir recursos considerables. Estos tipos de recursos son un impedimento significativo para muchas instituciones que carecen de capital para adquirir establecer, operar y mantener dicha instrumentación. Si bien el establecimiento de la infraestructura para el manejo robótico de bibliotecas químicas, incluyendo la transferencia de embriones a ataviado placas, sigue siendo un costo prohibitivo para muchos laboratorios, imagenología automatizada y el análisis es en general más accesible ^12. proyección de imagen automatizada permite la cuantificación fluorescente de re transgénicoporteros y facilita el análisis fenotípico específico ^12,15.

Aunque los sistemas automatizados representan avances tecnológicos útiles, muchas preguntas pueden ser abordadas por las pantallas manuales más específicos, tales como la consulta de varios miles de compuestos biológicamente activos en un proceso de desarrollo con todo el montaje hibridación in situ (DESEOS) lectura de ^39. Además, mientras que un número creciente de laboratorios han invocado pantallas químicas de pez cebra para investigar una pregunta de investigación, algunos de saturación (en su caso) los esfuerzos se han alcanzado y muchos temas aún no se han violado mediante la genética química. Pantallas químicos pueden ser ejecutadas usando una pequeña colonia de pez cebra que consta de sólo un tipo salvaje pocos o tanques de transgénicos. Por lo tanto, esta forma de interrogatorio genética debe ser alcanzable por la mayoría de los grupos de investigación de pez cebra interesados ​​en ampliar / diversificación en este campo. Bibliotecas químicas de diferentes tamaños pueden ser adquiridos a partir de un distribuidor comercial y / o colcola-. Por estas razones, la genética química pueden ser económicamente factible incluso en climas duros de financiación. Sin embargo, existen obstáculos a partir de una pantalla genética químicos, tales como la forma de planificar los aspectos logísticos de la pantalla: por ejemplo, el número de personal necesario para una pantalla con éxito, la asignación del tiempo dedicado y armar un protocolo físico a muestras de proceso manualmente que el número de los cientos a varios miles. Aquí, detallamos un protocolo de alto rendimiento manual para ejecutar una genética química en el embrión de pez cebra con el deseo como una lectura. Este método implica el tratamiento farmacológico de embriones de pez cebra, seguido por la detección de transcritos de ARNm ribosonda. El uso de este protocolo, un equipo pequeño o incluso un individuo puede defender razonablemente y analizar una biblioteca química modesta aproximadamente 600 compuestos en el lapso de 9 semanas.

Protocol

Los procedimientos para trabajar con el pez cebra se describe aquí fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Notre Dame. Una guía para el diseño de la investigación para esta pantalla pequeña molécula manual en el pez cebra se proporciona (Figura 1). Una visión general de los métodos descritos en este protocolo se proporciona como un diagrama de flujo (Figura 2). Por favor, consulte el sistema de etiquetado de ejemplo (Figura 3) para planificar las etapas de procesamiento de embriones que se describen en las partes 4-10. Para la puesta en escena de los embriones, por favor refiérase a la puesta en escena de pez cebra serie ^40, y para la preparación de ribosondas antisentido DESEO utilizados en las partes 9-10, referirse a los métodos publicados recientemente ^41.

1. Preparación de pez cebra Cámaras de acoplamiento

1. Publicar un pez cebra macho adulto y un pez cebra hembra adulta en una cámara de apareamiento, separados por el divisor de cámara de O / N.
   NOTA: los apareamientos de masas, tals los que utilizan grupos de 2-3 y 2-3 hembras machos pueden generar más embriones en comparación con los emparejamientos pareadas individuales, y se puede realizar con cámaras de apareamiento de tamaño apropiado.
2. Repita el paso 1.1 de tal manera que un total de 25 pares de pez cebra son puesta a punto para cada placa de 96 pocillos de moléculas pequeñas que se pondrá a prueba.

2. Recolección de embriones de pez cebra

1. Al día siguiente, eliminar el divisor que separa cada par de pescado y después de 1 hora, recoger los embriones de pez cebra utilizando un colador de malla fina y colocarlos en una placa de Petri que contiene medio embrión E3 (ver lista de materiales para la receta).
   NOTA: Recogida de embriones después de 1 hora se asegura de que los embriones se encuentran en etapas de desarrollo similares.
2. Utilice una pipeta de transferencia de plástico para eliminar los residuos (por ejemplo, alimentos y residuos sólidos). A continuación, utilizar un microscopio estereoscópico para observar cada embrague de embriones y eliminar los huevos no fertilizados.
3. Decantar los medios de embriones E3 y reemplazar con fresco E3, a continuación, colocar cada dish de los embriones en una incubadora a 28,5 °. Después de 2 horas de observar cada embrague de embriones utilizando un microscopio estereoscópico y eliminar los huevos no fertilizados.
   NOTA: los huevos no fertilizados pueden envenenar a otros embriones y aparecerán a estar en la etapa de una sola célula u opaco.
4. Continuar monitoreando el progreso en el desarrollo de los embriones utilizando un microscopio estereoscópico hasta que alcanzan el 40% epibolia. Observe la forma esfera del embrión que parece estar compuesto por dos capas separadas en la etapa epibolia 40% ^40.

3. Química Preparación de dilución

1. Retire la placa de la biblioteca química de almacenamiento a -80 ° C, cubrir con papel de aluminio y descongelar a temperatura ambiente.
   NOTA: Las diferentes bibliotecas se descongele a diferentes velocidades dependiendo principalmente del disolvente que se utiliza. Típicamente, una biblioteca química congelado a -80 ° C será completamente descongelado en aproximadamente 3 horas a RT. Placa (s) de descongelación tienda en un lugar seguro con el etiquetado de materiales peligrosos apropiado. Use ungafas ppropriate, una bata de laboratorio, y dos juegos de guantes al manipular productos químicos.
2. Utilice una pipeta multicanal de 8 canales para agregar 99 l de E3 en columnas 2-12 de una placa de 96 pocillos.
   NOTA: A partir de nuestra experiencia, un rango de drogas a partir adecuada está entre 10 mM - 50 mM, y también como se describe en los protocolos actuales ^39. Aquí se demuestra un tratamiento de 10 M si se utiliza una biblioteca química común de la matrícula 1 mM.
3. Utilice una pipeta multicanal de 8 canales para agregar 1 l de cada compuesto a su respectivo bien con E3.
4. Utilice una pipeta P10 a 1 l de DMSO (o el disolvente apropiado) en la columna de control (en este caso, la columna 12).
5. Cubrir la placa de dilución química con papel de aluminio, ya que el papel de aluminio protegerá cualquier compuestos sensibles a la luz en la biblioteca, y devolver la placa de la biblioteca química al -80 ° C para su almacenamiento.

