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La formación de sinapsis inhibitorias en una Co-cultura modelo que incorpora GABAérgicas Mediano espinosas neuronas y células HEK293 que expresan establemente GABA A Receptores

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DOI:

10.3791/52115

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14 de noviembre de 2014

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1UCL School of Pharmacy, University College London

En este artículo

Resumen

Los mecanismos moleculares que coordinar la formación de sinapsis inhibidoras GABAérgicas durante la ontogenia son en gran parte desconocido. Para estudiar estos procesos, hemos desarrollado un sistema modelo de co-cultivo que incorpora las neuronas GABAérgicas espinosas medias embrionarias cultivadas junto con células transfectadas de manera estable de riñón embrionario humano 293 (HEK293) que expresan receptores funcionales GABA A.

Resumen

Las neuronas inhibidoras actúan en el sistema nervioso central para regular la dinámica y la coordinación espacio-temporal de las redes neuronales. El GABA (ácido γ-aminobutírico) es el neurotransmisor inhibidor predominante en el cerebro. Se libera de las terminales presinápticas de las neuronas inhibidoras dentro de uniones intercelulares altamente especializadas conocidas como sinapsis, donde se une a los receptores GABAA (GABAARs) presentes en la membrana plasmática de las neuronas postsinápticas receptoras de sinapsis. La activación de estos canales iónicos activados por GABA conduce a la afluencia de cloruro, lo que resulta en cambios de potencial postsináptico que disminuyen la probabilidad de que estas neuronas generen potenciales de acción.

Durante el desarrollo, diversos tipos de neuronas inhibidoras con características morfológicas, electrofisiológicas y neuroquímicas distintas tienen la capacidad de reconocer sus neuronas diana y formar sinapsis que incorporan subtipos específicos de GABAARs. Este principio de inervación selectiva de las dianas neuronales plantea la cuestión de cómo se identifican entre sí las parejas sinápticas adecuadas.

Para dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes, se estableció un novedoso sistema modelo de cocultivo in vitro, en el que las neuronas GABAérgicas espinosas medianas, una población altamente homogénea de neuronas aisladas del cuerpo estriado embrionario, se cultivaron con líneas celulares HEK293 transfectadas de manera estable que expresan diferentes GABAASubtipos R. Las sinapsis se forman de forma rápida, eficiente y selectiva en este sistema, y son fácilmente accesibles para su cuantificación. Nuestros resultados indican que varios subtipos de GABAAR difieren en su capacidad para promover la formación de sinapsis, lo que sugiere que este sistema de modelo in vitro reducido puede usarse para reproducir, al menos en parte, las condiciones in vivo requeridas para el reconocimiento de los socios sinápticos apropiados y la formación de sinapsis específicas. Aquí se describen primero los protocolos para cultivar las neuronas espinosas medianas y generar líneas celulares HEK293 que expresan GABAARs, seguidos de instrucciones detalladas sobre cómo combinar estos dos tipos de células en cocultivo y analizar la formación de contactos sinápticos.

Introducción

GABA es uno de los primeros neurotransmisores que se encuentran en el cerebro embrionario, anterior a la más abundante excitatorio neurotransmisor glutamato 1. Durante el desarrollo, GABA despolariza y excita las neuronas inmaduras, jugando un papel clave en la regulación de la proliferación celular, la migración y la formación de redes neuronales sin inducir excitotoxicidad. En el cerebro adulto, el potencial de inversión para GABA A los canales del receptor se desplaza hacia potenciales más negativos debido a una disminución en la concentración intracelular de cloruro. Este cambio se debe a la sobre regulación de potasio-cloruro de co-transportador (KCC2), que transporta cloruro de fuera de la célula, y, en paralelo, la regulación por disminución del transportador-potasio-cloruro de sodio (NKCC1), que tiene el efecto contrario 2.

