Artículo de método

A largo plazo Lapso de tiempo de imágenes de Ratón cocleares explantes

DOI:

10.3791/52101

⸱

2 de noviembre de 2014

 , 
1Biological Sciences Platform, Sunnybrook Research Institute, 2Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Toronto, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

En este artículo

Resumen

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Imágenes en vivo de la cóclea de mamíferos embrionario es un reto porque los procesos de desarrollo en la mano operan en un gradiente temporal de más de diez días. Aquí presentamos un método para cultivar y luego la formación de imágenes de embriones tejido explante coclear tomado de un ratón reportero fluorescente en cinco días.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí presentamos un método para obtener imágenes de lapso de tiempo a largo plazo de los explantes cocleares de ratón embrionarias en vivo. El programa de desarrollo responsable de la construcción de la muy ordenada, compleja estructura de los ingresos cóclea de mamíferos durante unos diez días. Con el fin de estudiar los cambios en la expresión génica durante este período y su respuesta a farmacéutico o la manipulación genética, de formación de imágenes a largo plazo es necesario. Anteriormente, imágenes en vivo ha sido típicamente limitada por la viabilidad del tejido explantado en una cámara humidificada encima de un microscopio estándar. Dificultad en el mantenimiento de las condiciones óptimas para el crecimiento del cultivo con respecto a la humedad y la temperatura ha puesto límites en la longitud de los experimentos de imagen. Un microscopio integrado en una incubadora de cultivo de tejidos modificados ofrece un excelente ambiente para la formación de imágenes a largo plazo en directo. En este método se demuestra cómo establecer ratón embrionario explantes cocleares y cómo utilizar un microscopio incubadora para realizar Imagi lapso de tiempong utilizando tanto de campo brillante y microscopía fluorescente para examinar el comportamiento de un día típico embrionario (E) 13 explante coclear y Sox2, un marcador de las células prosensoriales de la cóclea, durante 5 días.

Introducción

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La cóclea de los mamíferos es un órgano complejo altamente ordenada. En el ratón, entre la aparición del oído interno primitiva de la vesícula ótica en el día E11 y la finalización del programa de desarrollo en las etapas postnatales tempranas, múltiples oleadas de la señalización celular y los cambios coordinados en la expresión génica se llevan a cabo. Que va desde la base al ápice del conducto coclear es el sonido detectar epitelio sensorial, o el órgano de Corti. Desarrollo del órgano de Corti está exquisitamente controlada de tal manera que al final del desarrollo, que consistirá en una sola fila de células ciliadas internas, tres filas de células ciliadas externas intercalados con cinco filas de células de apoyo (dos filas de células pilar, tres hileras de células Deiters ') 1. La desviación de esta precisos resultados de orden en la pérdida de audición, heighlighting la importancia de studye deEl génesis y el patrón de la epithemlium sensorial 2.

En el cultivo in vitro de la coch ratón embrionariolea es una herramienta esencial en el estudio de los mecanismos de desarrollo del órgano de Corti. Esta técnica fue establecida en 1974 y en los últimos 40 años, ha sido utilizado para dilucidar muchos de los mecanismos por los que se especifica el epitelio sensorial y el órgano de Corti estableció 3. La cóclea es un órgano complejo con los procesos de desarrollo dinámicos; una manipulación puede llegar a tardar hasta siete días para manifestar 1. Por ejemplo, cuando la adición de inhibidores de GSK 3β a un cultivo de explantes cocleares en E13, el período de incubación óptimo para observar un efecto robusta del compuesto es de seis días 4.