4. arraying embriones de pez cebra

1. Seleccionar un plato Petrique contiene embriones de pez cebra en la etapa de epibolia 40%. Usando una pipeta de transferencia, coloque cuidadosamente aproximadamente 10 embriones dentro de cada pocillo de una (1,1 ml) de placa de pozo profundo 96. Prescindir de embriones en las columnas 2-12 de la placa de 96 pozos profundos.
   NOTA: El investigador debe seleccionar el punto de tiempo de adición del fármaco que mejor se adapta al proceso de desarrollo que desean interrogar. El uso de una pipeta de transferencia de plástico puede minimizar el daño del embrión. Dado que el tratamiento de drogas antes de que el 40% epibolia puede resultar en un aumento de la letalidad de embriones, el desarrollo de los embriones durante más tiempo antes de la exposición al fármaco, especialmente cuando se están examinando los procesos de desarrollo posteriores. La colocación de más de 15 a 20 embriones en cada pozo puede llevar a retraso en el desarrollo, debido al hacinamiento y debe ser evitado. Es importante tener en cuenta que la placa de pozo profundo 96 que contiene los embriones es diferente de la placa de dilución química de 96 pocillos.
2. Usar una pipeta de transferencia de vidrio para eliminar el exceso de E3 de cada pocillo, y expulsar el exceso de E3 enun contenedor de residuos líquidos.
   NOTA: Este procedimiento tarda típicamente entre 30 min a 1 hr dependiendo de la velocidad del investigador, por lo que los embriones son entre 50% y 60% epibolia por terminación, que es la etapa de desarrollo de destino para la adición de la dilución química descrita aquí. La placa se puede inclinar en un ángulo de 45 ° para hacer que los embriones que caen hacia el fondo del pozo para que la punta de la pipeta puede ser presionado contra la parte inferior del pozo para sacar el exceso de E3.

5. La adición de Tratamientos Químicos

1. Utilice una pipeta multicanal de 8 canales para transferir los 100 diluciones químicas mu l a sus respectivos pocillos en la placa de pozo profundo 96 que contiene embriones de pez cebra dispuestos.
   NOTA: Asegúrese de que la ubicación del pozo original del compuesto coincide con la ubicación del pozo en la placa correspondiente bien profunda 96 (por ejemplo, la ubicación del pozo B1 en la placa de dilución química se pipeta en la ubicación del pozo B1 en las profundidadesPlaca de 96 pocillos).
2. Humedezca una toalla de papel y colóquela en un recipiente sensible a la luz lo suficientemente grande como para contener una placa de 96 pocillos.
   NOTA: La toalla de papel húmeda ayudará a prevenir la evaporación de la dilución química.
3. A continuación, utilice una estera de sellado para sellar el plato hondo de 96 pocillos, colóquelo en el recipiente sensible a la luz, y se incuba ella a 28,5 ° C.
   NOTA: Deje que los embriones de pez cebra se desarrollan hasta la mañana siguiente. Como alternativa, dejar que los embriones se desarrollan hasta que se analiza el estado de desarrollo apropiado para el proceso.

6. Eliminación de las Sustancias Químicas

1. Utilice una pipeta multicanal de 8 canales para añadir 300 l de E3 a cada fila de los pocillos tratados con fármaco. Dibuja y deseche la dilución / química E3 de cada fila de pozos. Lave los embriones 3 veces con 300 l de E3.
   NOTA: Desechar los residuos de drogas en un recipiente etiquetado usada sólo para este propósito. Para facilidad de lavados, use un recipiente de vidrio lleno de E3 lo suficientemente amplia como para utilizar la multpipeta iChannel.

7. Pronasa y fijación de embriones de pez cebra

1. Transferencia de embriones de pez cebra utilizando una pipeta de transferencia de plástico en cuatro placas de 24 pocillos, a continuación, eliminar los embriones muertos. Etiquetar las placas de 24 pocillos de modo que se correspondan con las ubicaciones originales y de drogas. Coloque la pipeta delante de un fondo oscuro después de cada traslado bien para visualizar embriones en la pipeta y evitar así cruce embrión.
2. Utilice una pipeta de transferencia de plástico para extraer el E3 para que los embriones son apenas sumergidos en líquido.
3. Utilice una pipeta de vidrio para agregar 2 gotas de pronasa Stock (50 mg / ml) a cada pocillo. Deje que los embriones se incuban en pronasa durante 5 min y luego se agitan los pozos para hacer que el corion se rompa. Alternativamente, pronasa los embriones antes de que estén en la etapa de desarrollo deseado para el análisis.
4. Utilice una pipeta de transferencia de plástico para lavar los embriones en dos ocasiones con el E3.
5. Una vez que los embriones están en la etapa de análisis deseado, borradorletely extraer y desechar el resto E3.
6. Utilizar una pipeta de transferencia de plástico para añadir fresco PFA al 4% / PBS a cada pocillo. Incubar los embriones a 4 ° CO / N solucionarlo. Utilice recién descongelados PFA para fijar inicialmente embriones.
   NOTA: Proceda a realizar el ensayo de pantalla que le interese. Detallada aquí en las secciones 8-10 es un procedimiento para procesar placas de pantalla con el deseo. Los métodos alternativos pueden ser sustituidos como se desee, a continuación, proceder a la Sección 11 y evaluar los resultados.