En el cerebro, GABA se une principalmente a los receptores de GABA, ya sea A o GABA B para mediar en la inhibición sináptica rápida o lenta, respectivaLy. GABA A Rs son una clase de receptores ionotrópicos también conocidos como heteropentamérico o Cys-loop canales iónicos activados por ligando. Se requieren dos moléculas de GABA para la activación del receptor, que es permeable a los iones cloruro y en un grado menor, los iones de bicarbonato. El aumento en la conductancia de cloruro disminuye la eficacia de despolarizantes, eventos excitatorios en la activación de la neurona postsináptica 3.

La diversidad estructural del GABA A Rs ha sido reconocida como un factor clave en la determinación de su amplia gama de propiedades funcionales y farmacológicas. Nativo de GABA A Rs son hetero-pentámeros compuestas de subunidades con múltiples isoformas clasificados como: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, π y θ 3, con un común topología transmembrana que comprende un dominio grande N-terminal extracelular, cuatro dominios transmembrana (TMS), y un dominio intracelular importante entre TMs 3 y 4 4. Laβ3 y γ2 subunidades son esenciales para la inhibición sináptica y la supervivencia organismo, debido a ratones portadores de supresión genética de estas subunidades mueren después del nacimiento 5,6. En contraste, las isoformas individuales de la subunidad α son importantes para la función de las conexiones sinápticas específicas en el cerebro asociados con diferentes comportamientos tales como la ansiedad, sedación, excitación, y otros, pero no lo son, individualmente, esencial para la vida 7-9. GABA A Rs son los principales sitios de acción para una variedad de fármacos con potente sedante, hipnótico, ansiolítico y efectos anticonvulsivos, tales como benzodiacepinas, barbitúricos, anestésicos y neuroesteroides 7,10,11.

Synaptic GABA A Rs normalmente contienen una subunidad γ2, dos subunidades β (más comúnmente β2 o β3) y dos subunidades α (α1, α2, α3 o α5) 12,13. La clase predominante de los receptores extra-sináptica contiene la subunidad δ en combinacióncon dos subunidades α (α4 o α6), y dos subunidades β (β2 o β3) 14. Localización subcelular de GABA A Rs a los axones, dendritas o soma, y la inserción en la membrana plasmática dependen de la presencia de β-subunidades 15,16. Sin embargo, la incorporación selectiva de diferentes subtipos de GABA A R en distintos tipos de sinapsis se correlaciona bien con la presencia de subunidades α específicos (α1, α2, α3 o α5) 7,17,18. Es importante destacar que, la supresión de α1 o α2 subunidad en ratones provoca cambios ultraestructurales en las sinapsis inhibidoras 19. Esto sugiere que el GABA A Rs sí mismos pueden jugar un papel directo en la regulación de la formación de sinapsis.

La evidencia indica que el desarrollo de sinapsis GABAérgicas es una secuencia precisamente coordinado de eventos, en el que tanto los objetivos neuronales contactados por diferentes tipos de axones inhibitorios y los receptores que se agrupan encada clase de sinapsis inhibitoria son selectivos y funcionalmente en sintonía 17,20-22. Este principio fundamental de la especificidad en las sinapsis GABAérgicas plantea la cuestión de cómo los socios de pre y postsinápticos se reconocen entre sí durante el inicio de los contactos sinápticos.