Imágenes en vivo de la cóclea permite el desarrollo de investigación sobre los cambios en la morfología del órgano de Corti, los cambios en la expresión génica, el seguimiento de la migración, proliferación o células que mueren, y que permite la observación en tiempo real de los resultados de los agentes farmacéuticos y la alteración de la señalización vías. Hasta ahora, la imagen en directo de la cócleaprincipalmente se ha realizado utilizando microscopía confocal para pequeñas áreas de imagen del órgano de Corti en períodos de tiempo cortos 5-8, pero esta técnica tiene limitaciones debido a la viabilidad de explante. En las imágenes de los efectos de las manipulaciones a largo plazo sobre los procesos de desarrollo lento, el entorno de imagen es crucial. Normalmente, un sistema de imagen confocal en vivo utiliza una caja de plástico humidificado que se sienta en el microscopio. El calor y la humedad pueden escapar a través de los huecos en el cuadro de la incubación de donde se encuentra con la mesa del microscopio, a través de las ventanas de acceso, a través de las aberturas de bisagra y a través de los huecos alrededor de varias partes de la Microscopio- tales como el objetivo o la fuente de luz. Este no es óptimo para el mantenimiento de explantes sanos durante más de dos o tres días.

Definimos 'microscopio incubadora' como un microscopio invertido sellado dentro de un incubador de CO2 estándar, en lugar de una incubadora construida alrededor del microscopio. Un microscopio incubadora extiende la vida del experimento de tal manera que en lugar de formación de imágenes de más de dos o tres días, las muestras se pueden obtener imágenes de hasta dos semanas. Un microscopio incubadora ofrece un excelente ambiente para el crecimiento y la diferenciación celular, con el menor trastorno posible a explante culturas y condiciones estándar controlado. En los estudios que se llevan a cabo a través de múltiples día es común que recurrir a muestras de formación de imágenes sobre una base diaria por la eliminación de ellos de la incubadora y llevándolos a un microscopio de fluorescencia invertido. Si bien este enfoque puede funcionar, la eliminación de los platos de la incubadora inflige presión sobre el tejido en desarrollo sensible. Los cambios en la acidez del medio de cultivo y las fluctuaciones en la temperatura debido a la eliminación de la incubadora pueden resultar en el desarrollo subóptima y tejido enfermo. Imágenes de la misma región en el mismo plano focal y en la misma orientación en cada punto de tiempo es extremadamente difícil. Mediante el uso de un sistema automatizado dentro de una incubadora, es posible mantener saludabletejido, para recoger imágenes en más puntos de tiempo y para garantizar que la misma área es capturada en cada fotograma. En los últimos años se han desarrollado varias incubadoras de tejido microscopio integrados, estos han sido útiles no sólo en la práctica clínica 9, sino también en células madre y la investigación del cáncer 10,11.

Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes en vivo a largo plazo de explantes cocleares embrionarias de ratón. Utilizamos un sistema de microscopía automatizada dentro de un incubador de CO2 estándar que tiene la capacidad de capturar imágenes de múltiples muestras en los puntos de tiempo establecidos. El sistema consta de un microscopio invertido conjunto dentro de una incubadora. Las muestras se colocan en una tarima giratoria que permite obtener imágenes de múltiples muestras en cada punto de tiempo. La iluminación, la captura de imágenes, y la rotación de la tarima están controlados por un sistema automatizado operado a través de software Metamorph. Al establecer una rutina de imágenes utilizando el software de funcionamiento podemos establecer un experimento para funcionar durante un máximo de two semanas, con mínima intervención humana. En este ejemplo usamos tanto de campo claro y fluorescencia para mostrar el crecimiento a gran escala y la reordenación de la cóclea, y en concreto, la región prosensorial. En este experimento, cochleae será disecado de ratones reportero EGFP Sox2 en el día embrionario E13. Se establecerá cultivos in vitro y luego fotografiada durante cinco días.

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Protocolo

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Tejido de ratón fue cosechada de Sox2 EGFP -reporter ratones 12 mantenidos y sacrificados de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. El cultivo embrionario cochleae

