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Artículo de método

A gran escala de purificación de porcino o bovino fotorreceptor Outer Segmentos para Fagocitosis ensayos sobre células pigmento retiniano epitelial

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DOI:

10.3791/52100

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12 de diciembre de 2014

 ,  ,  ,  , 
1INSERM, U968, 2Sorbonne Universités, UPMC Paris 06, UMR_S 968, Institut de la Vision, 3CNRS, UMR_7210, 4Department of Biological Sciences, Center for Cancer, Genetic Diseases and Gene Regulation, Fordham University

En este artículo

Resumen

Este artículo describe el protocolo para la purificación de fragmentos de segmento externo (POS) de fotorreceptores mediante ultracentrifugación de retinas porcinas/bovinas utilizando homogeneización y centrifugación en gradiente de sacarosa. Este protocolo permite la preparación de grandes existencias de alícuotas de TPV, etiquetadas o sin etiquetar, que luego pueden almacenarse a -80 °C.

Resumen

Análisis de una de las funciones vitales de las células del epitelio pigmentario de la retina (RPE), la fagocitosis de gastados fragmentos distales de edad de los segmentos externos de los fotorreceptores (POS) se puede realizar in vitro. Fotorreceptoras segmentos externos con pilas de discos membranosas que contienen la maquinaria fototransducción se renuevan de forma continua en la retina. POS gastados se eliminan diariamente por células del RPE. Roedor, porcino / bovino y células del RPE humanos reconocen POS de diversas especies de una manera similar. Para facilitar la realización de grandes series de experimentos con poca variabilidad, con un amplio stock de POS puede aislarse de ojos porcinos y se almacena congelado en alícuotas. Este protocolo se aprovecha de la característica de fotopigmentos que muestran un color anaranjado cuando se mantienen en la oscuridad. Bajo una luz roja tenue, retinas se recogen en un buffer de ojeras abiertas cortadas en mitades. La suspensión de células de la retina se homogeneiza, se filtró y se cargó en un gradiente de sacarosa continuo. Después centrifugation, POS se encuentran en una banda discreta en la parte superior del gradiente que tiene un color naranja característico. POS se recogen, hilar, volvieron a suspender de forma secuencial en tampones de lavado, se contaron y se dividen en partes alícuotas. POS obtenidos de esta manera se pueden utilizar para ensayos de fagocitosis y análisis de activación de la proteína, la localización o la interacción en diversos momentos después de la exposición POS. Alternativamente, POS puede marcarse con fluoróforos, e. G., FITC, antes de alícuotas para la posterior cuantificación de fluorescencia de POS de unión o inmersión. Otras posibles aplicaciones incluyen el uso de desafío POS POS modificado o combinado con condiciones de estrés para estudiar el efecto del estrés oxidativo o envejecimiento en las células RPE.

Introducción

En la retina, la visión se activa por isomerización de moléculas fotosensibles llamadas opsinas, antes de ser transformada en una señal que puede ser transmitida entre las neuronas hasta las áreas visuales del cerebro. Estas moléculas están incrustados en las pilas de discos membranosos asemejan panqueques que constituyen las porciones de segmentos externos de las células fotorreceptoras (RP). Ser sometido a la exposición constante a la luz y por lo tanto los niveles considerables de estrés oxidativo, RP renovar continuamente sus segmentos externos para limitar el daño oxidativo potencial. Segmentos externos de los fotorreceptores están en estrecho contacto con microvellosidades apicales de las células vecinas del epitelio pigmentario de la retina (RPE). RPE células constituyen la parte exterior de la barrera hemato-retiniana y aseguran numerosas tareas que son cruciales para la salud y la función de los fotorreceptores 1, tales como apagar los rayos de luz a través de pigmentos de melanina, re-isomerización de la retina componente opsina fotoreactivo, proporcionando nutrientes y grecimiento factores, participando en disposición PR metabolito.