Los ensayos in vitro de co-cultivo se han aplicado con éxito para estudiar algunos de los mecanismos de la formación de sinapsis y para probar el papel de las proteínas de la hendidura-que abarca sinápticas individuales en este proceso. Una de las combinaciones de proteínas comunes trans-sinápticos interactuantes que funcionan bidireccionalmente para mediar en la formación de sinapsis y la maduración, son el neurexinas (Nrxns) y neuroliginos (NLS). Nrxns son proteínas presinápticas que exhiben splicing alternativo dentro de sus dominios de la proteína de unión a hormonas laminina-neurexin sexo, dando lugar a muchas isoformas diferentes 23. Mientras que el Nrxns también interactúan con otras proteínas, NLs se cree que son su pa postsináptica ubicuartners 24. En conjunto, estas proteínas contribuyen a la celebración de las membranas presináptica y la postsináptica en aposición estrecha y rígida 25. Las dos isoformas más abundantes son NL-1 y NL-2 que están presentes en las sinapsis excitatorias e inhibitorias, respectivamente 26. Uno de los sistemas modelo de co-cultivo primeras, destinadas a investigar las interacciones de proteínas trans-sinápticos, emplean diferentes tipos de células no neuronales, las líneas celulares más comúnmente inmortales tales como embrionarias de riñón humano (HEK) 293 células, que sobre-expresa NL- 2. Cuando estas células se cultivaron con neuronas PONTINO, se observó una acumulación de proteínas presinápticas en estrecha proximidad a la superficie de las células HEK, que indica la formación de los contactos sinápticos similares. La adición de β-soluble neurexin a estos co-cultivos inhibió la formación de contactos, lo que sugiere que las interacciones trans-sinápticas entre Nrxns y NLs son necesarias para la formación de contacto sináptico 27. Por otra parte, la expresión transitoriade β-neurexin en células COS (C V-1 (simio) en O rigin, y que lleva el material genético S V40) co-cultivadas con glutamatérgica hipocampo disociada y neuronas GABAérgicas inducida por la expresión de la proteína gephryin postsináptica y de subunidades GABA A R γ2 y α2 en los puntos de contacto entre estos dos tipos de células 28. Otro ejemplo de un modelo de co-cultivo utilizado para estudiar la formación de sinapsis involucrado células HEK293, transfectadas transitoriamente con GABA A R subunidades α2 / β3 / γ2 y NL-2, y una población mixta de neuronas hipotalámicas 29. Este estudio concluyó que la expresión de NL-2 es un requisito absoluto para la formación de sinapsis inhibidoras.

Α1 Sin embargo, en el reciente estudio de co-cultivo, transfectadas establemente / β2 / γ2 GABA A Rs se encontraron en las células HEK293 que ser suficiente para inducir la sinapsis funcionales cuando se co-cultivaron con med GABAérgicasneuronas espinosas ium, sin la necesidad de proteínas de adhesión trans-sinápticos o postsinápticos adicionales. Sin embargo, se observó un aumento importante en la formación de sinapsis y la fuerza cuando se co-expresó NL-2 con GABA A Rs 30. Esto indica que este modelo de sistema de co-cultivo tiene ventajas sobre los sistemas modelo descritos anteriormente, la mayoría evidentemente un aumento de la sensibilidad y la fiabilidad de la detección de contacto sináptico. Dos factores importantes que contribuyen a la mejora general en la detección de los contactos sinápticos son: i) El uso de líneas celulares transfectadas de forma estable HEK293 con la expresión de alto y consistente de las subunidades GABA A R en la superficie de las células individuales. Esta consistencia facilita las comparaciones cuantitativas entre diferentes condiciones de co-cultivo. ii) El uso de una población pura de las neuronas GABAérgicas espinosas medio cultivado desde el cuerpo estriado embrionario 31 elimina complicaciones y ambigüedades que resultan del uso de poblaciones neuronales mixtos y allows, por ejemplo, la selección de los tipos de GABA A R postsinápticos más apropiados que se pueden comparar entre sí durante la formación de sinapsis.

Se cree que la formación de las sinapsis para involucrar a muchas señales de trans-sinápticas dentro de los complejos de adhesión celular pre y postsinápticos. Debido a la naturaleza bi-direccional de la señalización sináptica y la enorme cantidad de moléculas de adhesión celular, es difícil identificar los componentes clave que participan en la formación de sinapsis. Por lo tanto, la transfección de una sola proteína de adhesión celular en una célula no neuronal (en este caso, los dos objetivos postsinápticos más comunes de las neuronas GABAérgicas medio espinosas en vivo, α1 / β2 / γ2 o α1 / β3 / γ2 GABA A Rs 32) en gran medida reduce la complejidad de las señales de trans-sináptica disponibles en la superficie postsináptica y permite el análisis cuantitativo preciso de la eficacia de esta proteína en la promoción de la formación de sinapsis.

Protocolo

Sprague-Dawley ratas o BAB / c ratones endogámicos (Harlan, Reino Unido, el número de mujeres embarazadas utilizada fue de 30) fueron alojados y sacrificados de acuerdo con Reino Unido Home Office [y la Directiva Europea Comunidades de 24 de noviembre de 1986 (86/609 / CEE) ] directrices. El proyecto fue aprobado formalmente por la Escuela de UCL Comité de Ética de Farmacia.