Permeabilización 8. Embrión

1. Utilice una pipeta de transferencia de plástico para dibujar-apagado el 4% PFA / PBS a partir de los embriones y lavar los embriones dos veces con 1x (solución salina tamponada con fosfato con Tween) PBST. La transferencia de los embriones en placas de 48 pocillos, a continuación, extraiga el 1x PBST de los embriones. Etiquetar las placas de 48 pocillos para que coincida con las localizaciones de pozos originales de la placa de 96 pozos profundos.
2. Lave añadiendo metanol al 100% a los pozos utilizando una pipeta de transferencia de plástico y luego dibujarlo fuera y añadir 100% metanol de nuevo para los embriones.
3. Coloque los embriones a -20 ° C, y se incuba durante al menos 20 min. Alternativamente, mantener los embriones en 100% de metanol a -20 ° C para almacenamiento a largo plazo.
4. Eliminar el metanol 100% y lavar los embriones con 50% de MeOH / 1x PBST, a continuación, MeOH al 30% / 1x PBST, y finalmente dos veces con 1x PBST.
   NOTA: Los embriones después de la fertilización mayores de 24 hr (HPF) se puede blanquear en este punto para eliminar la pigmentación ^39.
5. Añadir 15 l de proteinasa K descongelado de stock (10 mg / ml) a 50 ml de 1x PBST para preparar una proteinasa K (5 mg / ml) solución de trabajo.
6. Retire el 1x PBST de los embriones y añadir la solución de trabajo de proteinasa K. Retire la proteinasa K después de 4 min.
   NOTA: El experimentador debe trabajar con rapidez durante este paso para evitar la degradación del embrión. Concentración de proteinasa K y el período de incubación necesitan ser variado dependiendo de la edad de los embriones que está siendo tratado ^41. Los parámetros descritos aquí se refieren a los embrionesque son 24 HPF.
7. Lave los embriones con 1x PBST, a continuación, añadir helada PFA al 4% / PBS. Deje que los embriones se incuban en PFA al 4% / PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente.

9. La hibridación de la sonda y de eliminación

1. Usando una pipeta de vidrio transferencia quitar la PFA al 4% / PBS y lavar los embriones dos veces con 1x PBST. Vuelva a colocar el 1x PBST con 500 l de HYB ⁺ e incubar los embriones de 4 horas a 70 ° C.
   NOTA: Pre-hibridación se puede realizar para tan poco como 2 horas, 4 horas, pero es ideal. También, diferentes temperaturas de hibridación y de lavado pueden ser ideales para ciertas sondas, tales como 65 ° C, pero deben ser probados de forma individual.
2. Generar ribosondas marcadas con digoxigenina correspondientes al gen (s) de interés ^41.
3. Añadir 16 g de ribosonda a 16 ml de HYB ^+. Pre-calentar la ribosonda / HYB ⁺ solución a 70 ° C durante al menos 20 min antes de usar. Si el uso de múltiples sondas, añadir 16 g de cada sonda a la misma HVolumen YB ⁺ (16 ml).
4. Usando una pipeta de transferencia de vidrio, quite el HYB ⁺ y utilizar un P1000 añadir en 200 l de la ribosonda / HYB ⁺ mezcla. Invierta la ribosonda / HYB ⁺ cóctel justo antes de su uso y la pipeta hacia arriba y hacia abajo una vez antes de añadir la mezcla en cada pocillo. Utilice puntas de pipeta de barrera para agregar la ribosonda / HYB ⁺ solución, esto impide que el vapor de la mezcla entre en la pipeta.
5. Incubar los embriones en la ribosonda / HYB ⁺ cóctel en el 70 ° CO / N. Utilice una película adhesiva para cubrir los pocillos de la placa para el O / N de incubación de la sonda y todos los siguientes lavados calientes.
6. Preparar 50% formamida / 2x SSCT, 2x SSCT, y SSCT 0,2x y pre-caliente a 70 ° CO / N.
7. El uso de un P1000, retire la ribosonda / HYB ⁺ y guardar la mezcla a -20 ° C. Opcionalmente, vuelva a utilizar el ribosonda / HYB ⁺ mezcla hasta tres veces. Antes de cada reutilización, añadir en 3 g de ribosonda al ribopr originalesOBE / HYB ⁺ mezcla.
8. Usando una pipeta de transferencia vidrio, lavar dos veces con embriones 50% de formamida / 2x SSCT durante 30 min a 70 ° C. Lavar los embriones una vez con 2x SSCT durante 15 min a 70 ° C. Lavar dos veces con los embriones SSCT 0,2x durante 30 min a 70 ° C. Retire la SSCT 0,2x y lavar los embriones con MABT dos veces a temperatura ambiente.

10. Anticuerpo anti-digoxigenina incubación y detección

1. Utilice una pipeta de transferencia de vidrio para eliminar el MABT de cada pocillo. Usando una pipeta de transferencia de plástico, añadir solución bloque fresco a cada pocillo. Deje que los embriones se incuban en el bloque durante 4 horas a temperatura ambiente. Añadir 8 l de anticuerpo anti-digoxigenina a 40 ml de solución de bloqueo (dilución 5000 veces).
2. Con una pipeta de transferencia de plástico, reemplazar la solución de bloque con la solución de anticuerpo / bloque. Agregue suficiente solución de anticuerpo / bloque para cubrir completamente los embriones.
3. Cubrir la placa de 48 pocillos con papel de aluminio, por lo que la luz no puede penetrar a través de los embriones. IncUbaté los embriones O / N a 4 ° C. Con una pipeta de vidrio, quitar la solución de anticuerpos / bloque y lavar los embriones 10 veces con MABT durante 5-10 minutos cada uno.
   NOTA: Los lavados MABT pueden llevar a cabo de forma continua, ya que tendrá el investigador 5-10 minutos para eliminar MABT de cada placa y dispensar MABT fresco en los pocillos.
4. Generar dos tubos de 40 ml (80 ml total) de tampón de pre-tinción. Añadir 180 l de NBT (50 mg / ml) y 140 l de BCIP (50 mg / ml) a uno de los tubos preparados de tampón de pre-tinción para crear la solución de tinción.
   NOTA: Esta solución de tinción generará un sustrato de color púrpura.
5. Vuelva a colocar la MABT con tampón de pre-tinción y dejar que los embriones se incuban a temperatura ambiente durante 5 min.
6. Vuelva a colocar el buffer de pre-tinción con la solución de tinción y dejar a temperatura ambiente. Monitorear la reacción colorimétrica cada 15 minutos utilizando un microscopio estereoscópico.
   NOTA: reacciones de tinción pueden tomar desde unos pocos minutos a varias horas, dependiendo de la sonda.
7. Repata para la solución de tinción con 1x PBST después de la reacción de tinción es completa y luego lavar los embriones dos veces con 1x PBST durante 5 min.
8. Retire el 1x PBST y añadir 4% PFA / PBS para fijar los embriones.
   NOTA: Como alternativa, realizar un doble deseamos detectar ribosondas marcadas con un anticuerpo anti-fluoresceína. Si se realiza una doble in situ, omita la adición de 4% PFA / PBS (paso 10.9) después de la PBST de lavado 1x (paso 10.8) y lavar los embriones dos veces durante 15 min con 0,1 M de glicerol, dos veces durante 15 min con lavados MABT, y luego incubar los embriones durante 30 minutos en el bloque. A continuación, añadir el anticuerpo correcto O / N y realice los pasos 10.03 a 10.09 utilizando la solución de tinción correcto. Para detectar la ribosonda marcada con fluoresceína, preparar una solución de tinción con BCIP e INT para observar un sustrato de color rojo (consulte el paso 10.1).