Además, las células RPE eliminan pasaron POS y reciclan sus componentes, una ocupación diaria que está regulado por el ritmo circadiano en la retina de mamíferos 2,3. El aclaramiento de cobertizo POS es absolutamente necesario para la supervivencia de relaciones públicas. Cuando esté completamente abrogada, POS se acumulan escombros y RP degeneran causando una rápida 4,5 pérdida de visión. Si el perfil rítmico se pierde y se sustituye por una actividad constante, PR y RPE defectos se acumulan con la edad 6. Por lo tanto, es muy importante para caracterizar la regulación molecular de la fagocitosis RPE in vitro con el fin de entender fenotipos vinculados a su disfunción. Curiosamente, la maquinaria molecular en las células RPE es muy similar a la utilizada por los macrófagos para eliminar las células apoptóticas y ambos son dependientes de reconocimiento de fosfatidilserina expuesta sobre los desechos fagocítica 7-9. Sin embargo, las células RPE y macrófagos regular el pHagocytosis diferente, como macrófagos optan por la eliminación inmediata de las células apoptóticas en tiempo de encuentro, mientras que las células del EPR rítmicamente engullir POS sólo una vez al día a pesar de su permanente contacto con los segmentos externos. Esto sugiere mecanismos de regulación específicos que aún no se entienden completamente.

Muchas de las moléculas implicadas en la maquinaria fagocítica RPE han sido identificados o validado gracias a la utilización de POS aislado y ensayos de fagocitosis de cultivo celular. El receptor de la integrina alphavbeta5 situado en la superficie celular apical RPE, en coordinación con su ligando MFG-E8, se une específicamente a POS 10-12, que luego se internaliza a través del receptor quinasa de tirosina MerTK 13-15. El receptor scavenger CD36 se ha demostrado que participar en la ingesta de POS e influir en su velocidad de 16,17, y puede servir como un sensor de fosfolípidos oxidados en la superficie POS 18. Internalización necesita la contratación de F-actina del citoesqueleto-culoociated proteínas tales como la anexina 2 19, miosina II 20 y la miosina VIIA 21,22. POS o nativa oxidada in vitro también se utilizan para entender el envejecimiento de fenotipos de células del EPR en vivo vinculados a la acumulación de mal digerido POS oxidado 23-28. La generación de células del EPR derivadas de células madre ha iniciado una nueva aplicación para el aislado POS que se utilizan para probar la funcionalidad de las células antes de que se trasplantan a animales o pacientes 29,30,27.

En primer lugar se describe por Molday y sus colegas en 1987 31, el protocolo para el aislamiento de POS bovina combina una etapa de ultracentrifugación de los homogeneizados de la retina en gradientes de sacarosa continuas con la observación del aspecto de color naranja característico de fotopigmento retinal crudos (llevar 11- cis retinal). En los últimos 10 años, debido a las precauciones tomadas para minimizar el riesgo de la enfermedad de las vacas locas, el uso de ojos porcinos se ha convertido en increasingly prominente. El protocolo descrito aquí muestra cómo obtener grandes cantidades de POS de porcino o de los ojos de la especie bovina que se pueden alícuotas y se almacenan durante periodos prolongados de tiempo. Esto elimina la necesidad de preparar POS de los ojos de roedores, que requiere el uso de un gran número de animales por la preparación y ensayo de POS 32,33,21,22. Además, se dan detalles sobre el etiquetado POS antes de su almacenamiento utilizando moléculas fluorescentes, para cuantificar y visualizar POS de una manera simplificada y comparable para algunas aplicaciones en comparación con POS etiquetado después de que el ensayo de la fagocitosis de 32,10. Por lo tanto, estas grandes stocks permiten reproducibilidad y facilidad de uso en muchos tipos diferentes de experimentos.

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Protocolo

Este aislamiento experimento POS es mucho tiempo y puede requerir hasta 12 horas para completar si POS están etiquetados antes de su almacenamiento. El protocolo ha sido adaptado de un artículo publicado por RS Molday y sus colegas en 1987 31 y modificado por SC Finnemann y sus colegas en 1997 10.

Los animales fueron manejados de acuerdo a la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research. Protocolos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Charles Darwin Pierre y Marie Curie de París-06 y el Comité Institucional Cuidado de Animales y el Empleo de la Universidad de Fordham.

