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Artículo de método

Aislamiento y análisis funcional de las mitocondrias de las células cultivadas y ratón de Tejidos

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DOI:

10.3791/52076

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23 de marzo de 2015

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1Chemistry Department, Elon University, 2Department of Neurobiology and Anatomy, Wake Forest School of Medicine, 3Neuroscience Graduate Program, Wake Forest School of Medicine, 4ALS Center Translational Science Unit, Wake Forest School of Medicine

En este artículo

Resumen

La comparación del potencial de membrana mitocondrial entre muestras proporciona información valiosa sobre el estado celular. Se describen los pasos detallados para aislar las mitocondrias y evaluar la respuesta a los inhibidores y desacopladores mediante fluorescencia. El método y la utilidad de este protocolo se ilustran mediante el uso de un cultivo celular y un modelo animal de estrés celular.

Resumen

La comparación entre dos o más grupos distintos, como sanos vs. enfermos, es necesaria para determinar el estado celular. Las mitocondrias se encuentran en el nexo de la salud celular debido a su papel tanto en el metabolismo celular como en la producción de energía, así como en el control de la apoptosis. Por lo tanto, la evaluación directa de las mitocondrias aisladas y la perturbación mitocondrial ofrece la capacidad de determinar si se está produciendo una (dis)función específica del orgánulo. Los métodos descritos en este protocolo incluyen el aislamiento de mitocondrias intactas y funcionales de células cultivadas en HEK e hígado y médula espinal de ratón, pero se pueden adaptar fácilmente para su uso con otras células cultivadas o tejidos animales. La función mitocondrial evaluada por TMRE y el uso de desacopladores e inhibidores mitocondriales comunes junto con un lector de placas fluorescentes permiten que este protocolo no solo sea versátil y accesible para la mayoría de los laboratorios de investigación, sino que también ofrezca un alto rendimiento.

Introducción

Las células vivas banco de energía metabólica en forma de grasas e hidratos de carbono y el uso de esta energía para la biosíntesis, transporte de membrana y el movimiento. Parte de la energía se obtiene en el citosol a través de la conversión de los azúcares de la dieta directamente en ATP durante la glucólisis. Sin embargo, la principal fuente de producción de ATP en una célula es aprovechada dentro de la mitocondria a través de la cadena respiratoria mitocondrial 1. La arquitectura de las mitocondrias proporciona la orientación espacial necesaria para la producción de ATP eficaz y eficiente. Las mitocondrias poseen una doble membrana separadas por un espacio intermembrana y junto con la matriz, el compartimento mitocondrial más interior, la casa de los componentes y coordinar las reacciones químicas implicadas en la generación de ATP. La membrana interna contiene una serie de complejos de proteínas unidas a la membrana que comprenden la cadena respiratoria así como la ATP sintasa, el complejo de proteína que trae ADP y Pi juntos para la formación de ATP. La posadamembrana del ER se dobla en crestas y los electrones se pasan a lo largo de los complejos de la cadena respiratoria por medio del citocromo c, un portador de electrones soluble que se mueve entre los complejos dentro del espacio intermembrana. Como los electrones se mueven, la oxidación de equivalentes reductores se produce y los iones de hidrógeno se bombea desde la matriz al espacio intermembrana. Como consecuencia de la alta concentración de iones dentro del espacio intermembrana, un gradiente electroquímico construye lo que resulta en un potencial de membrana a través de la membrana mitocondrial interna (Δψ) 2. El oxígeno es el aceptor final de electrones de la cadena de transporte de electrones y iones de hidrógeno fluya a través de las ATP sintasas desde el espacio intermembrana de nuevo a la matriz, y al hacerlo directamente causar la formación de ATP. Este proceso tal como se describe en su totalidad se conoce como la fosforilación oxidativa. Los pliegues de las crestas aumentan el área de superficie de la membrana interna, lo que permite el transporte de electrones máxima y la producción de ATP dentro decada mitocondria. Las proteínas, enzimas y otras moléculas implicadas en la fosforilación oxidativa se derivan de ambos genes nucleares y mitocondriales. Las mitocondrias contienen su propio ADN circular, que codifica para 13 proteínas así como ARNt y ARNm necesarias para la producción de ATP 3. Sin embargo, se requieren muchas más proteínas y por lo tanto son nuclear codificada. La mayoría de estas proteínas codificadas en el núcleo están dirigidos a la matriz mitocondrial mediante el uso de presecuencias en el extremo N-terminal de la proteína precursora, y su importación es impulsado en parte por Δψ 4,5.