11. Scoring las placas de embriones Screen Química

1. Realizar puntuación visual de los resultados usando un estereomicroscopio para evaluar la sampl embriónES en el ensayo de fenotipo.
2. Con una pipeta de transferencia de plástico, transferir los embriones de las placas de 48 pocillos de placas de 12 pocillos para la visualización óptima. Etiquetar las placas de 12 pocillos de modo que correspondan a las localizaciones de pozos de la placa de pozo original de profundidad 96. Cuando se complete la transferencia, ver bajo el microscopio estereoscópico.
   NOTA: embriones representativos pueden ser seleccionados de placas de 12 pocillos y la imagen en portaobjetos de vidrio bajo una hoja de la cubierta ^41.

Results

El enfoque manual descrito aquí permite un único investigador para llevar a cabo de manera eficiente y con éxito un alto rendimiento pequeña pantalla genética químicos de la molécula usando el modelo de embrión de pez cebra (Figura 1). El uso de este método, es práctico para una sola persona para realizar una pantalla de genética química, de tal manera que a lo largo de 9 semanas una persona (comprometido con una semana laboral de 40 horas) se puede llevar a cabo una encuesta de ~ 600 compuestos (Figura 1) . Por lo tanto, el tiempo de banco de una persona puede pasar por alto la necesidad de equipo de alta demanda de recursos, como los sistemas automatizados. La desventaja es que una pantalla manual requiere de varias semanas de esfuerzo dedicado. En contraste, el uso de sistemas automatizados puede comprimir el tiempo implicado en 1-2 semanas de tiempo de robótica, y puede implicar esfuerzo relativamente mínimo investigador general. Una forma de aumentar la eficiencia y / o el alcance de una pantalla manual es alistar 2-3 investigadores en total, lo que permitiría la detección de mcompuestos de mineral, variando la concentración del compuesto, y / o cribado durante un período de tiempo más corto.

Los pasos principales implicados en el protocolo para completar una pantalla de la genética química en embriones de pez cebra con una lectura de WISH se ilustran como un diagrama de flujo (Figura 2). Las tareas experimentales se pueden dividir en dos tipos de semanas de trabajo: (1) la exposición química y etiquetado de embriones, y (2) el análisis y diagnóstico por imágenes. En la semana de trabajo de la exposición química, estas medidas incluyen el establecimiento de adultos de pez cebra (día 1), de recogida de embriones, embriones arraying y tratamiento de drogas (Día 2), la preparación de embriones para la hibridación in situ (día 3), y la hibridación in situ (Día 4 -6). En la semana de análisis / imágenes, el investigador analiza la expresión del ARNm de anotar los embriones y los éxitos de imagen (día 7-11).

Una parte crítica de la realización de una pantalla genética química es etiquetar consistente y precisa así ubicaciones. Como la pantalla de la genética química process detalla aquí implica la transferencia de conjuntos de embriones a partir de un pozo en una placa a un pocillo en una placa diferente varias veces, la necesidad de un etiquetado preciso y claro es de suma importancia, por lo que cuando se anotó un golpe química puede ser linealmente y fácilmente remonta a su identidad dentro de la biblioteca química (Figura 3). Una manera fácil de asegurar esto es etiquetar las placas de tal manera que en cualquier momento la localización del pozo para un conjunto de embriones tratados por un compuesto coincide directamente la ubicación del pozo química biblioteca placa de fármaco del compuesto usado para el tratamiento de los embriones (Figura 3). Aquí, un doble sistema de etiquetas de código de colores y numéricos se utiliza para organizar las muestras, que se añadieron a las placas de pantalla utilizando marcadores permanentes (Figura 3).

Al analizar los resultados de una pantalla de alto rendimiento, hay una necesidad crítica de desarrollar un método para organizar correctamente, anotar y analizar el potencial de moléculas pequeñaséxitos. Por lo tanto, una pantalla de genética química debe tener un sistema de clasificación exhaustiva y clara que está diseñado con cuidado y respeten estrictamente. Tal sistema debe transmitir fácilmente y por completo la dinámica importantes de un compuesto y proporcionar una manera concisa de presentar los resultados de la pantalla final. Una forma de construir un sistema de este tipo es embriones grado que utilizan un sistema de clases, lo que explicaría la gravedad morfológica general y la confianza de un golpe. Además, las categorías de clase podrían acoplarse con un ⁽⁺⁾ o ^(-) para describir ya sea un efecto expansivo o reductora en la región (s) de interés. Aquí, los embriones de pez cebra fueron sometidos a compuestos individuales de una biblioteca bioactivos (Enzo Chemicals) de 50% a 24 epibolia HPF, y luego se ensayaron mediante desea usando un cóctel de tres ribosondas para detectar segmentos de la nefrona (Figura 4A). Como un sistema de clasificación ejemplo, un pozo que contiene un grupo de embriones que tenían un convolu proximal ampliado dramáticamenteTed túbulo (PCT) de los pronefros, el riñón embrionario de pez cebra, haría que el compuesto utilizado para tratar así que la calificación de (Clase I), que en este caso representaría la clase asociada con el defecto más grave y el más alto nivel de la confianza en el fenotipo observado (Figura 4B). El compuesto entonces sería anotado con (PCT) y un ^(+), siendo la notación completa (Clase I - PCT ⁺⁾ (Figura 4B). Este concepto de clasificación proporciona una manera simple y rápida para describir un tesoro de información relativa a una pequeña molécula de interés, incluyendo la severidad del efecto de compuestos en el organismo, la región que se ve afectada por la droga y la manera en que la región es afectado (Figura 4B).