  1. Suplemento Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) mediante la mezcla de 8,89 ml de DMEM, 1 ml de suero bovino fetal (FBS), 100 l de 100x suplemento N2, y 10 l de 10 mg / ml de ciprofloxacina. Suplemento solución salina equilibrada de Hank (HBSS) mediante la mezcla de 495 ml de HBSS con 5 ml de HEPES 100%.
  2. Preparar vidrio placas de cultivo de fondo:
    1. En una campana de flujo laminar, resuspender 200 l sótano sustrato extracto de membrana en 5 ml de DMEM. Preparar 35 mm de vidrio de diámetro inferior con placas de cultivo de 10 pozos mm. Pipetear 150 l de sustrato / DMEM en el centro de cada plato de fondo de cristal. Estos platos se pueden utilizar después de 40 min de incubación, o pueden almacenarse en un CO 2 Incubadora a 35 ° C durante al menos una semana.
      NOTA: Vidrio de fondo platos se utilizan por las siguientes razones: para asegurarse de que la base del plato es transparente y adecuada para formación de imágenes, para crear un pozo en el centro del plato que permite a los explantes a establecerse en una zona de fácil situado y finalmente de modo que después de un experimento de la muestra se puede procesar para la inmunotinción y el análisis subsiguiente.
  3. Prepare la estación de trabajo y herramientas:
    1. Encienda el flujo laminar banco limpio, y rocíe con EtOH al 70% para crear un espacio de trabajo limpio. Remoje pinzas, cucharas y un negro 184 plato de elastómero de silicona (una mezcla de 184 elastómero de silicona (10 partes), agente (1 parte) y polvo de carbón vegetal (2,5 g) de curado) en EtOH al 70%.
  4. En la estación de trabajo limpia, embriones de cosecha para el experimento. Recoger los embriones de la gestación apropiado en hielo frío HBSS suplementado con 1% HEPES.
    1. Determinar un órgano externo o visible que demostraráactividad de reportero y examinar los embriones utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente. Recoger los embriones que presentan actividad de reportero en el hielo frío HBSS suplementado con 1% de HEPES como éstos son objeto del experimento.
  5. Recoger los huesos temporales:
    1. Trabajando rápidamente, utilizando una fuente de luz fría y unas pinzas finas, recoger las cabezas de los cachorros. Tenga cuidado de clip en las vértebras cervicales y debajo de la mandíbula para evitar daños a los huesos temporales.
    2. Abra cuidadosamente el cráneo. Retire el cerebro, recortar la parte delantera de la cabeza, y transferir el cráneo posterior a hielo fresco HBSS frío suplementado con 1% de HEPES en un plato limpio. Diseccionar cuidadosamente los huesos temporales con forma de maní, teniendo cuidado de mantener el sistema vestibular en el tacto.
  6. Diseccionar la cóclea:
    1. La transferencia de los huesos temporales a un plato recubierto de elastómero de silicona negro en el hielo frío HBSS suplementado con 1% de HEPES, el pin de la región vestibular del hueso. Inserte clavijas de insectos enun ángulo oblicuo con el fin de estabilizar el hueso temporal y crear espacio para los fórceps. Prender con alfileres es un paso crucial en el proceso como si se permite que el hueso temporal para moverse demasiado, es muy difícil de cosechar una cóclea intacta.
    2. Retire con cuidado el cartílago que rodea la cóclea. Inserte una púa de las pinzas en el cartílago en el borde exterior de la base de la cóclea y el clip de un agujero en el cartílago.
    3. Clip una solapa hacia arriba el lado, inserte el diente de las pinzas y separar suavemente el techo del conducto desde el cartílago. Clip horizontalmente a través de la parte superior y en diagonal, y levante con cuidado la sección delantera de la cápsula. Inserte una punta de las pinzas en entre el cartílago restante y el conducto y el clip suavemente de la última sección. La superficie apical de la cóclea está ahora expuesto.
    4. Comenzando en la base, coger el área donde el techo del conducto coclear se encuentra con el epitelio y abra el conducto coclear. Tienes que despegar de la azotea, el recortecuando sea necesario, hasta que se elimina por completo. Se quita porciones de membrana izquierda en el lado medial del conducto. Limpiar el conducto de exceso de tejido mesenquimal y separar el conducto desde el sistema vestibular.
  7. Cultura de los explantes:
    1. Publicar un explante, luminal superficie hacia arriba, en el centro de una placa de cultivo de vidrio recubierta inferior sustrato, cuidadosamente extrayendo todo el líquido y dejar actuar durante dos minutos. Añadir 150 ml de DMEM complementado gota a gota para el explante, teniendo cuidado de no molestar a ella. Si el explante flotar libremente, vuelva a colocar con pinzas, pero tener cuidado de que el explante se deposita en el fondo del plato de manera que se puede unir al sustrato.
    2. Coloque los platos de fondo de cristal en un profundo 12 cm placa de Petri de diámetro, con un pequeño plato de agua estéril para mantener la humedad. Ponga las culturas en las que un 35 ° C incubadora durante la noche para que el explante para adjuntar al sustrato y aplanar.