Más allá de contribuir a la bioenergética de una célula, las mitocondrias también influyen en importantes procesos metabólicos tales como TCA y beta-oxidación, la señalización celular a través de la regulación de calcio, así como un papel clave en la apoptosis 6. En concreto, durante los momentos de estrés celular, las proteínas Bcl-2 la familia que residen en o interactúan en la membrana externa mitocondrial puede causar mitocondrialpermeabilidad de la membrana exterior (MOMP) 7,8. Durante MOMP, el citocromo c y otras proteínas se liberan en el citosol, y junto con varias proteínas citosólicas forman un complejo llamado el apoptosome 9,10. El apoptosome activa las caspasas que van a escindir las proteínas celulares y el ADN durante la fase de ejecución de la apoptosis. Tan pronto como se produce MOMP, ΔΨ se derrumbó y la producción de ATP se detuvo. Por lo tanto la función mitocondrial, como apoptosis se inicia se ve comprometida y los cambios en ΔΨ puede ser correlacionada con la salud mitocondrial y celular 12. Mientras que la apoptosis es un punto final en muchos modelos de la enfermedad, la función mitocondrial y cambios a ΔΨ también puede proporcionar información valiosa acerca de originación y / o progresión de la enfermedad. Por ejemplo, los cambios estructurales y funcionales mitocondriales se han documentado durante el curso de enfermedades neurodegenerativas 13,14.

En la primera parte del protocolo, isomento de las mitocondrias intactas que conservan su ΔΨ se describe. Células HEK-293T fueron expuestas a diferentes concentraciones y combinaciones de TNF-α recombinante, IL1-β e IFN-γ para inducir apoptosis. Estas citoquinas fueron elegidos porque son frecuentes a ser alta en muestras sépticos humanos primarios 15 y la vía extrínseca de la apoptosis puede ser desencadenada por la interacción de unión a su receptor TNF-α 6. Puesto que hay variaciones sutiles necesarias para aislar las mitocondrias funcional a partir de tejidos primarios en comparación con células cultivadas, y porque mucha investigación utiliza animales, el protocolo también describe cómo aislar las mitocondrias a partir de hígado y médula espinal de antero esclerosis lateral (ALS) modelo de ratón.

La segunda parte del protocolo fue desarrollado para monitorear a las perturbaciones del potencial de membrana mitocondrial usando un colorante fluorescente sensible al potencial con un lector de placa fluorescente. Diferencias entre el estado celular (es decir, sanos vs. poco saludable) se diferencian por la cuantificación de la fuerza de ΔΨ de mitocondrias aisladas en conjunción con agentes de desacoplamiento, inhibidores de la cadena respiratoria, inhibidores de complejos y ionóforos, todos los cuales causan la disipación del potencial de membrana mitocondrial. El saludable las mitocondrias, mayor es el cambio en ΔΨ tras el tratamiento con inhibidores mitocondriales, por lo tanto, la respuesta de las mitocondrias se puede utilizar como un indicador de la función mitocondrial (dys).

El uso de mitocondrias aisladas en lugar de en la evaluación in situ de función ofrece evidencia definitiva de que una patología o tratamiento modula directamente los cambios en el orgánulo 16-18. Si bien existen métodos en la literatura para aislar las mitocondrias a partir de células cultivadas, que son vagos 17 y / o utilizan equipo especializado 16. Este protocolo describe en detalle el método de aislamiento y esfácilmente adaptable a otras líneas celulares, incluyendo el tejido primario y culturas 13,14,19,20. Muchos estudios mitocondrias aisladas utilizan los mismos desacopladores e inhibidores mitocondriales utilizados en este protocolo, pero con un electrodo de Clark (figura 21 es un ejemplo representativo de muchos trabajos en la literatura), que a su vez es una pieza muy específica y especializada de los equipos. Además, este método tradicional tiene limitaciones tales como un bajo rendimiento y alta complejidad 22,23 y requiere una cantidad sustancial de las mitocondrias (~ 500 g / reacción). En este protocolo, el fluorescente potencial de membrana TMRE sonda de detección se utiliza en conjunción con un lector de placas fluorescente, que es una máquina estándar en muchos laboratorios. TMRE es ampliamente considerado ya que rápidamente entra en las células y las mitocondrias aisladas y se puede utilizar en concentraciones bajas 24. Múltiples reacciones rápidamente se pueden configurar en tándem y lotes analizados mediante este protocolo. Además, la reacción des requieren una pequeña cantidad mucho de las mitocondrias aisladas (~ 10 g / reacción). Al requerir menos material, muestras de tejido o cultivo de células más pequeñas se pueden utilizar como punto de partida para el aislamiento de las mitocondrias, más repeticiones o reacciones se pueden configurar, y material potencialmente suficiente para otros experimentos mitocondrias aisladas, tales como la producción de ATP, el consumo de oxígeno, o la importación ensayos son posibles.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se ajustaban a los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por la Universidad de Wake Forest Cuidado de Animales y el empleo Comisión. Las parejas reproductoras para SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] modelo de ratón se obtuvieron de El Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME). De tipo salvaje (WT) hembras y machos SOD1G93A no transgénicos [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] fueron criados para generar ratones SOD1G93A y WT littermates no transgénicos que fueron utilizados en los experimentos.

