El uso de dos métodos para estimar la expresión génica en las principales apéndices gustativas de Aedes aegypti, hemos identificado el conjunto de genes supuestamente subyacentes a las respuestas neuronales a compuestos amargos y repulsivas, como se determina por examen electrofisiológico.
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Artículo de método
Fisiológicos Grabaciones y RNA Secuenciación de los apéndices gustativas del mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti
En este artículo
Resumen
Resumen
El registro electrofisiológico de los potenciales de acción de las neuronas sensoriales de los mosquitos proporciona a los investigadores una visión de la percepción química de estos vectores de enfermedades. Recientemente hemos identificado una neurona sensible amarga en el labelo de la hembra de Aedes aegypti que responde al DEET y otros repelentes, así como a la quinina amarga, a través de una investigación electrofisiológica directa. Estas respuestas de las neuronas receptoras gustativas impulsaron nuestra secuenciación del ARNm total de muestras de labella y tarsos masculinos y femeninos para dilucidar los genes de quimiorrecepción putativos expresados en estos tejidos de quimiorrecepción de contacto. Las muestras de tarsos se dividieron en subtipos pro, meso y metatorácicos para ambos sexos. A continuación, validamos nuestro conjunto de datos mediante la realización de qRT-PCR en las mismas muestras de tejido y utilizamos métodos estadísticos para comparar los resultados entre los dos métodos. Los estudios que abordan la función molecular ahora pueden dirigirse a genes específicos para determinar aquellos involucrados en la percepción del repelente por parte de los mosquitos. Estas vías receptoras se pueden utilizar para detectar nuevos repelentes que interrumpan el comportamiento de búsqueda de huéspedes para frenar la propagación de virus dañinos.
Introducción
Compuestos como DEET, Picaridin, citronelal y IR3535 se ha demostrado eficaz para repeler mosquitos, incluyendo las importantes vectores de enfermedades Aedes aegypti 1,2. Registramos los potenciales de acción de las neuronas sensoriales asociadas con sensilla gustativo específico para determinar las células involucradas con la repelencia de mosquitos. Junto con la secuenciación de aguas abajo de los genes expresados en estos tejidos, podemos identificar los genes más probable que median las respuestas de estas células con el fin de cribar nuevos compuestos para la mejora de las capacidades de repelencia.
RNA-seq es ....
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Protocolo
1. Crianza Ae. adultos aegypti
- Los huevos eclosionan en aproximadamente ¾ de pulgada de agua en la bandeja poco profunda. El hacinamiento reducirá el tamaño de los adultos.
- Larvas posterior a 25 ° C (12 hL: 12-HD) y alimentarlos con comida para peces suelo.
NOTA: La sobrealimentación puede reducir las tasas de supervivencia. - Retire pupas individualmente por pipeta Pasteur diario y transferir a los platos de plástico (9 cm x 5,5 cm) dentro de pequeños cubos de contención con tapas de malla fina, estableciendo así 24 grupos de edad hr.
- Alimentación mosquitos adultos 10% de solución de sacarosa por bola d....
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Resultados
Los registros de Trace de potenciales de acción de Ae. aegypti sensilla gustativa (Figura 1) demuestran la eficacia de la estimulación directa con una gama de productos químicos. Esta técnica se puede utilizar para cuantificar las respuestas a la estimulación de cualquier producto químico contando los picos de una amplitud y duración dada durante un intervalo de tiempo razonable (generalmente menos de 500 ms). Grabaciones de rastreo deben ser fácilmente reproducible bajo un conjunto dado de con.......
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Discusión
El aspecto más difícil de potenciales de acción de grabación de sensilla gustativa es decidir qué respuestas son "normales". Cuando se emplea un solo punta sensillum gustativa grabar la primera vez que una especie de insectos dado, el número total y sensibilidades de las neuronas receptoras gustativas (GRNs) son probablemente desconocido. Muchas grabaciones preliminares primera obligados a decidir el alcance y las concentraciones de los productos químicos para probar. En este caso, empezamos con la observación.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Bryan T. Vinyard del USDA, Servicio de Investigación Agrícola, Henry A. Wallace Centro de Investigación Agrícola de Beltsville, Servicio de Consultoría Biométrica, Beltsville, MD por los análisis estadísticos. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención a J.C.D. del Programa de Investigación de Protección de Combatientes de Guerra Desplegados (DWFP) financiado por el Departamento de Defensa a través de la Junta de Manejo de Plagas de las Fuerzas Armadas (AFPMB).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Capilar de vidrio | A-M Systems | 628000 | Estándar, 1,5 mm X 0,86 mm, 4" |
| Alambre de plata | A-M Systems | 7875.015 | " Alambre |
| tungsteno | Alfa Products | 369 | 0,127 mm de diámetro |
| Pinzas finas | Fine Science Tools | 11252 | #5SF Etapa refrigerada de acero inoxidable |
| Productos BioQuip | 1429 | Enfriamiento Preamplificador de mesa | |
| Syntech | Taste Probe | preamplificador | |
| Software para electrofisiología | Syntech | Autospike | software para electrofisiología |
| TetraMin alimento para peces | Tetra | Tropical alimento para peces granulado alimento | peces molido hasta polvo fino |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-026 | reactivo de aislamiento de ARN |
| RNeasy Plus El Mini Kit | Qiagen | 74136 | incluye eliminador de ADNg y columnas de espín RNeasy |
| Espectrofotómetro Nanodrop | Productos Nano Drop | Espectrómetro de sobremesa | ND-1000 |
| R statistics | freeware (creado por Robert Gentleman y Ross Ihaka) | www.r-project.org | Utilice la función lm del paquete stats y la función equiv.boot del paquete de equivalencia en el entorno informático R. |
| Gradilla para tubos de 1,5 ml | Evergreen | 240-6388-030 | Vierta nitrógeno líquido en unos pocos pocillos vacíos para congelar y triturar el tejido. |
| Tubos de recolección de 1,5 ml con mortero | Centrífuga sin | ARNasa | 6HAX6 |
| Thermo Scientific 11178160 | Gire el tejido congelado para mantenerlo en el fondo del tubo de 1,5 ml. | ||
| Primer-BLAST Primer Herramienta de diseño | NCBI | n/a |
Referencias
- Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).
- Dickens, J. C., Bohbot, J. D.
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Reimpresiones y permisos