2. Vivo ImagING

  1. Seleccionar muestras de explantes. Utilice un microscopio estereoscópico de fluorescencia para evaluar la condición de cada cóclea explantado. Sólo seleccione explantes donde el conducto está intacto y unido al cristal de la base al ápice.
  2. Ajuste la incubadora a 35 ° C con 5% de CO 2 al tejido coclear cultura. Ponga las culturas en el microscopio incubadora:
    1. Aspirar suavemente la DMEM suplementado y reemplazar con al menos 500 l de medio nuevo. Para obtener imágenes de hasta 6 días, 1-1,5 ml es mejor. En los casos en los explantes están vagamente conectados, una pipeta un anillo de los medios de comunicación alrededor del borde del plato. Este líquido adicional hará una 'cámara de humidificado' miniatura sin perturbar el explante mientras se sigue concediendo a la matriz.
      1. Como alternativa, el uso de bisagras plato cubre para abrir los párpados, mientras que el plato se mantiene en su adaptación en el microscopio si los reactivos deben ser intercambiados durante los intervalos entre las colecciones de imágenes. Tapas de platos de bisagras permiten que las tapas seanabierto sin molestar a las muestras o la eliminación de los platos de su configuración. Esto mantiene su posición exacta para capturas de imágenes posteriores.
    2. Inserte los platos de cristal inferior que contienen muestras adecuadas en el soporte de plato de muestra. El microscopio en este ejemplo tiene una plataforma giratoria que tiene ocho platos de 35 mm de la muestra.
    3. En virtud de la campana de flujo laminar reemplazar las tapas de plástico con tapas de vidrio e insertar los platos en el soporte de plato de muestra. Coloque el soporte de platos de la muestra dentro de la incubadora teniendo cuidado de no desalojar los explantes de la parte inferior del plato o molestar a los medios de comunicación.
  3. Establecer la rutina de imagen:
    1. Encienda el microscopio, lámpara UV y la cámara y abra el software de imágenes.
    2. Busque las muestras, escoger un área de imagen, el plano de enfoque y ajustar los tiempos de exposición para cada plato en secuencia. Elija el plano de enfoque dependiendo no sólo de la vista del explante en el momento de partida, pero alpor lo que teniendo en cuenta cómo el tejido se moverá y el tiempo que el curso del tiempo se ejecutará.
    3. Establecer una pila Z centrado alrededor del plano focal seleccionada en el canal de fluorescencia. Ajuste la frecuencia y la duración de la toma de muestras para el experimento. La frecuencia de muestreo será limitado por el tiempo que se necesita para recoger imágenes, por lo que esta debe determinarse después de seleccionar campos de visión y el establecimiento de una pila Z. En este caso, el muestreo se lleva a cabo cada 30 minutos durante cinco días. La duración del experimento puede ser de hasta 14 días.
  4. Generar una película:
    1. Al final del período de tiempo transcurrido abrir los archivos de imagen. En este caso el software Metamorph que se abre puntos de recogida secuenciales se utiliza. Cuadro por cuadro elegir el mejor plano focal para mostrar la población celular de interés.
    2. Convertir estas imágenes en un archivo .avi o exportarlos como un montaje para generar un conjunto de imágenes que se pueden abrir y analizados en el software de procesamiento de imágenes o convertir en múltiple-formats utilizando el software de procesamiento de vídeo.