1. Modelos de Investigación

  1. Cultivo celular
    1. Mantener las células de riñón embrionario humano (HEK-T293) células en DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado térmicamente, 1% de penicilina-estreptomicina, y 1% de L-glutamina, a 37 ° C en 5% de CO 2.
    2. Se cultivan las células en frascos T75 y deje que alcancen el 90% de confluencia.
    3. Llevar a cabo la división celular a través de tripsinización (0.25% de tripsina-EDTA) durante 3-5 min a 37 ° C en 5% de CO 2 , La inactivación de la tripsina con igual volumen de medio celular, y la centrifugación de las células durante 5 min a 700 xg en 4 ° C.
    4. Aspirar los medios de comunicación y volver a suspender el sedimento celular en medio de cultivo.
    5. Células de semillas en el frasco o placa apropiada 7 x 10 4 células en un frasco T75 48 horas antes de citoquinas tratamiento. Esto debería dar ~ 70% de la densidad en el momento del tratamiento.
    6. Células dejan a estos suero 24 horas más tarde mediante la aspiración de los medios de comunicación y su sustitución por el mismo volumen de medio libre de suero (DMEM, estéril).
    7. Preparar el TNF-α, IL1-β e IFN-γ, desde polvo liofilizado con agua ultra pura en concentraciones de trabajo de 5 pg / l, 10 ng / l, y 10 ng / l, respectivamente, y añadirlos a los pozos / frascos.
    8. Suero Treat células de hambre mediante la adición de citoquinas solubilizadas directamente a los medios de cultivo de células de matraces apropiados. Los tratamientos consistieron de citoquinas individuales, un cóctel de todos los 3 (en lo sucesivo "* 3"), o sterile agua como control (denominado como "0").
    9. Incubar las células tratadas durante 24, 48 o 72 hr antes de la evaluación y la cosecha.
  2. Evaluación de la viabilidad de la célula
    1. Hacer una solución de 5 mg / ml de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) en 1X PBS.
    2. Para placas de 12 pocillos, añadir 100 l de solución de MTT a cada pocillo y agitar suavemente para asegurar una distribución uniforme.
    3. Incubar las placas durante 15 minutos-1 hora a 37 ° C en el 5% de CO 2, y se les presentarán bajo un microscopio para detectar la presencia de coloración púrpura. Si no está presente púrpura, agitar de nuevo y permiten a las células se incuban en intervalos de 5 minutos hasta que se observa de color púrpura. La cantidad de tiempo necesario debe ser determinado por cada investigador.
    4. Usando una pipeta de repetición, añadir 700 l de MTT disolvente (HCl 4 mM y 0,1% de NP40 en isopropanol) a cada pocillo y la placa de roca (s) a temperatura ambiente durante 5-10 minutos, o hasta que todo el color púrpura había dejado las células . Si púrpurael color no sale de las células, agregar un adicional de 200 l de disolvente y continuar a girar.
    5. Para el análisis, tomar 100 l de cada pocillo y colocar en una placa de 96 pocillos y leer en un lector de placas utilizando 570 nm y una longitud de onda de referencia de 630 nm, 595 nm, sin embargo también es aceptable siempre y cuando las lecturas se toman a una configuración coherente.
  3. Modelo Animal de ALS
    1. Todos los experimentos con animales se ajustaban a los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por la Universidad de Wake Forest Cuidado de Animales y el empleo Comisión. Las parejas reproductoras para SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] modelo de ratón se obtuvieron de El Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME). De tipo salvaje (WT) hembras y machos SOD1G93A no transgénicos [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] fueron criados para generar ratones SOD1G93A y WT littermates no transgénicos que fueron utilizados en los experimentos.
    2. Realizar genotipado con cebadores estándar contra SOD1 mutante 25.