1. Preparación de Instrumentos, medio de cultivo, y platos

  1. Activar y limpiar la campana de flujo laminar con etanol al 70% con el fin de trabajar en condiciones estériles en todo momento.
  2. Preparar HEK293 medio de cultivo celular, que contiene de Dulbecco Modificado Medio Eagle pH 7,4 (DMEM, 500 ml), L-glutamina (2 mM), penicilina (50 unidades / ml), estreptomicina (50 mg / ml), y suero fetal bovino (10 %).
    NOTA: la penicilina y la estreptomicina son irritantes.
  3. Preparar el medio de cultivo neuronal libre de suero, que contiene medio Neurobasal pH 7,4 (500 ml), suplemento B27 (25 ml), L-glutamina (2 mM), penicilina(50 unidades / ml), estreptomicina (50 mg / ml), y glucosa (6 mM).
  4. Preparar 500 ml de solución salina tamponada con HEPES (HBSS), que contienen HBSS 10x (50 ml), HEPES (1 M) (5 ml) y agua (445 ml), pH 7,4.
  5. Solución salina tamponada con fosfato Autoclave (PBS, pH 7,4; 1 L), agua (1 L), cubreobjetos de vidrio (13 mm de diámetro) y pipetas Pasteur de vidrio para esterilizarlos.