1. Configuración General

  1. Obtener 80 frescos de cerdo o vaca ojos tan frescos, tan pronto después de la matanza como sea posible y mantenerlos refrigerados en la oscuridad. Proporcionar instrucciones al proveedor para que la empresa procede de la misma manera. Este protocolo está optimizado para 80 ojos. Aproceder con más ojos y obtener las reservas más grandes (por ejemplo, desde 160 ojos), el doble de las cantidades de solución y realizar 2 rondas de ultracentrifugación; muestras de la piscina después en la etapa de recolección (ver paso 2.2.2).
  2. Establecer en el banco de la lámpara de luz de seguridad roja, almohadillas absorbentes, trapos (tabla Materiales). Preparar 15 cm de platos y bolsas de bioseguridad para la recogida de residuos (las partes del ojo no utilizado, vítreos ...). Use bata ajustada, guantes, protectores de mangas y gafas.
  3. Precauciones:
    1. Pre-enfriar todas las soluciones luego mantenerlos fríos durante todos los pasos. Mantener los ojos y los gradientes enfrió en hielo tanto como sea posible.
    2. Mantener los ojos y tejidos derivados en la oscuridad tanto como sea posible hasta que la etapa de recogida después de la ultracentrifugación para evitar photobleaching de pigmentos visuales y la pérdida de la color naranja-rosa de la forma activa de los fotopigmentos.