Figura 1. & #160;. Estrategia Manual pantalla química embrión de pez cebra Un investigador puede probar factible una placa de 96 pocillos de productos químicos en embriones de pez cebra y realizar un procesamiento posterior DESEO durante una sola semana. Realización de dos semanas de pruebas químicas (Semana 1 (día 1-6) y la Semana 2 (día 7-12)) se puede combinar con una tercera semana dedicada a la muestra de análisis. Aproximadamente dos placas 96, así que vale la pena de muestras de pantalla pueden ser anotados y la imagen Semana 3 (día 13-17). Este escenario asciende a la proyección de aproximadamente 200 compuestos en un período de tiempo de 3 semanas, lo que equivale a una pequeña biblioteca de aproximadamente 600 compuestos completamente apantallados por 9 semanas. Esta estrategia manual puede ser modificado en función de los recursos disponibles. Por ejemplo, tres investigadores pueden reducir el tiempo para completar una pantalla de aproximadamente 600 compuestos de 3 semanas en comparación con las 9 semanas que tomaría con un investigador. Estrategias de detección pueden ser adaptados mediante la asignación de los investigadores a los aspectos específicos de la pantalla, como el tratamiento de drogasción e hibridación in situ o dirigir a los investigadores a realizar independientemente de todo el proceso de detección en partes separadas de la biblioteca química.

Figura 2. Diagrama de flujo:. Desglose de 6 días de flujo de trabajo de pantalla El proceso de selección químico puede ser discretamente divide en 6 días. Día 1 consiste en la creación de parejas de apareamiento pez cebra (= /> 25) para suministrar embriones para cada placa de 96 pocillos que se proyectarán. Día 2 incluye la recolección de los embriones de las cámaras de apareamiento y arraying ellos en una placa de 96 pozos profundos, seguido de tratamiento de drogas. En el Día 3, los embriones son preparados para desee, incluyendo dechorionation, la fijación del tejido, y la deshidratación embrión. Por último, deseo se realiza en los embriones a través de Día 4-6. Por favor, tenga en cuenta que los procedimientos de tinción alternativas sobre muestras fijadas pueden ser fácilmente substituted para DESEO.

Figura 3. Bandeja esquemática etiquetado transferencia. Embriones de pez cebra se disponen y de drogas tratados en una placa de 96 pocillos y luego se trasladó a una placa de 24 pocillos para la remoción de escombros y la exposición pronasa. Los embriones se trasladaron a placas de 48 pocillos para la preparación de embriones, deseo, y la fijación del tejido. A continuación, los embriones se transfieren a placas de 12 pocillos para la puntuación, formación de imágenes, y almacenamiento. Arraying precisa de embriones se realiza mediante el uso de un sistema de código de colores que permite al investigador realizar un seguimiento de la sustancia química de origen para cada muestra de prueba. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figura 4. Ejemplo de sistema de clasificación:. Ensayo de segmentación de riñón Un experimento DESEO permite al investigador manchar tipos celulares específicos basados ​​en la identidad de las sondas que están seleccionados, lo que permite la evaluación de los cambios en los fenotipos de embriones de acuerdo con los cambios en la ubicación de la transcripción del mRNA y / o niveles. A modo de ejemplo, tres segmentos del riñón embrionario de pez cebra, los pronefros, se marcaron utilizando Mix pantalla 1. Pantalla Mix 1 es un cóctel de sondas que consisten en wt1b, que se localiza específicamente en los podocitos (P), slc20a1a que marca el contorneado proximal túbulo (PCT), y slc12a1 que marca los primeros del segmento distal (DE) ^47. Un símbolo ⁽⁺⁾ junto a una etiqueta de región se utiliza para anotar la expansión o cambio positivo de esa región, mientras que un símbolo ^(-) se utiliza para dictar la disminución de una región. Aquí, embryos drogas tratados con 13-cis AR tiene un túbulo contorneado proximal ampliada y una pérdida completa de los primeros del segmento distal sin efecto aparente en los podocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Discussion

Genética química en el pez cebra puede hacer un impacto crítico en la progresión de descubrimiento de fármacos. Este protocolo proporciona un método de alto rendimiento para llevar a cabo manual de genética química en embriones de pez cebra con un deseo de lectura, lo que permite de manera efectiva un equipo individual o en pequeños para llevar a cabo una pequeña pantalla molécula. Este método de mínimo de recursos se extiende la viabilidad de la genética química a muchos grupos de investigación. En concreto, esta estrategia pantalla ofrece una importante alternativa al uso de instrumentación robótica, ya que tales sistemas no son ampliamente accesibles a través de los departamentos de investigación. Esta pantalla permite el manual de un solo individuo para poner a prueba una placa de 96 pocillos de compuestos con una lectura de WISH en una semana laboral de 6 días. Desde el pez cebra son ovíparos, con los embriones en desarrollo fuera de la matriz, y los embriones son lo suficientemente grandes como para ver con el ojo desnudo (entre 1-3 mm), son susceptibles de manipulación manual con instrumentos sencillos y el investigador puede muestras de matriz enplacas de múltiples pocillos sin el uso de un microscopio. Además, puesto que el pez cebra se desarrollan rápidamente, pequeña molécula de la exposición puede ser eficaz con un solo tratamiento de un compuesto, en lugar de dosis repetidas, lo que minimiza su posterior procesamiento manual. Embriones de pez cebra son fácilmente cultivadas porque su yema proporciona una fuente de nutrición hasta 5-6 días después de la fertilización, lo que elimina la complicación de alevines de alimentación. Además, la mayoría de los órganos de larvas han desarrollado y convertirse funcional durante este período, que ofrece la oportunidad de estudiar una amplia gama de preguntas de investigación. La simple adición de pequeñas moléculas a los medios de incubación de embriones es no invasivo y permite al investigador (s) para seleccionar la dosis del fármaco, el tiempo de adición, y la duración de la exposición de este modo proporcionar un estrecho control sobre muchas variables y permitir a los procesos de desarrollo específicas de interés para ser consultado. Tal como se describe aquí, productividad de la investigación significativa se puede lograr en un corto timefrAME el uso de esta metodología pantalla manual. En nuestra experiencia, hay un alto retorno sobre el esfuerzo invertido, que puede ser acentuado por el uso de una biblioteca química bioactivo conocido para analizar un proceso de interés, tales como la segmentación de nefronas durante el desarrollo renal (Figura 4; Poureetezadi y Wingert, sin publicar).