2. Aislamiento de las mitocondrias

NOTA: Es importante trabajar con rapidez y mantener todo en hielo durante todo el procedimiento.

  1. Preparación de tampón de aislamiento mitocondrial (MIB), tampón de aislamiento de la médula espinal (SC MIB) y tampón experimental (EB)
    1. Preparar las siguientes soluciones madre antes de tiempo para MIB y EB.
    2. Hacer 1 M Tris / MOPS disolviendo 12,1 g de base Tris en 70 ml de H 2 O. Añadir MOPS secos para conseguir el pH a 7,4. Ajuste el volumen al 100 final ml. Se esteriliza con filtro y se almacena a 4 ° C.
    3. Hacer 1 M Kphos mezclando 80,2 ml de K 2 HPO 4 y 19,8 ml de KH 2 PO 4. Guarde a temperatura ambiente.
    4. Hacer 0,2 M EGTA / Tris mediante la adición de 3,8 g de EGTA a 10 ml de H 2 O. Añadir 1 M Tris / MOPS hasta disueltos, ~ 30-40 ml. Ajuste a 50 ml, filtro estéril y se almacena a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que el pH será ~ 6,7.
    5. Hacer 1 M glutamato haciendo 10 ml deSolución de ácido glutámico 1 M. Se esteriliza con filtro y almacenar 4 ° C.
    6. Hacer 1 M Malate haciendo 10 ml de solución de ácido málico 1 M. Añadir Tris / MOPS 50 mM. Se esteriliza con filtro y se almacena a 4 ° C.
    7. Hacer MIB a una concentración de sacarosa 200 mM, Tris 10 mM / MOPS, pH 7,4, y 1 mM EGTA / Tris. Se esteriliza con filtro y se almacena a 4 ° C.
    8. Hacer SC MIB a una concentración de sacarosa 250 mM, 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, KCl 10 mM, 1,5 mM de MgCl 2, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, y cóctel inhibidor de la proteasa.
    9. Hacer EB a una concentración de 125 mM KCl, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, 5 mM de glutamato, malato 2,5 mM, 1 mM de fosfato de K, pH 7,4, y 10 mM EGTA / Tris. Se esteriliza con filtro y se almacena a 4 ° C.
  2. Preparativos de los equipos antes de recoger las células.
    1. Enjuague un pequeño recipiente de vidrio y homogeneización maja tres veces con agua estéril y colocar en hielo.
    2. Reúna los elementos necesarios, tales como un taladro estándar, scra celularpers, 1,5 ml, 15 ml y 50 ml tubos y soluciones.
  3. Aislamiento Las mitocondrias
    1. Las células cultivadas
      1. Para cada tipo de muestra, utilizar dos matraces T175 de células.
      2. Asegurar que las células son ~ 90% de confluencia y el uso en experimentos de control, o la placa y tratar como se describió anteriormente en el paso 1.2.
      3. En la parte superior del banco, los medios de comunicación Aspirar y lavar las células adherentes dos veces con 15 ml de 1x PBS cada vez.
      4. Aspirar el tampón y raspar frascos para eliminar las células adherentes del fondo del matraz.
      5. Añadir 15 ml de 1x PBS a cada frasco, remolino, y transferir a los distintos tubos de 15 ml cónicos y lugar en el hielo.
      6. Una vez raspado se realiza, centrifugar los tubos durante 5 min a 700 xg, 4 ° C utilizando una centrífuga de mesa usando un rotor de cubeta oscilante.
      7. Sobrenadantes Aspirar y resuspender cada sedimento en 1 ml de MIB.
      8. Combinar ambas suspensiones y transferir a un pequeño recipiente de vidrio para la homogeneización.
      9. Añadir MIBal recipiente hasta que alcanza el tampón de primera línea. Homogeneizar las células con la mano del mortero conectados a un taladro a velocidad media durante tres pasadas. Asegúrese de que el buque se encuentre en el hielo durante este paso, no para quitar la mano del mortero por encima del líquido y usar una velocidad constante con pases continuos.
      10. Transferir la solución homogeneizada a un tubo cónico de 50 ml.
      11. Aspirar la solución en una jeringa de 3 ml usando un manómetro 18 de la aguja 1 ½ pulgadas y expulsar de nuevo en el tubo cónico en hielo con un calibre de 27 ½ pulgadas aguja. Tener cuidado para expulsar la solución contra la pared interior del tubo como para utilizar esa fuerza para disrupción de la membrana celular.
      12. Repita los pasos de jeringas para un total de cinco veces.
      13. Transferir la solución a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar durante 5 min a 600 xg, 4 ° C en una centrífuga de mesa usando un rotor de cubeta oscilante.
      14. Retire con cuidado el sobrenadante y distribuir entre los tres tubos de 1,5 ml.
        NOTA: Mitochondria son en el sobrenadante después de esta primera, spin-baja velocidad, mientras que las membranas celulares y las células intactas se sedimentan.
      15. Tubos de centrífuga en un rotor de ángulo fijo a 10.000 xg, 4 ° C durante 5 min.
      16. Sobrenadantes Aspirar y combinan las pastillas en 100 l MIB y colocan inmediatamente en hielo.
        NOTA: Las mitocondrias son en el sedimento después de este giro de alta velocidad. Las mitocondrias normalmente mantienen su potencial de membrana para ~ 2-3 ion hielo después de aislamiento y son más estables como una solución madre concentrada en MIB.
    2. Las mitocondrias aislamiento a partir de tejido de ratón