2. Protocolo de acciones

  1. Preparar soluciones y gradientes:
    1. Taurina deshielo stock completamente utilizando un baño de agua a 37 ° C.
    2. Preparar todas las soluciones de soluciones madre (Tabla 1, las soluciones madre) y mezclar bien la sacarosa con otros ingredientes usando un agitador magnético para cada solución.
      1. Preparar 15 ml de la solución de homogeneización a una concentración final de 20% de sacarosa, 20 mM Tris pH 7,2 de etilo, 2 mM MgCl2, 10 mM de glucosa y 5 mM de taurina.
      2. Preparar la solución de sacarosa al 25% a una concentración final de 25% de sacarosa (usando 70% stock sacarosa), 20 mM de acetato de tris pH 7,2, 10 mM de glucosa y 5 mM de taurina.
      3. Preparar la solución de sacarosa al 60% a una concentración final de 60% de sacarosa (usando polvo de sacarosa), 20 mM de Tris pH 7,2 etilo, glucosa 10 mM y 5 mM de taurina.
      4. Preparar la solución de lavado 1 a una concentración final de 20 mM de acetato de tris pH 7,2 y 5 mM de taurina.
      5. Prepare la solución de lavado 2a una concentración final de 10% de sacarosa, 20 mM de acetato de tris pH 7,2 y 5 mM de taurina.
      6. Preparar la solución de lavado 3 a una concentración final de 10% de sacarosa, 20 mM de fosfato de sodio pH 7,2 taurina y 5 mM.
    3. Estabilizar el fabricante de gradiente en un agitador magnético e insertar una barra de agitación en la cámara más cercana a la salida donde se insertará la solución al 60%. Utilice una punta de pipeta P200 de corte colocado en la salida de la tubería para lograr velocidad de colada adecuada.
    4. Reparto de degradados lineales delicadamente diluyendo y agitando la solución de sacarosa al 60% con el 25% uno usando 12 ml de cada solución (es decir, un total de 6 tubos de 80 ojos) en tubos de ultracentrífuga pre-enfriados. Agitar la solución gradualmente-diluyendo sacarosa 60% también. Estabilizar la velocidad del flujo de gradiente, vertiendo la solución de problemas y no demasiado rápido.
      NOTA: A fin de obtener un gradiente continuo, lineal, mantenga la abertura de la punta de la pipeta a la derecha en la superficie de la solución para toda la formatio gradienten.
    5. Deje que los gradientes se sientan en hielo durante alrededor de 1 hora para la estabilización. Mantenga los gradientes de temperatura hasta cargado. No agite los tubos para evitar la interrupción de la pendiente.
  2. Colección de tejidos:
    1. Recoge los tejidos bajo la luz roja tenue. Tome un ojo en una mano y empuje la parte delantera con el borde de la hoja de afeitar mientras sostiene el ojo lejos (para evitar salpicaduras; Figura 1). Utilice la hoja de afeitar para cortar el globo ocular anterior en 2 mitades (córnea, además de al menos 5 mm en la esclerótica). Retire el objetivo y voltear la ojera adentro hacia afuera de modo que se hace sobre la punta de un dedo exponiendo así a la retina.
    2. Uso de la hoja de afeitar en un ángulo, raspar suavemente la retina, desprendimiento fácil y que aparece como una capa de color rosado, fuera de la superficie tapetum y cortes en la cabeza del nervio óptico (Figura 1). Recoge todas las retinas en 2 x 50 ml tubos que contienen cada uno 15 ml de solución de homogeneización en hielo.
    3. Homo Retinahomoge-:
      1. Agitar la suspensión vigorosamente a mano durante 2 min con el fin de interrumpir las diferentes capas de células, romper POS fuera el resto de la célula PR, fragmento de POS y homogeneizar la suspensión retina.
      2. Filtro 3x a través de una doble capa de gasa limpia para eliminar fragmentos de tejido grandes y recoger el flujo a través de limpias tubos de 50 ml (Figura 1). La suspensión de la retina de ser bastante grueso, para maximizar el rendimiento, presione suavemente sobre la gasa para liberar los tejidos restantes fragmentados después de cada filtración.
  3. Fotorreceptor exterior fragmento segmento (POS) Aislamiento:
    1. Coloque con cuidado la preparación retina crudo, alrededor de 6-7 ml por tubo, más de 6 x 30 ml tubos de ultracentrífuga conteniendo cada uno 24 ml de frío continuo fresca 25 - gradiente de sacarosa al 60% (Figura 1). Equilibre los tubos opuestas que sean procedentes para el rotor que se utilizará. Ultracentrífuga a 106.000 xg durante 50 min a 4 ° C.
    2. Eliminar la mayor parte de la solución encima de la banda de color naranja-rosa en el tercio superior del gradiente por aspiración (Figura 2A). Recoger la banda de color naranja-rosa con una punta P1000 de corte en un vaso. Deseche el resto después de neutralizar el uso de cloro (residuos biológicos).
    3. Diluir con ~ 4 - 5 volúmenes de helado Wash 1 solución. Separar en tantos tubos de 30 ml, según sea necesario. Centrifugar a 3000 xg durante 10 min a 4 ° C. Elimine con cuidado el sobrenadante.
    4. Pellets de resuspender en 10 ml lavado 2 solución y centrifugado a 3000 xg durante 10 min como se detalló anteriormente. Bolitas Resuspender en 15 ml de lavado 3 y girar de nuevo a 3.000 g durante 10 min. Combinar suspensiones de varias bolitas para reducir el número de tubos necesarios antes de la centrifugación en Wash 2 y 3 Lave soluciones.
  4. POS alicuotear sin etiquetado:
    1. Resuspender POS en 10-20 ml de DMEM. Prediluya 10 l en 490 l DMEM (1:50) y el recuento alargado, así como POS giró en uncámara de recuento de células (Figura 2B). Calcular el rendimiento y la concentración en partículas POS por ml.
      NOTA: El rendimiento varía, dependiendo principalmente de la edad y cepa de cerdos / vacas y el tamaño de los ojos, por ejemplo, una buena preparación varía de 5 - 8 x 10 ojos 9 POS de 80 cerdos.
    2. Decidir sobre el volumen de DMEM final (típicamente 10 a 20 ml) y se añade sacarosa para producir una concentración final de 2,5% de sacarosa.
    3. Preparar alícuotas del tamaño deseado, por ejemplo, 5 x 10 7 POS por tubo para un volumen de resuspensión 2 ml para un experimento de 96 pocillos a 40 l / pocillo. Tirada 1 alícuota durante 5 min a 2300 xg a TA y evaluar el tamaño del pellet. Preparar alícuotas diferentes tamaños para diferentes volúmenes de aplicación como POS NO debe congelarse y descongelarse dos veces.
    4. Congele alícuotas POS a -80 ° C hasta su uso posterior.
      NOTA: Las alícuotas son estables durante muchos meses. En nuestras manos, no marcado o etiquetado POS se puede almacenar durante al menos un año.
  5. Etiquetado POS y alícuotas:
    NOTA: normalmente utilizamos FITC para etiquetar POS para la cuantificación de ensayos de fagocitosis, pero otros colorantes se pueden usar también en función de las necesidades.
    1. Resuspender 1 10 mg vial FITC a una / ml de concentración 2,5 mg en 0,1 M tampón de carbonato de Na pH 9,5 mediante la mezcla de 2,6 ml 0,1 M de NaHCO3 pH 8,4 con 1,4 ml 0,1 M Na 2 CO 3 pH 11,5 (tabla 2, las soluciones de archivo). Girar durante 1 hora a RT mientras se protege de la luz y de centrifugado durante 5 min a velocidad máxima para sedimentar los sólidos FITC no resuspendidas.
    2. Resuspender el precipitado POS en 10 ml de Wash 3 solución (o DMEM) y añadir 2 ml de solución de FITC durante 80 ojos. Guarde las sobras FITC congelado a -80 ° C. Rotar durante al menos 1,5 horas a RT. Proteger de la luz utilizando papel de aluminio.
    3. Lave POS marcado dos veces utilizando Wash solución 3 como se describe en la sección 2.3.4, a continuación, una o dos veces en DMEM hasta que casi no FITC libre se ve en el sobrenadante fraction. Resuspender POS en DMEM y proceda como para POS sin etiqueta para contar y alícuotas (sección 2.4).
  6. Uso de POS en los experimentos:
    1. POS Descongelar a temperatura ambiente, y mantenerlos en la oscuridad tanto como sea posible si están etiquetados con fluorescencia. Haga girar durante 5 minutos a 2300 xg a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante.
    2. Inmediatamente resuspender en volumen apropiado de solución de ensayo según lo dictado por el experimento. En caso de diferentes tiempos de desafío POS, POS tienda volvió a suspender a TA en la oscuridad entre los puntos de tiempo durante varias horas.