La pantalla químico manual descrito aquí es excepcionalmente versátil porque se trata de un ensayo en muestras de pez cebra fijos. Por ejemplo, esta estrategia puede ser revisado para probar varios platos de compuestos en una semana y luego anotar los embriones a la semana siguiente. Ensayos alternativos en muestras de pez cebra fijos, tales como los preparativos de inmunohistoquímica u otra tinción de tejidos, también podrían ser sustituidos por el deseo de lectura. Estrategias experimentales para llevar a cabo ensayos celulares en el pez cebra son adaptables debido a la claridad óptica y la transparencia de las etapas tempranas del desarrollo. Además, los investigadores pueden inhibir la pigmentación en sta tardeGES uso de productos químicos o evitar la complicación de desarrollo pigmento por completo mediante el uso de líneas genéticas en pigmentos como Casper o menos pura de pez cebra ^13. Es factible administrar manualmente pequeñas moléculas, procesar la mancha (s) de interés, y anotar manualmente embriones utilizando un sencillo microscopio estereoscópico. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el análisis automatizado de imágenes se podría realizar, y de hecho puede ser necesaria para el análisis de fenotipo de alta resolución. Por ejemplo, puede ser preferible para asociarse un sistema de análisis de imágenes automatizado con un ensayo directo, tal como un reportero transgénicos, ya que esto simplifica el procesamiento manual de las muestras, cuantifica las diferencias no son fácilmente discernibles a simple vista, y elimina el sesgo de investigador ^15. Afortunadamente, algunos sistemas de imágenes automatizados son a la vez fácil de usar y económico en términos de costos de software ^15. El uso y la capacidad de otros sistemas automatizados han evolucionado rápidamente y puedeser utilizado para los organismos orientar, administrar tratamientos con fármacos, e incluso de trasladar organismos ^12,15. Estos sistemas automatizados han anunciado una nueva era tecnológica de la investigación y han aportado soluciones innovadoras para manipular grandes cantidades de sujetos de prueba y por lo tanto realizar HTS y HCS enfoques en organismos enteros ^12,15. Si bien este tipo de máquinas son innegablemente útiles herramientas, que también son muy costosas y están fuera del alcance de muchos laboratorios de investigación básica. Sin acceso a estas capacidades automatizadas puede parecer que las pantallas de químicos no son posibles. Sin embargo, este protocolo describe una guía para cómo llevar a cabo una pantalla manual que se puede utilizar para completar una pantalla de la genética química de una manera práctica en un período de tiempo razonable.

Existen desventajas para ambos y químicas de detección genética manuales en general, y deben tenerse en cuenta al considerar una pantalla de química. En particular, el método ha demostrado aquí requiere un grado moderadode destreza física. Esta preocupación es disminuida o totalmente obviado través de la repetición, como la destreza mejorará con la práctica. Además, hay espacio para el error mínimo bruto, ya que sólo hay 10 embriones por pocillo para el análisis. Las moléculas pequeñas pueden variar en la penetrancia del fenotipo que es inducida, por lo que un régimen de puntuación razonable para identificar compuestos de interés se deben mantener. Es vital que los investigadores que utilizan este protocolo idear criterios rigurosos y adecuados para lo que van a considerar un éxito. También es importante tener en cuenta que la naturaleza de esta forma de la pantalla lo más probable es producir una cierta porción de falsos positivos, que pueden ser delimitados mediante una mayor química trabajo-up. Además, es crítico a la etapa embriones con precisión y para recoger los embragues para el cribado poco después de la fertilización, como desarrollo asincrónico puede conducir a complicaciones en evaluar con precisión el efecto de los tratamientos farmacológicos. Además, en lo que respecta a la detección química como un exestrategia experimental, hay una serie de limitaciones. La solubilidad del compuesto y la toxicidad de moléculas portadoras (por ejemplo, sulfóxido de dimetilo (DMSO)) pueden también presentan un problema y pueden ser prohibitivos en la prueba de muchas moléculas. El corion también puede actuar como barrera a la exposición al fármaco. Por último, a pesar de que el pez cebra son un modelo de gran alcance y de la traducción de la genética química, se debe siempre tenerse en determinar si una estrategia alternativa pantalla química, por ejemplo, usando un sistema in vitro como una línea celular, puede ser sustituido por el uso de todo animales. Sin embargo, el tratamiento químico en todo el sistema de pez cebra se considera preferible llevar a cabo enfoques similares en mamíferos, ya que proporciona la ventaja de reunir los efectos sistémicos de los compuestos y puede permitir a los investigadores para clasificar la lista de compuestos a ensayar en un modelo de mamífero.