      1. Anestesiar el ratón, según el protocolo del IACUC. Establecer un vaporizador en el 5,0% para inducir la anestesia. Confirmó que el animal está anestesiado por la falta de reflejo para pizca pie o reflejo de parpadeo cuando el ojo se acerca o golpeó con un hisopo de algodón. Mantenga el ratón bajo anestesia durante todo el procedimiento quirúrgico manteniendo el vaporizador entre 1,5% y 2,0%.
      2. Excise el hígado y la médula espinal de cada animal y el lugar por separado en el hielo frío PBS 1x - / - para retirar cualquier sangre.
      3. Para el hígado, el tejido transferir a un plato de pesaje en hielo y cortar en trozos finos usando una cuchilla de afeitar fresco durante 1 min.
      4. Añadir el tejido y el tampón apropiado (MIB para el hígado o SC MIB para la médula espinal) al recipiente hasta que alcanza el tampón de primera línea. Homogeneizar los tejidos con la mano del mortero con la mano durante cinco pases. Asegúrese de que el buque se encuentre en el hielo durante este paso, no para quitar la mano del mortero por encima del líquido y usar una velocidad constante con pases continuos.
      5. Transferencia de los homogeneizados para limpiar tubos de 15 ml.
      6. Tubos de centrífuga en un rotor de ángulo fijo a 750 xg, 4 ° C durante 10 min.
      7. Guarde los sobrenadantes en tubos limpios y colocarlos en hielo.
        NOTA: Las mitocondrias son en el sobrenadante después de esta primera, spin-baja velocidad, mientras que las membranas celulares y las células intactas se sedimentan.
      8. Vuelva a suspender los pellets de la médula espinal in 500 l de SC MIB.
      9. Vuelva a homogeneizar cada tres veces, sólo llenar el vaso medio camino con SC MIB este momento.
      10. Transferir la nueva homogeneizado a un tubo nuevo.
      11. Centrifugar la en un rotor de ángulo fijo a 750 xg, 4 ° C durante 10 min.
      12. La combinación de estos nuevos sobrenadantes, que contienen más mitocondrias, con el primer sobrenadante de cada muestra.
      13. Tubos de centrífuga en un rotor de ángulo fijo a 10.000 xg, 4 ° C durante 5 min.
      14. Sobrenadantes Aspirar y volver a suspender los pellets de hígado en 500 l de MIB y los pellets de la médula espinal en 50 l SC MIB y colocar inmediatamente en hielo.
        NOTA: Las mitocondrias son en el sedimento después de este giro de alta velocidad. Las mitocondrias normalmente mantienen su potencial de membrana para ~ 2-3 ion hielo después de aislamiento y son más estables como una solución madre concentrada en MIB.
      15. Realizar un ensayo de concentración de proteína para estimar la concentración de las mitocondrias en solución. Siga las instruccioness para el uso de un kit de ensayo de proteína comercial o método similar 26. Las concentraciones típicas de las mitocondrias son: frascos T175 rendimientos 2 ~ 2 mg / ml, 1 hígado de ratón ~ 3-5 mg / ml, y 1 médula espinal de ratón ~ 1-3 mg / ml.
  4. C Ensayo citocromo utilizando un I + D de rata / ratón citocromo c Quantikine Kit ELISA (adaptado del protocolo proporcionado por el fabricante).
    1. Inmediatamente antes de la creación de las reacciones, diluir las mitocondrias a / ml concentración de trabajo de 0,5 mg de EB y distribuir mitocondrias diluido en tubos de 1,5 ml para las reacciones (típicamente 30-50 l de mitocondrias por tubo).
    2. Añadir ya sea EB o DMSO, a 1% del volumen total, a la mitocondria diluidos y se incuban las reacciones en la mesa de laboratorio durante 7-10 min. Estas reacciones son estables hasta por 30 minutos a temperatura ambiente si se necesita un plazo más largo.
    3. Mitocondrias precipitado mediante centrifugación en un rotor de ángulo fijo a 10.000 xg, 4 ° C durante 5 min y cuidadosoLy separar el sobrenadante y colocar cada uno en un separadas tubos de 1,5 ml.
      NOTA: Los tubos pueden ser o bien se congeló a -20 ° C para su posterior análisis o usarse inmediatamente.
    4. Determinar la liberación de citocromo c por una comparación de la concentración de citocromo c en el sedimento y el sobrenadante 27.
      1. Preparar las muestras mediante la solubilización de los pellets en el volumen original de la reacción con 0,5% TX-100 en 1X PBS.
      2. Para cada muestra, preparar 2 pocillos de la placa ELISA, uno para el pellet ahora solubilizado y uno para el sobrenadante de la reacción por adición de 100 l de citocromo c conjugado (usar directamente fuera de la botella), además de 100 l de 0,5% Tx- 100 en 1X PBS, y luego, de la muestra de pellets o sobrenadante.
      3. Agite suavemente la placa a temperatura baja (nivel 2-4) durante 20 segundos para mezclar, cubrir e incubar durante 1 hora, 37 ° C.
      4. A continuación, lavar la placa cuatro veces con tampón de lavado diluido de acuerdo con la Productoresinstrucciones de er. Retire el exceso de solución golpeando los pozos en una toalla de papel.
      5. A continuación, añadir 150 ml de 1: 1 A + B solución de desarrollo a cada pocillo e incubar la placa durante 20-30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
      6. Por último, añadir 50 l de solución de parada a cada pocillo y tomar lecturas de absorbancia a 540 nm usando un lector de microplacas. Calcular la cantidad de la liberación del citocromo c mediante la comparación de la cantidad de citocromo c en el sedimento vs. sobrenadante para cada reacción.