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Resultados

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Aquí mostramos un montaje (Figura 1) y una película (Figura 2) que demuestra cómo una típica explante coclear organotípico crecerá si chapado en E13.5. Un reportero del ratón Sox2 se utiliza para visualizar la región prosensorial. La película ilustra que la cóclea se somete a crecimiento y la convergencia y la extensión, las células en la región lateral del dominio Sox2 verde no parecen dividir como el tejido circundante se expande. Esta es una característica del órgan...

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Discusión

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Hay varios puntos técnicos a tener en cuenta cuando se establecen las culturas y en la creación del microscopio de lapso de tiempo para que la imagen a largo plazo.

Utilizamos matriz de membrana basal como sustrato para el cultivo de explantes cocleares, pero el sustrato debe corresponder al tipo de células. Por ejemplo, para cultivos neuronales de la imagen, puede ser mejor para proporcionar un revestimiento fibronectina. La temperatura de incubación y la composición de gas también deben se...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

¡Gracias a Willy Sun para la asistencia técnica y el Dr. Kris Gellynck por sus valiosos comentarios y tres revisores anónimos por sus consejos constructivos. Este trabajo fue financiado por la Iniciativa de Regeneración Audiencia Sunnybrook

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Medios de águila modificada de DulbeccoGibco12430Varias marcas fabrican este
extracto de membrana basal Corning354230Matrigel. Otros proveedores ofrecen productos similares alternativos.
http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracelular+Matriz+Proteínas+ECMs+y+Adjunto+Factores%28Ciencias de la vida%29|Matrigel+Sótano+Membrana+Matriz+%28Lifesciences%29
Suero fetal bovinoGibco16000044Varias marcas fabrican este
http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=
HEPESGibco5630080Varias marcas fabrican esto
http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=
100 x N2 suplementoGibco17502-048Varias marcas fabrican esto
http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=
CiprofloxacinaSigma Aldrich17850-5G-FVarias marcas fabrican esta
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA
la solución salina equilibrada de HankGibco14170161Varias marcas fabrican esto. Debe ser refricitado antes de su uso.
http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s
Pinzas finasHerramientas de ciencia fina11254-20Número de tamaño 5
http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29
Cureta Herramientas de ciencia fina10080-05tamaño 1 mm 
http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118
Alfileres de insectosHerramientas de ciencia fina26001-35Debe ser de acero inoxidable
http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124
platos de plástico de 50 mmCorning/Falcon351006 Varias marcas fabrican este
carbónSigma Aldrich05105-250GVarias marcas fabrican artículos similares
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA
184 elastómero de siliconaDow/Corning SYLGARD® 184 KIT DE ELASTÓMERO DE SILICONALos platos se preparan en casa con varias semanas de anticipación. El elastómero de silicona puede ser de cualquier proveedor.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291
Platos con fondo de vidrioMatTekP35G-0-10-CLas dimensiones del plato están determinadas por las especificaciones del sistema de imagen.  35 mm de diámetro, Pozo de 10 mm, cubreobjetos número 0 se adapta a Olympus Vivaview FL.
http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15& products_id=2
Microscopio estereoscópicoZeiss 495101-9804-000  Modelo Stemi 2000. varias marcas fabrican artículos similares
http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html
Fuente de luz fríaZeiss000000-1063-182Varias marcas fabrican artículos similares
http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html
Microscopio estereoscópico fluorescente Leica microsystemsPóngase en contacto con Leica microsystemsLeica M165-FC. Varias marcas fabrican artículos similares
http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/
Incubadora Microscopio + software de imagenOlympusContacto OlympusMicrocope invertido sellado dentro de una incubadora de Co2. Microscopio incubador Vivaview FL con software de imagen patentado Metamorpoh.
http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0
Banco limpioThermo Scientific51029701Varias marcas fabrican artículos similares
http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html
incubadora de CO2Thermo Scientific3310Varias marcas fabrican artículos similares
http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html
Campana de flujo laminarThermo Scientific 51026651Varias marcas fabrican artículos similares
http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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