Hasta la fecha, las pantallas químicos pez cebra han proporcionado una poderosa herramienta experimental to delinear los mecanismos de desarrollo y para determinar agentes farmacológicos candidatos para uso en medicina, tales como la identificación de moléculas capaces de prevenir patologías de la enfermedad. Por ejemplo, un estudio realizado por Burns y colegas desarrollaron un ensayo automatizado micro-bien para ritmo cardíaco usando embriones de pez cebra transgénicos que expresaban GFP en el miocardio ^42. Utilizaron esta línea transgénica para analizar la frecuencia cardíaca en el desarrollo y la forma en que se vio afectada en el tratamiento de drogas ^42. Otro estudio, probando la densidad de la población de células madre hematopoyéticas en el embrión de pez cebra, identificó que la prostaglandina E2 regula el nicho de HSC ^23. Este hallazgo fue validado en el ratón, y se llevó a cabo después de los ensayos clínicos en los trasplantes de cordón umbilical humana ^23,31-33 (NIH, Trials.gov Clínica, NCT00890500; NCT01627314). A través de varios estudios recientes, la genética química ha demostrado ser útil en el estudio de la enfermedad de riñón utilizando el pez cebra 43. El riñón pez cebra ofrece un excelente paradigma para estudiar nefrogénesis o regeneración de la nefrona, la unidad funcional que comprende el riñón durante el desarrollo y la lesión renal aguda ^43. Estructura Nephron está altamente conservada entre el pez cebra riñón embrionario y adulto riñón de mamífero ^44-50. Varios estudios que examinan el riñón embrionario de pez cebra ilustran claramente su potencial inherente de traslación cuando se combina con la genética química. Una pantalla genética química se realizó en dos mutantes de pez cebra que se asignan a la PKD2 y ift172 genes, que se sabe que son actores clave en la enfermedad renal poliquística (PKD) ^34. La pantalla resultó en la identificación de la desacetilasa pan-histona (HDAC) inhibidor de tricostatina A (TSA) como una molécula pequeña que podría anular los defectos morfológicos normalmente visto en los embriones mutantes. Un enfoque diferente adoptado por de Groh y colegas proyectó para los compuestos que Inducedema ed en embriones de pez cebra de tipo salvaje, lo que indicaría una alteración de la función renal ^35. Después de identificar PTBA como un éxito, observaron que además de causar edema, PTBA también aumentó la expresión de pax2a, un marcador de progenitores renales. Es importante destacar que, a continuación, se muestra un derivado de PTBA optimizado para disminuir el porcentaje de mortalidad de adultos de pez cebra que sufrió el daño renal inducido por la gentamicina y, además, acelera la recuperación de los ratones que sufrían de daño renal ^27. En conjunto, estas contribuciones de la genética química de pez cebra muestran los tipos de descubrimientos que se pueden hacer usando el método descrito en este protocolo.

Mientras que la investigación genética química tiene mérito sustancial, no está exenta de ciertos desafíos. Únicamente utilizando un enfoque de genética química puede hacer que sea complicado para determinar el gen o genes específicos que están siendo afectados por un compuesto. Incluso si se encuentra un objetivo (s), un SIbrecha gnificant puede permanecer entre la identificación de compuestos y la comprensión del mecanismo (s) de la acción en la que la molécula pequeña se comporta. Por ejemplo, puede ser difícil determinar el mecanismo en el que una molécula pequeña está actuando porque un solo compuesto es capaz de tener una gama de diferentes efectos dentro de un organismo. Sin embargo, con el advenimiento de las nuevas tecnologías y las pantallas de genética más químicos que se completó en el pez cebra, el problema de la determinación de un mecanismo se está reduciendo. Uno de los métodos para ayudar a determinar los efectos moleculares de compuestos identificados es seleccionar una biblioteca de medicamentos de bioactivos conocidos para la detección, donde los mecanismos pueden ser potencialmente deducen de los datos anteriormente anotado. Además, los algoritmos chemoinformatic, como puerta de Descubrimiento, están disponibles para el uso que se pueda comparar similitudes estructurales de un compuesto frente a una base de datos de compuestos con mecanismos atribuidos ^14. Sin embargo, otra manera de dilucidar el mecanismo de un compuesto sería generar un microarray perfil después del tratamiento y luego consultar este perfil en una recopilación de perfiles de drogas de microarrays, como el Mapa de Conectividad, en busca de compuestos mecánicamente definidos que provocan un efecto similar ^14. Este enfoque también se puede utilizar para identificar mutantes genéticos que tienen un efecto similar a la del compuesto de interés. Encontrar una conexión entre un compuesto y un mutante podría sugerir que el compuesto funciona molecularmente aguas arriba o aguas abajo del gen relacionado, lo que podría ser delineadas por tratamiento de los mutantes con el compuesto y morfolinos. Otra opción sería la espectrometría de masas, que continúa a ser más optimizado para el pez cebra. Este método puede ser usado para delinear los cambios específicos de la proteína o modificaciones después de la traducción después del tratamiento de drogas. Finalmente, las moléculas pequeñas o incluso bibliotecas enteras son a veces capaces de ser etiquetados para desplegable de parejas de unión. Es también digno de mención, que mientras que el mecanismo de cómo una pequeña molécula funciona is de importación significativa, hay medicamentos aprobados por la FDA para los que siguen siendo desconocidos los mecanismos.

Aunque el pez cebra presentan muchas similitudes con los mamíferos tanto genéticamente y fisiológicamente, todavía hay un problema de cruce de drogas ^14. Un estudio investigó la capacidad de cruce de los éxitos de una pantalla de inhibidores del ciclo celular en embriones de pez cebra ^50. La pantalla como resultado la identificación de 14 hits que antes eran desconocidos para poseer la actividad del ciclo celular. Fuera de estos 14 compuestos, 6 se encontró que tenían actividad del ciclo celular en ambos ensayos de cultivos celulares humanos y de pez cebra, 3 mostraron ser suero inactivado en ensayos de cultivo celular, 1 era activo sólo en las células de pez cebra, y 4 no tenía actividad en cualquiera pez cebra o ensayos de cultivos celulares humanos, pero sólo en todo el organismo del pez cebra. En particular, los compuestos 4 que sólo tenían actividad en el pez cebra demuestran que hay diferencias entre el pez cebra y mamíferos que pueden prohimordió el potencial de traslación de ciertos compuestos. Esta es una consideración importante a tener en cuenta, sin embargo, hay ejemplos de moléculas pequeñas, como PGE _2, que amplifica la capacidad de HSCs para injertar en los receptores humanos y PTBA derivados que mejoran la tasa de recuperación renal en mamíferos, proporcionando de este modo la prueba de principio de que cruce es posible ^23,31-33.