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Resultados

La combinación del gradiente de sacarosa lineal y la ultracentrifugación permite la separación de los diferentes componentes de la suspensión de la retina por la densidad. Células de escombros y RPE más grande de la retina pesados ​​se hunden en o cerca de la parte inferior del gradiente (Figura 2A). Encendedor POS y las células individuales más ligeros o restos de células de la retina migran como bandas separadas para llegar a la media parte superior del gradiente por el final del período de centrifuga...

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Discusión

Tres pasos o condiciones son cruciales para una purificación optimizada: la calidad de la fundición de gradiente y delicada manipulación de tubos de gradiente, manteniendo los tejidos refrigerada y en la oscuridad hasta la etapa de recogida, la fuerza de agitación de homogeneizados de la retina para obtener el aislamiento POS adecuada del resto de la PR célula. Si surge algún problema en ver a la banda naranja correctamente, son muy probablemente debido a una de las tres razones anteriores (véase también el segundo párr...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero contrapuesto.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / Jeunes Chercheurs a EFN), Fondation Voir et Entendre y Fondation Bettencourt Schueller (Becas a Jóvenes Investigadores a EFN), Centro Nacional de la Recherche Scientifique (CNRS, puesto permanente para EFN) , y el Instituto Nacional del Ojo de los Institutos Nacionales de Salud (R01-EY13295 a SCF). Además, el Instituto de la Visión es financiado por el Institut National de la Santé et de la Investigación Médica, Universidad Pierre et Marie Curie en París 6, Centro Nacional de la Investigación Científica y el departamento de París.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Material/Equipo específico
gradiente de 2 cámarasMáquina de degradado con cámaras de 30 ml
Tubo dede diámetro Tubo para fundición en gradiente
BarraMontaje de la barra de agitación en la cámara del creador de degradado
LámparaLámpara inactínica para la disección en el oscuro
Tubos Ultra Clear 25 x 89 cmBeckman344058 Tubos de ultracentrifugación
PP Tubos Oak Ridge Nalgene3119-0050 Tubos decentrífuga de 30 ml
Optima LE-80KBeckman Coulter365668Ultracentrífuga
SW 32Ti rotor oscilante BeckmanCoulter369694Rotor oscilante para ultracentrífuga
Avanti J-26 XPCentrífuga 393124 Beckman Coulter
Rotor JA-25.50363058Beckman Coulterpara centrífuga Avanti J-26 XP
FITC Isomer ILife TechnologiesF-1906Colorante
Otros Materiales/Equipos
Cámara de recuento (como Neubauer o Malassez)
Cubetas
Básculas
Agitador magnético y pértiga
Microcentrífuga
37 ° C baño
agua-80 ° C freezer
Consumibles
Batade laboratorio Salud y seguridad
Guantes
Protectores de mangas Gafas
Almohadillas
Bolsas y contenedores de basura de
Weck-PrepDisecciónHojas de afeitar de 60 mm/2,25 pulgadas de ancho Plato
de plástico de 15 cm
gasa estériles
Tubos de 15 y 50 ml Consumiblescomunes
Microtubos
de aluminio
Generador de silicona de 3 mm de agitación magnética de tamaño pequeño de luz de seguridad roja Rotor fluorescente de hielo oscuro con tapade sujeciónreestructurada de absorbentes riesgo biológicoCuchillas Hojas de Papel

Referencias

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