Tomando ventaja de la reducción de la interacción de gotas en la superficie para optimizar el transporte de Bioanalytes en microfluídica digitales

Resumen

Se describe el protocolo para la fabricación y operación de dispositivos de deshumectación de campo (Field-DW), así como los estudios preliminares de los efectos de los campos eléctricos en el contenido de las gotas.

Resumen

La microfluídica digital (DMF), una técnica para la manipulación de gotas, es una alternativa prometedora para el desarrollo de plataformas de "laboratorio en un chip". A menudo, el movimiento de las gotas se basa en la humectación de una superficie, directamente asociada con la aplicación de un campo eléctrico; Sin embargo, las interacciones de la superficie hacen que el movimiento dependa del contenido de las gotas, lo que limita la amplitud de las aplicaciones de la técnica.

Se han presentado algunas alternativas para minimizar esta dependencia. Sin embargo, se basan en la adición de especies químicas adicionales a la gota o a su entorno, que podrían interactuar con las fracciones de las gotas. Para hacer frente a este reto, nuestro grupo ha desarrollado recientemente dispositivos Field-DW que permiten el transporte de células y proteínas en el DMF, sin aditivos adicionales.

Aquí, se proporciona el protocolo para la fabricación y operación del dispositivo, incluida la interfaz electrónica para el control de movimiento. También continuamos los estudios con los dispositivos, demostrando que también se pueden transportar organismos modelo multicelulares, relativamente grandes, posiblemente no afectados por los campos eléctricos necesarios para el funcionamiento del dispositivo.

Introducción

La miniaturización de los dispositivos que funcionan con líquidos es de suma importancia para el desarrollo de plataformas de "lab-on-a-chip". En este sentido, las dos últimas décadas han sido testigos de un avance significativo en el campo de la microfluídica, con una variedad de aplicaciones. ^5.1 En contraste con el transporte de fluidos en los canales cerrados (canal de microfluidos), DMF manipula gotitas en matrices de electrodos. Uno de los méritos más atractivas de esta técnica es la ausencia de partes móviles para el transporte de fluidos, y el movimiento se detiene al instante apagando señales eléctricas.

Sin embargo, el movimiento de gotitas depende de su contenido de gota, sin duda una característica indeseable para una plataforma universal "lab-on-a-chip". Las gotitas que contienen proteínas y otros analitos se adhieren a las superficies de dispositivos, convirtiéndose en inamovible. Sin duda, ésta ha sido la principal limitación para ampliar el alcance de las aplicaciones de DMF; ^6-8alternativas para minimizar el ensuciamiento superficie no deseado implican la adición de especies químicas adicionales a la gota o sus alrededores, lo que podría afectar el contenido de las gotas.

Anteriormente, nuestro grupo desarrolló un dispositivo para permitir el transporte de células y proteínas en DMF, sin aditivos adicionales (aparatos de campo-DW). ⁹ Esto se logró mediante la combinación de una superficie basada en el hollín vela, ¹⁰ con una geometría del dispositivo que favorece la gotita de laminación y conduce a una fuerza hacia arriba en la gotita, disminuyendo aún más la interacción de gotitas en la superficie. En este enfoque, el movimiento gotita no está asociado con humectación de la superficie. ¹¹

El objetivo del método detallado se describe a continuación es producir un dispositivo de DMF capaz de transportar gotitas que contienen proteínas, células y organismos enteros, sin aditivos adicionales. Los dispositivos de campo-DW allanan el camino para las plataformas de trabajo totalmente controladas en gran medida independiente de farmacia gotary.

Aquí, también presentes simulaciones que muestran que, a pesar de la alta tensión necesaria para el funcionamiento del dispositivo, la caída de voltaje a través de la gotita es una pequeña fracción de la tensión aplicada, lo que indica efectos insignificantes en bioanalytes dentro de la gotita. De hecho, las pruebas preliminares con Caenorhabditis elegans (C. elegans), un nematodo utilizado para una variedad de estudios de la biología, muestran que los gusanos nadan sin perturbaciones como se aplican voltajes.

Protocolo

NOTA: En los procedimientos que se describen a continuación, las pautas de seguridad de laboratorio siempre se deben seguir. De particular importancia es la seguridad cuando se trata de alto voltaje (> 500 V) y manipulación de productos químicos.

1. Recubrimiento de un sustrato conductor con la vela hollín

1. Cortar en rectángulos de metal de cobre (75 x 43 mm, 0,5 mm de espesor). Limpie cada sustrato de cobre por inmersión en solución de ataque de cobre durante unos 30 segundos, lavar con agua del grifo durante unos 20 segundos, y secar con papel.
   NOTA: Si se utiliza el método 1 a continuación, cambie las dimensiones de 75 x 25 mm para encajar en la máquina.
2. Barrer una vela de parafina iluminada bajo el substrato de cobre durante 30-45 segundos, para obtener un recubrimiento de hollín aproximadamente uniforme (alrededor de 40 m de espesor). Mantenga el sustrato a ~ 1 cm dentro de la llama. No toque la superficie de hollín frágil.