A pesar de estas dificultades, la genética química y este enfoque mínima de recursos tiene mucho que ofrecer a la comunidad de investigadores. La genética química es particularmente útil en el pez cebra y seguirán desempeñando un papel fundamental en el interrogatorio vía molecular y el descubrimiento de fármacos. Pantallas químicos a base de dianas moleculares discretos han estado siempre sometida a una alta tasa de fracaso debido a lo que se conoce como el conjunto de adsorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicológicos (ADMET) ⁵¹ propiedades. Pantallas químicos que utilizan el pez cebra paracentrarse en un proceso, en lugar de un objetivo discreto, puede eludir varios problemas ADMET e identificar compuestos que son eficaces en el contexto de todo el organismo. Con la creciente conjunto de recursos disponibles para la investigación de pez cebra, incluyendo cepas mutantes actuales y la capacidad de utilizar la edición de genoma para crear mutantes y transgénicos genéticos específicos, no hay prácticamente un número ilimitado de posibles pantallas genéticos químicas mediante el uso de pez cebra. Muchas bibliotecas químicas han sido curada, y colecciones palmo con bioactivos conocidos, compuestos novedosos, estructuralmente diversos y estructuralmente similares. Estos reactivos proporcionan una gran cantidad de interesantes oportunidades para las combinaciones de pantalla que están disponibles en la actualidad y es probable que crezca aún más en los próximos años. Con estas posibilidades en la mano, este protocolo manual y de alto rendimiento ofrece una forma práctica y fácil de usar para aumentar la capacidad de los grupos de investigación para llevar a cabo las pantallas genéticos químicos utilizando el pez cebra.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 - 10 μ l puntas de pipeta natural	USA Scientific	1111-3800
1x E3			Generar usando 50x E3 y agua DI.
1x PBST			genera 0.1% Tween-20 en 1x PBS.
10x PBS	American Bioanalytical	AB11072
plato de tinción de 12 pocillos	BD-Falcon	35-3225
20x SSC	American Bioanalytical	AB13156
placa de 24 pocillos	BD-Falcon	35-3226
4% PFA/1x PBS			Genere 4% de PFA (w/v) en 1x PBS: hierva, luego congele y almacene a -20 °C.
Placa de 48 pocillos	CytoOne	CC7672-7548
50x E3			Genera 16,5 mM de CaCl2, 16,5 mM MgSO4, 250 mM de NaCl y 8,5 mM de KCl en agua desionizada.
96 placa de pocillos profundos	VWR	100-11-940
96 estera de sellado de placa de pocillos	VWR	10011-946
anticuerpo anti-digoxigenina	Roche	11-093-274-910	Mantener a -20 °C.
Stock de BCIP	Sigma	B8503	Genere 50 mg/ml utilizando 100% DMF - congele y luego almacene a -20 °C.
Solución			Genere 50 ml con 10 ml de BSA (10%), 5 ml de FCS y 35 ml de MABT. (Descongelar BSA y FCS a 37 °C.)
Stock de BSA (albúmina sérica bovina)	American Bioanalytical	AB00448	Genere un 10% de BSA agitando las escamas de BSA en MAB a temperatura ambiente, luego congele y almacene a -20 ° C. (Mantenga las escamas de BSA sin usar a 4 ° C).
Reactivos de reacción de transcripción in vitro marcados con riboprobe DIG/FLU	Roche	11175025910; 11685619910	Consulte el procedimiento del fabricante.
DMF (dimetilformaldehído)	American Bioanalytical	AB00450
Inhibidor de la DNasa 1, 10x tampón de DNasa 1	Roche	4716728001
placa de incubación de embriones	Falcon	35-1005
epT.I.P.S 20-300 μ l	Eppendorf	22492284
Etanol (EtOH)	Sigma	E7023	Genere 50 ml de 70% de EtOH con grado molecular H2O y 100% de EtOH y luego almacene a -20 °C.
FCS (suero fetal de ternero)	Invitrogen	16140089	Mantener a -20 °C.
unidad de esterilización de filtro	Corning	430516	0.45 μ m CA / 1 L volumen
pinza fina	Roboz	RS-1050
tubo de microcentrífuga de fondo plano	VWR	87003-300; 87003-298
Formamida	American Bioanalytical	AB00600	Mantener a -20 °C.
lavabo de vidrio 90 x 50	Kimax Kimble	23000
pipeta de vidrio	VWR	14673-010
vial de vidrio	Wheaton
glicerol	Sigma	G7893
glicina	Sigma	G8898
glucógeno	Roche	10901393001
HYB+			Genere 50% formamida, 0.1% Tween-20, 5x SSC, 5 mg/ml de ARN de torula de levadura y 50 μ l/μ l heparina
INT stock	Sigma	I8377	Genere 55 mg / ml usando 70% DMF y 30% H2< / sub>O - congele y luego almacene a -20 ° C.
MAB			Genere añadiendo 55,0 g de Trisma base, 8 ml de 1 M de Tric-HCl pH 9,5, 23,2 g de ácido maleico y 17,5 g de NaCl a 1,5 L de H2O desionizado. A continuación, llene con H2O desionizado a 2 L y autoclave.
MABT			genera 0.1% Tween-20 en MAB
MeOH	Sigma	34860-4L
té de malla	Tienda de té en inglés	SKU # ASTR_KEN, MPN # 1705
agua destilada de grado molecular	Mediatech	25-055-CM
pipeta multi de 8 canales 0.5 - 10 &# 956; l	Eppendorf	3122000.019
pipeta multi de 8 canales 30 - 300 μ l	Eppendorf	3122000.051
nanodrop	Thermo	ND-2000c
NBT stock	Sigma	N6876	Genere 50 mg / ml usando 70% DMF y 20% H2< / sub>O - congele y luego almacene a -20 °C.
paraformaldehído	Servicios de microscopía electrónica	19210
Adhesivo de película PCR	Eppendorf	30127.48
contenedor de placa (caja de lápices)	Tampón
Genere			(Hágalo fresco para usar cada vez).
Pronase	Roche	11459643001	Genere 50 mg/ml usando E3, congele y luego almacene a -20 °C.
Proteinasa K	Roche	03-115-879-001	Genere 10 mg/ml en agua desionizada, luego congele y almacene a -20 °C.
Inhibidor de la ARNasa 1	Roche	3335399001
bulbo de goma	Fisherbrand Fisher Scientific	03-448-22
solución de tinción-púrpura	N/A	N/A	Generar usando 45 μ l de NBT y 35 μ l de BCIP por cada 10 ml necesarios en tampón previo a la tinción.
solución de tinción-rojo			Generar usando 31.5 μ l de INT y 35 μ l de BCIP por cada 10 ml necesarios en tampón previo a la tinción.
microscopio estereoscópico	Nikon	SMZ645, SMZ1000
T3 ARN polimerasa	Roche	11031171001
T7 ARN polimerasa	Roche	10881775001
pipeta de transferencia	Samco	202, 204
Tween-20 American	Bioanalytical	AB02038
baño de agua	Thermo	51221073	( Modelo # 2831)