3. Evaluación de la función mitocondrial (Dys)

  1. Inmediatamente antes de las reacciones se configuran, diluir las mitocondrias a 0,5 mg / ml concentración de trabajo con EB y se coloca en tubos de 1,5 ml para las reacciones (típicamente 30-50 l de las mitocondrias se utilizan por tubo).
  2. Tratamientos mitocondriales
    1. Añadir tratamientos adecuados (control EB, 1 mM FCCP mezcla con 50 nM valinomicina, 10 mM rotenona, 5 oligomicina mu M, 2 mM de KCN, o 200 mM ADP, concentraciones finales) para separar las reacciones en 1/10 del volumen total de las mitocondrias diluidas. Se incuban las reacciones sobre la mesa de laboratorio durante 7 min.
      NOTA: Se debe tener cuidado al manipular estas sustancias como la ingestión accidental o absorción a través de la piel podría ser perjudicial.
    2. Diluir TMRE, reconstituida en agua estéril a una concentración de trabajo de 100 mM y se almacenaron a -20 ° C, a 2 M y añadir un volumen igual al volumen de reacción mitocondrial.
    3. Se incuban las reacciones sobre la mesa de laboratorio durante 7 min.
    4. Mitocondrias precipitado mediante centrifugación en un rotor de ángulo fijo a 10.000 xg, 4 ° C durante 5 min.
    5. Medio de carga del volumen de sobrenadante de cada muestra en una placa de 396 pocillos y se lee la fluorescencia.
      NOTA: longitudes de onda de excitación y emisión de TMRE deben optimizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el volumen y la placa que se utilizará parael ensayo. El uso de un 384 pocillos placa estándar negro con 25 l de 1 mM TMRE (concentración final de reacción) se obtuvo la señal más fuerte utilizando longitudes de onda de excitación / emisión   485 nm / 535 nm.
    6. Calcular el pliegue diferencia en fluorescencia entre el control (EB) y cada tratamiento dividiendo el valor de fluorescencia relativa (RFU) obtenido a partir del lector de placas para la muestra experimental por el RFU de la muestra de control.