2. Preparación de la línea celular estable HEK293 Expresando α1 / β3 / γ2-GABA A Rs

  1. Placa 2x10 6 HEK293 células en una placa de cultivo de tejido de 10 cm estéril y se incuba a 37 ° С en un humidificado 5% de dióxido de carbono (CO 2) atmósfera (CO 2 incubadora) a fin de alcanzar el 70-90% de confluencia durante la noche.
  2. Al día siguiente, transfectar células HEK293 con GABA A R ADNc de la subunidad α1 en el vector de expresión 3.1 (+) PCDN que incorpora el gen de resistencia a G418 disulfato (1 Table),y el ADNc de la subunidad β3 GABA A R en el vector de expresión que incorpora la fleomicina D1 (Tabla 1) gen de resistencia (tanto bajo la regulación de un temprano inmediato CMV), el promotor de citomegalovirus humano (), utilizando una formulación de liposoma catiónico, que forma complejos con negativamente moléculas cargadas de ácidos nucleicos (Tabla 1) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  3. Brevemente, añadir 500 l de medio de suero reducido (pH 7,4; Tabla 1) y 7,5 g de cada uno de ADNc construir a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml, seguido por 15 l de reactivo de transfección liposomal buffering, y mezclar suavemente antes de dejar a temperatura ambiente durante 5 min.
  4. A esta mezcla, añadir 8,75 l de reactivo de transfección liposomal y mezclar suavemente antes de dejar a temperatura ambiente durante 30 min. Después de esto, añadir 3 ml de medio de cultivo celular HEK293 (sin antibióticos), pipetear los contenidos del tubo de centrífuga de arriba y abajo dos veces, transfer gota a gota sobre las células que crecen en una placa de 10 cm de cultivo de tejidos, y se incuba durante 48 horas a 37 ° С en un 5% humidificado atmósfera de CO 2 (CO 2 incubadora).
  5. Lavar las células HEK293 suavemente con PBS estéril, pH 7,4, y diluir las células HEK293 transfectadas en nuevas placas de 10 cm de cultivo de tejidos, en las siguientes relaciones: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 1:10, una y cuarto y 1:20. Esto asegura que las células no se convertirá en demasiado confluente.
  6. Iniciar la selección de las células HEK293 que expresan ambas subunidades GABA A R mediante la adición de 800 mg / ml de cada marcador de selección antibiótico, G418, y fleomicina D1, al medio de cultivo. Se incuban las células a 37 ° С en un 5% humidificado atmósfera de CO 2 (CO 2 incubadora) y sustituir el medio que contiene los antibióticos (10 ml) cada 2 días.
  7. Cuando las pequeñas colonias blancas comienzan a formarse (por lo general después de cerca de 7 días), seleccionar cuidadosamente una sola colonia de cada uno de los platos y recoger usando un P1000 estérilpunta de la pipeta. Transferirlo a un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos que contenía 500 l de medio y resuspender cuidadosamente con la pipeta el medio arriba y abajo. Asegúrese de que exactamente una colonia se transfiere a cada pocillo (se recomienda un total de 5-20 colonias). Se incuban las células a 37 ° С en un 5% humidificado atmósfera de CO 2 (CO 2 incubadora) y vuelva a colocar el medio que contiene antibiótico cada 2 días.
  8. Una vez que las colonias se vuelven 70-80% de confluencia, el medio pipetear suavemente hacia arriba y abajo para desalojar las células de la parte inferior de la placa de cultivo tisular de 24 pocillos. Transferir y dividir la suspensión de células entre 2 pocillos en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos. Se incuban las células a 37 ° С en un 5% humidificado atmósfera de CO 2 (CO 2 incubadora) y vuelva a colocar el medio que contiene antibiótico cada 2 días.
  9. Una vez 70-80% de confluencia, recoger las células de 1 de los 2 pozos que contienen las células procedentes de la misma de colon solalisados ​​de proteínas y y prepararse. Brevemente, se lavan las células 2 veces con PBS, pH 7,4, y añadir 200 l de 2% de dodecilsulfato de sodio (SDS) en PBS, pH 7,4. Recoger el lisado y la transfiere al tubo de microcentrífuga. Medir la concentración de proteínas usando el reactivo de proteína BCA (véase la Tabla 1) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Analizar la expresión de α1 y β3 subunidades de los receptores GABA A por SDS / PAGE e inmunotransferencia utilizando anticuerpos subunidad específica (conejo anti-α1-específica y conejo anticuerpos GABA A R-anti-β3 específico, consulte la Tabla 1 para la información sobre estos anticuerpos).
  10. Desalojar y trasladar los clones sólo positivos de los pozos restantes para mayores de 6 cm placas de cultivo de tejidos. Se incuban las células a 37 ° С en un 5% humidificado atmósfera de CO 2 (CO 2 incubadora) y vuelva a colocar el medio que contiene antibiótico cada 2 días.
  11. Poco a poco ampliar las colonias de células under la selección de antibióticos transfiriéndolos a 10 cm de platos de cultivo de tejidos y finalmente a los matraces de cultivo de tejido (matraces T-75). Se incuban las células a 37 ° С en un 5% humidificado atmósfera de CO 2 (CO 2 incubadora) y vuelva a colocar el medio que contiene antibiótico cada 2 días.
  12. Placa 70.000 células de cada colonia en cubreobjetos de vidrio (13 mm de diámetro) y fijar las células para analizar la expresión en la superficie celular y la co-localización de las subunidades GABA A R por inmunofluorescencia.
  13. Seleccione el clon positivo de las células HEK293 que expresan altos niveles de ambos α1 y β3 subunidades de los receptores GABA A, placa de 2 x 10 6 células en un 10 cm placa de cultivo tisular estéril y se incuba a 37 ° С en una atmósfera de 5% CO 2 humidificado ( incubadora de CO 2) durante la noche. Asegúrese de que las células se incuban en que contiene antibiótico (G418 y fleomicina D1) medio en todo momento.
  14. Al día siguiente, transfectar HEK293 células con GABA A R γ2s ADNc de la subunidad en el pcDNA ™ 3.1 (+) vector de expresión que incorpora el gen de resistencia a higromicina B utilizando un reactivo de transfección liposomal de lípidos no (Tabla 1).
    NOTA: Este método de transfección permite una mejor supervivencia y una mayor eficiencia de la expresión de proteínas extrañas en crecimiento líneas celulares estables lentas que se encuentran bajo selección continua con antibióticos.
  15. En un tubo de centrífuga de 15 ml estéril, añadir 250 l de tampón Enhancer y la condensación del ADN (Tabla 1) y 1,4 g de γ2s GABA A ADNc de la subunidad del receptor. Añadir 11,2 l de potenciador y vortex durante 1 segundo antes de dejar a temperatura ambiente durante 5 min.
  16. Añadir 35 l de no-reactivo de transfección liposomal de lípido y agitar durante 10 seg antes de dejar a temperatura ambiente durante 10 min. Añadir 3 ml de G418 / fleomicina D1-que contiene el medio y la pipeta el contenido del tubo de centrífuga arriba y abajo dos veces befmineral de transferirla gota a gota sobre las células que crecen en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm. Se incuban las células durante 48 horas a 37 ° С en un 5% humidificado atmósfera de CO 2 (CO 2 incubadora).
  17. Lavar las células cuidadosamente con PBS estéril y diluirlas en nuevas placas de 10 cm de cultivo de tejidos, en las siguientes relaciones: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 1:10, 1:15 y 1:20.
  18. Inicio de la selección de células α1 /-β3 HEK293 que expresan la subunidad γ2s mediante la adición de 800 mg / ml de antibiótico marcador de selección de higromicina B a la G418 / medio fleomicina D1 que contiene. Vuelva a colocar el medio de edad con el G418 fresco / fleomicina D1 / medio Higromicina B-que contiene (10 ml) cada 2 días.
  19. Repita los pasos 2.7 a 2.12, bajo la selección continua en G418 / fleomicina D1 / higromicina B que contienen medio de cultivo celular.
  20. Almacenar los clones positivos a -140 ° C en medio de cultivo celular libre de antibióticos y 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) para el uso futuro.
  21. Pon a prueba el nivel dede expresión de α1, β3 y γ2s subunidades GABA A R por inmunotransferencia e inmunofluorescencia en cada clon tras la descongelación, ya que la expresión puede cambiar debido a la reducción de la supervivencia de las células en la selección de antibióticos.