2. La protección de la capa de hollín con Recubrimiento

NOTA: La capa de hollín es muy frágil, Y debe ser cubierto para la protección. Dos alternativas simples (métodos 1 y 2 a continuación) se sugieren aquí, pero los protocolos más robustos están actualmente en desarrollo.

1. Método 1
   1. Cargar la muestra en el evaporador de metal o sistema de pulverización catódica. Siguiendo los procedimientos de operación del sistema, evacuar la cámara y comenzar la deposición controlada de oro sobre la capa de hollín (150-200 nm). Deje que el dispositivo se enfríe a temperatura ambiente.
   2. Dip-revestir el sustrato metalizado en una solución de 1-dodecanotiol (1% v / v, en etanol al 95%, grado ACS / USP), durante 10 minutos dentro de una campana química. Entonces, sostiene el dispositivo en un ángulo cercano a 60 °, lavar suavemente la superficie con varias gotas de etanol sólo. Deje que los dispositivos seca, durante la noche.
2. Método 2
   1. En una campana química, inmediatamente después de revestir el sustrato con hollín y mientras el sustrato está todavía caliente de la llama de la vela, depositar algunas gotas de líquido fluorado en un lado de lasustrato, e inclinar el sustrato a un ángulo próximo a 90 °. Deposite más gotas, y dejar que ellos ruedan sobre la superficie entera de hollín.
      NOTA: Cuando la gota cae en un punto, el hollín se lavará lejos de esa zona. Dejar que las gotitas de líquido fluorado propagación tanto como sea posible.
   2. Hornear el sustrato sobre una placa caliente (160 ° C durante 15 min) dentro de una campana química.
   3. Deje que el sustrato reposar toda la noche a temperatura ambiente antes de su uso. Almacenar indefinidamente.

3. Fabricación de electrodos superiores (Adaptado de Abdelgawad et al. ¹²⁾

1. Dibuje los electrodos utilizando software de diseño gráfico. Cada electrodo es de 2 mm de largo, 0,3 mm de ancho, y la brecha entre los electrodos es de 0,3 mm. La brecha entre los contactos (para encajar en el conector, ver más abajo) es de 2,3 mm (Figura 1).
2. Recorte un laminado flexible de cobre (35 micras de espesor) en el formato Monarch (3,87 x 7,5 pulgadas). Utilice otros tamaños if compatible con la impresora. Cargue el laminado en la bandeja de alimentación manual de una impresora a color.
3. Asegúrese de utilizar "negro rico", o "registro negro", cuando se imprime en la hoja de cobre (ver Abdelgawad et al. ¹² para más detalles) para permitir que una capa más densa de tinta negro sobre el sustrato de cobre, protegiendo el patrón impreso durante el grabado . Deje secar completamente el sustrato impreso, durante la noche.
4. Dentro de una campana química, caliente (40 ° C) un vaso de precipitados con 50 ml de reactivo de ataque de cobre. Sumerja el laminado impreso en el vaso de precipitados, y agítelo suavemente en la solución durante unos 10 minutos. Tiempo de grabado depende de la solución de grabado de cobre. Cada pocos minutos, comprobar la corrosión y ver si el patrón está intacto.
5. Lave cuidadosamente la lámina con agua, y eliminar el recubrimiento con acetona y etanol en la campana química. Lavar una vez más, y seque con cuidado el laminado con una toalla de papel.
6. Conecte con cuidado el laminado con electrodos a un gladiapositiva ss (75 x 25 mm, ~ 1 mm de espesor), utilizando cinta de doble cara. Evite las bolsas de aire.
7. Adjunte una película de perfluoroalcoxi PFA a los electrodos utilizando cinta. Esto sirve para evitar el contacto accidental de los electrodos con la gota, que daña electrodos superiores debido a cortocircuito.

4. La interfaz electrónica (circuito de la Figura 2)

1. Soldar los relés y los condensadores C a una placa de circuito universal.
2. Montar el resto de los controladores de relé 10 en un circuito sin soldadura para circuitos electrónicos.
3. Cable de entrada de cada conductor del relé a un canal en el tablero de control.
4. Romper con cuidado los electrodos superiores en un conector (Figura 3). Cada cable de salida del controlador de relés a un electrodo superior, como se muestra en la figura. Tenga en cuenta que hay un contacto del conector a tierra entre un par de cables de relés, para minimizar el ruido eléctrico.
   NOTA: El conector se asienta sobre una plataforma ajustable para controlar la tque la distancia (0,1-0,5 mm) entre el sustrato (hollín-revestido) superior e inferior.
5. Utilice un programa para controlar el tiempo para la aplicación de alta tensión (HV) (alrededor de 0,8 seg) para 4 electrodos al mismo tiempo, desplazando 1 electrodo en la dirección del movimiento (es decir, para 0,8 seg, 1234 accionar, a continuación, 2345, 3456, etc ., 0,8 seg para cada grupo, y luego hacia atrás, se mueve de modo de gotitas en la dirección opuesta también).