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Resultados

El tratamiento de células HEK-293T con 200 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, y 75 ng / ml de IFN-γ (* 3) durante 24-48 hr conduce a cantidades progresivas de la muerte celular (Figura 1A ). La viabilidad celular se evaluó mediante ensayos de MTT y consistentemente demuestra que no es de ~ 10% de disminución en la viabilidad celular con el tratamiento 24 hr y ~ disminución del 20% con el tratamiento 48 hr. Las células tratadas con concentraciones similares (100 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, y 75 ...

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Discusión

El tratamiento de células HEK-293T con citoquinas recombinantes hace que cantidades moderadas de la muerte celular durante 48 hr (Figura 1). La cantidad de muerte celular inducida por el tratamiento TNF-alfa es similar a los estudios reportados previamente 30 y la viabilidad celular disminuye después de la co-administración de múltiples citoquinas que son mayores que las cantidades acumulativas con cualquier citoquina sola también es coherente con la literatura 31,32. La capacidad ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada en parte por la subvención NSF CHE-1229562 (VDGM), la Oficina de Investigación de Pregrado de la Universidad de Elon, el Departamento de Química de Elon y el Premio Elon Lumen (TL y TAD), el Programa de Becarios de Elon College (JAC) y el Programa de Honores de Elon College (TAD).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido L-glutámicoSigmaG1251Puede usar la sal de potasio en su lugar.
ácido málicoSigmaM8304Puede usar la sal de potasio en su lugar.
KH2PO4SigmaP0662
K2HPO4SigmaP3786
EGTASigmaE3889
Trisma baseSigmaT6066
MOPS SigmaM3183
CCCPSigmaC2920Diluir hasta 100   μ M como material de trabajo en etanol y almacenar a -20  °C.
ValinomycinSigmaV0627Hacer en DMSO y usar como 5  μ M material de trabajo. Almacene a -20  °C.
sacarosaFisherS5-500
KCNMallinckrodt6379Hacer un caldo concentrado en etanol y luego diluir con agua 
rotenonaSigmaR8875Altamente tóxico. Fabricado en etanol.
oligomicinaSigmaO4876Altamente tóxico. Fabricado en etanol.
ADPSigmaA2754
TMRESigma8717-25mgDiluido 100  μ M stock con EB inmediatamente antes de su uso.
DMEMGibco11965-0841x regular (glucosa alta).
Pluma/EstreptococoInvitrogen15140-155
L-glutaminaFisher SH3002101Almacene alícuotas a -20  ° C
FBSLonza14-501F Origenestadounidense, calidad premium. Inactivar el calor y almacenar alícuotas a -20  °C.
Tripsina-EDTASigmaT4049
DMSOSIgmaD2650
Colorante de ensayo Protien (5x)Bio-Rad500-0006Cualquier ensayo de proteínas puede sustituir.
BSAFisherBP1600-100Prepare 2 mg/ml de caldo en agua para el ensayo de proteínas.
MTT polvoSigmaM2128Filtro esterilizante 5 mg/ml caldo fabricado en PBS. Almacene las alícuotas a -20  ° C; tienda en 4  ° C hasta por 1 semana.
Solución de Tergitol (NP-40)SigmaNP40S
IL-1B humano recombinanteGibcoPCH08014Una vez abierto tienda alícuotas a -20  ° C
TNF-alfa humano recombinanteGibcoPHC3015L
GibcoIFN-gamma humano recombinantePHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)SigmaD8537Asegúrese de que no tenga iones Mg2+ y Ca2+ iones.
Cytochrom c kit ELISAR& Sistemas DDTC0Humano para células HEK-293T.

Referencias

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