3. Mantenimiento de líneas celulares HEK293

  1. Descongelar un vial de control o células HEK293 que expresan bien esos Rs α1 / β2 / γ2-GABA A (Tabla 1) o α1 / β3 / Rs-γ2 GABA A (descrito anteriormente) en 10 ml de medio de cultivo celular en un recipiente estéril 15 ml tubo de centrífuga. Centrifugar a 440 xg durante 5 min para eliminar el exceso de DMSO.
  2. Eliminar sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de medio de cultivo celular fresco.
  3. En primer lugar añadir 9 ml de medio de cultivo celular fresco a una placa de 10 cm de cultivo de tejido recubiertas con poli-D-lisina (0,1 mg / ml) y luego 1 ml de células resuspendidas. Agitar suavemente, de lado a lado, para dispersar las células y se incuba a 37 ° С en un humidificado5% atmósfera de CO 2 (CO 2 incubadora).
  4. Al día siguiente, aspirar el medio para eliminar los residuos de células y reemplazar con 10 ml de medio de cultivo celular fresco HEK293.
  5. Seleccionar líneas celulares estables con antibióticos para eliminar las células que no expresan las subunidades GABA A R y por lo tanto también carecen de la expresión de marcadores de resistencia a antibióticos. Para la línea / β2 / γ2 celular estable α1, reemplace medio normal con medio de cultivo celular fresco que contiene G418 (800 mg / ml). Para la línea de α1 / β3 / celular γ2, reemplazar con medio de cultivo celular fresco que contiene G418 (800 mg / ml), fleomicina D1 (800 mg / ml) e higromicina B (800 mg / ml). ¡CUIDADO! G418 es un irritante y higromicina B es corrosivo, tóxico e irritante.
  6. Passage las células en una nueva placa de cultivo tisular mediante siembra a una densidad más baja una vez que alcanzan> 70% de confluencia. Aspirar 10 ml de medio de cultivo celular y se lava dos veces brevemente conPBS, pH 7,4. Añadir 1 ml de solución de tripsina-EDTA, una solución de la proteasa tripsina (0,05% de tripsina) y un quelante de Ca2 + EDTA (0,02%) en PBS, pH 7,4, para separar las células del plato. PRECAUCIÓN! Tripsina-EDTA solución es una sustancia irritante.
  7. Añadir 10 ml de medio de cultivo celular que contienen los antibióticos correctos, al plato y aspirar las células. Centrifugar las células a 440 xg durante 5 min y resuspender en 5 ml de medio de cultivo celular.
  8. Passage las células utilizando una dilución de 1:10 en un nuevo frasco de cultivo de tejidos (matraz T-75) que contiene medio de cultivo celular fresco y los antibióticos adecuados. Se incuban las células a 37 ° С en un 5% humidificado atmósfera de CO 2 (CO 2 incubadora) y vuelva a colocar el medio cada dos días. Passage las células cuando> 70% de confluencia (véase el paso 2.8).

