Aislamiento y análisis funcional de las mitocondrias de las células cultivadas y ratón de Tejidos

Resumen

La comparación del potencial de membrana mitocondrial entre muestras proporciona información valiosa sobre el estado celular. Se describen los pasos detallados para aislar las mitocondrias y evaluar la respuesta a los inhibidores y desacopladores mediante fluorescencia. El método y la utilidad de este protocolo se ilustran mediante el uso de un cultivo celular y un modelo animal de estrés celular.

Resumen

La comparación entre dos o más grupos distintos, como sanos vs. enfermos, es necesaria para determinar el estado celular. Las mitocondrias se encuentran en el nexo de la salud celular debido a su papel tanto en el metabolismo celular como en la producción de energía, así como en el control de la apoptosis. Por lo tanto, la evaluación directa de las mitocondrias aisladas y la perturbación mitocondrial ofrece la capacidad de determinar si se está produciendo una (dis)función específica del orgánulo. Los métodos descritos en este protocolo incluyen el aislamiento de mitocondrias intactas y funcionales de células cultivadas en HEK e hígado y médula espinal de ratón, pero se pueden adaptar fácilmente para su uso con otras células cultivadas o tejidos animales. La función mitocondrial evaluada por TMRE y el uso de desacopladores e inhibidores mitocondriales comunes junto con un lector de placas fluorescentes permiten que este protocolo no solo sea versátil y accesible para la mayoría de los laboratorios de investigación, sino que también ofrezca un alto rendimiento.

Introducción

Las células vivas banco de energía metabólica en forma de grasas e hidratos de carbono y el uso de esta energía para la biosíntesis, transporte de membrana y el movimiento. Parte de la energía se obtiene en el citosol a través de la conversión de los azúcares de la dieta directamente en ATP durante la glucólisis. Sin embargo, la principal fuente de producción de ATP en una célula es aprovechada dentro de la mitocondria a través de la cadena respiratoria mitocondrial ^1. La arquitectura de las mitocondrias proporciona la orientación espacial necesaria para la producción de ATP eficaz y eficiente. Las mitocondrias poseen una doble membrana separadas por un es....

Protocolo

Todos los experimentos con animales se ajustaban a los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por la Universidad de Wake Forest Cuidado de Animales y el empleo Comisión. Las parejas reproductoras para SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] modelo de ratón se obtuvieron de El Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME). De tipo salvaje (WT) hembras y machos SOD1G93A no transgénicos [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] fueron criados para generar ratones SOD1G93A y WT littermates no transgénicos que fueron utilizados en los experimentos.

1. Modelos de Investigación

1. Cultivo celular
   1. Mantener las células de riñón embrionario hum....

Resultados

El tratamiento de células HEK-293T con 200 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, y 75 ng / ml de IFN-γ (* 3) durante 24-48 hr conduce a cantidades progresivas de la muerte celular (Figura 1A ). La viabilidad celular se evaluó mediante ensayos de MTT y consistentemente demuestra que no es de ~ 10% de disminución en la viabilidad celular con el tratamiento 24 hr y ~ disminución del 20% con el tratamiento 48 hr. Las células tratadas con concentraciones similares (100 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, y 75 .......

Discusión

El tratamiento de células HEK-293T con citoquinas recombinantes hace que cantidades moderadas de la muerte celular durante 48 hr (Figura 1). La cantidad de muerte celular inducida por el tratamiento TNF-alfa es similar a los estudios reportados previamente ³⁰ y la viabilidad celular disminuye después de la co-administración de múltiples citoquinas que son mayores que las cantidades acumulativas con cualquier citoquina sola también es coherente con la literatura ^31,32. La capacidad .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido L-glutámico	Sigma	G1251	Puede usar la sal de potasio en su lugar.
ácido málico	Sigma	M8304	Puede usar la sal de potasio en su lugar.
KH2PO4	Sigma	P0662
K2HPO4	Sigma	P3786
EGTA	Sigma	E3889
Trisma base	Sigma	T6066
	MOPS Sigma	M3183
CCCP	Sigma	C2920	Diluir hasta 100   μ M como material de trabajo en etanol y almacenar a -20  °C.
Valinomycin	Sigma	V0627	Hacer en DMSO y usar como 5  μ M material de trabajo. Almacene a -20  °C.
sacarosa	Fisher	S5-500
KCN	Mallinckrodt	6379	Hacer un caldo concentrado en etanol y luego diluir con agua
rotenona	Sigma	R8875	Altamente tóxico. Fabricado en etanol.
oligomicina	Sigma	O4876	Altamente tóxico. Fabricado en etanol.
ADP	Sigma	A2754
TMRE	Sigma	8717-25mg	Diluido 100  μ M stock con EB inmediatamente antes de su uso.
DMEM	Gibco	11965-084	1x regular (glucosa alta).
Pluma/Estreptococo	Invitrogen	15140-155
L-glutamina	Fisher SH3002101		Almacene alícuotas a -20  ° C
FBS	Lonza	14-501F Origen	estadounidense, calidad premium. Inactivar el calor y almacenar alícuotas a -20  °C.
Tripsina-EDTA	Sigma	T4049
DMSO	SIgma	D2650
Colorante de ensayo Protien (5x)	Bio-Rad	500-0006	Cualquier ensayo de proteínas puede sustituir.
BSA	Fisher	BP1600-100	Prepare 2 mg/ml de caldo en agua para el ensayo de proteínas.
MTT polvo	Sigma	M2128	Filtro esterilizante 5 mg/ml caldo fabricado en PBS. Almacene las alícuotas a -20  ° C; tienda en 4  ° C hasta por 1 semana.
Solución de Tergitol (NP-40)	Sigma	NP40S
IL-1B humano recombinante	Gibco	PCH08014	Una vez abierto tienda alícuotas a -20  ° C
TNF-alfa humano recombinante	Gibco	PHC3015L
Gibco	IFN-gamma humano recombinante	PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)	Sigma	D8537	Asegúrese de que no tenga iones Mg2+ y Ca2+ iones.
Cytochrom c kit ELISA	R& Sistemas D	DTC0	Humano para células HEK-293T.