5. Visualización de la gotita y Manipulación

1. Para grabar el movimiento de las gotas, utilizar el sistema de visualización, que se compone de un 24X - conjunto de magnificación 96X combinado con una cámara CCD. Conecte la grabadora de vídeo a la cámara mediante S-vídeo.
2. Pipetear una gota de 4 l que contiene C. elegans en los medios de comunicación en la parte inferior del sustrato recubierto de hollín.
3. Traiga los electrodos superiores a ~ 0,3 mm por encima de la gota. La gota debe estar cerca de la mitad, justo por debajo del quinto electrodo, para facilitar la operación.
4. Encienda la interfaz electrónica y alta tensión (500 V _RMS), y ajustar la distancia de la parte superior del electrodo a la gota hasta que comienza a moverse. No deje que los electrodos superiores tocan la gota.
5. Recopilar datos mediante el registro del número de transferencias exitosas de gotitas en el dispositivo en respuesta a impulsos eléctricos. Un experimento exitoso se caracteriza por al menos 700 transferencias de gotitas, es decir, una transferencia después de cada pulso eléctrico.
6. Recopilar datos continuamente, hasta que la gota no se mueve más en respuesta a 5 a 10 pulsos.
   NOTA: Cuando la superficie comienza a degradarse, el movimiento podría ser restaurado por traer los mejores electrodos cerca de la gota.

Resultados

Anteriormente, hemos utilizado dispositivos Field-DW para permitir el movimiento de las proteínas en DMF. En particular, las gotitas con albúmina de suero bovino (BSA) se pueden mover a una concentración 2.000 veces mayor que lo reportado previamente por otros autores (sin aditivos). Esto era debido a la reducción de la interacción entre las gotitas y superficie; La figura 4 muestra una gotita que contiene marcado con fluorescencia-BSA (ver Freire et al ⁹ para más información sobre l...

Discusión

El paso más importante del protocolo es la protección de la capa de hollín, directamente relacionado con el éxito en gotas en movimiento. Metalizar la capa de hollín (método 1 anterior) permite cerca de 100% de éxito de fabricación. Sin embargo, el tiempo máximo de funcionamiento es de aproximadamente 10 min; posiblemente, las fracciones de gotitas están mojando el hollín a través de agujeros en la capa de metal. El recubrimiento de la capa de hollín con el líquido fluorado es la alternativa más fácil y rápida, y requie...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Vela			Cualquier vela de parafina
Sistema de pulverización catódica	Denton Vacuum, Moorestown, NJ		Barnizador de pulverización catódica Escritorio V HP equipado con un objetivo Au.
1-dodecanetiol	Sigma-Aldrich	471364
Teflón	Dupont	AF-1600
Fluorinert FC-40	Sigma-Aldrich	F9755	Líquido fluorado: Prepare la resina de Teflón-AF en Fluorinerte FC-40, 1:100 (p/p), para crear el recubrimiento hidrofóbico.
Software de diseño gráfico: Adobe Illustrator	Adobe Systems		También se pueden utilizar otros softwares.
Laminado de cobre	Dupont	LF9110
Impresora láser	Xerox	Phaser 6360 o similar	Compruebe la compatibilidad con "negro enriquecido" o "negro de registro" (ver texto).
Grabador de cobre	Transene	CE-100
Película de perfluoroalcoxi (PFA)	McMaster-Carr	84955K22
Breadboard	Allied Electronics	70012450 o similar	Lo suficientemente grande como para permitir el montaje de 10 controladores.
Placa de circuito universal	Allied Electronics	70219535 o similar
Conector	Allied Electronics	5145154-8 o similar
Placa de control y programa de control (software LabView)	National Instruments	NI-6229 o similar
Amplificador de alto voltaje	Trek	PZD700
Condensadores C y C1, 100 nF, 60 V	Aliados
8817183 Transistor T, NPN	Aliado
diodo D, 1N4007	aliado
Relé	Aliados
Sistema de visualización	Edmund Optics	VZM 200i o similar	Sistema de aumento 24X – 96X. Se combina con una cámara a color Hitachi KP-D20B 1/2 en CCD.
Grabadora	Sony	GV-D1000 NTSC o similar	Se conecta a la cámara mediante un cable S-video.
Simulaciones	COMSOL Multifísica	V. 4.4