4. Preparación de GABAérgicas mediano espinoso neurona Cultura

  1. En condiciones estériles preparar una 24 quell placa con poli-L-lisina (0,1 mg / ml) presenta el revestimiento cubreobjetos (13 mm de diámetro) y se incuba a 37 ° С en un 5% humidificado atmósfera de CO 2 (CO 2 incubadora).
  2. El día siguiente, aspirado con una pipeta el exceso de poli-L-lisina y se lavan cubreobjetos con dos breves 10 segundos y dos lavados largos 5 min con agua estéril. Añadir laminina (0,01 mg / ml) durante la noche y se incuba a 37 ° С en un 5% humidificado atmósfera de CO 2 (CO 2 incubadora).
  3. Desinfecte el área de disección con etanol al 70% y reunir una serie de herramientas de disección de tejidos, tales como pinzas curvas y rectas, tijeras y pinzas, y colocar en etanol al 70% para esterilizar completamente los instrumentos de disección.
  4. Coloque la embarazada rata / ratón eutanasia con CO 2 en su parte posterior y limpiar la piel en el abdomen con etanol al 70%. Pellizcar la piel con pinzas y cortar alrededor del abdomen a través de la piel, músculo y peritoneo, para revelar los órganos internos y el úterocon embriones claramente. Extraer los embriones (E16-17) del útero y colocarlos en una placa de Petri con PBS enfriado.
  5. Coloca los embriones en la campana de flujo laminar y decapitar a ellos, la recogida de los jefes en una nueva placa de Petri con HBSS fría.
  6. Bajo un microscopio de disección, diseccionar los cerebros utilizando las pinzas curvas y rectas. Coloca los cerebros en una nueva placa de Petri que contiene HBSS fría.
  7. Separar los dos hemisferios cerebrales y retirar con cuidado las meninges. Corte a lo largo de la línea del hipocampo y pelar la corteza para revelar el cuerpo estriado. Observar el cuerpo estriado como una estructura blanca estriado en la parte anterior del hemisferio.
  8. Diseccionar el cuerpo estriado y cortar en trozos muy pequeños (1 - 2 mm de diámetro) y utilizar una pipeta Pasteur pulida al fuego para recoger el material en un tubo de centrífuga de 15 ml estéril con un volumen total de 1 ml. Fuego-pulido asegura el material se recoge sin sufrir daños.
  9. El uso de la TI pulida al fuegop de la pipeta Pasteur, aspirar las células y les libera 8-10 veces. Tomando una nueva pipeta con una punta de fuego esmalte de aproximadamente el 30% de su diámetro original (1 mm), triturar la solución de otros 4 - 6 veces hasta que aparezca homogénea.
  10. Filtrar las células usando un filtro de células de 100 micras de nylon en un tubo de centrífuga estéril fresco.
  11. Contar las células con un hemocitómetro y la placa 70.000 células en 500 l de medio de cultivo neuronal por pocillo en una placa de cultivo tisular de 24 pocillos. Agite los pozos de izquierda a derecha y se incuba a 37 ° С en un 5% humidificado atmósfera de CO 2 (CO 2 incubadora) durante 14 días in vitro (DIV).
  12. Después de 7 días, comprobar la pureza de los cultivos neuronales y, si las células gliales están presentes, añadir β-D-arabinósido de citosina (Ara-C; 5 M) a los pozos para detener su proliferación. Para ello, eliminar 250 l de medio de cultivo neuronal (pH 7,4) de cada pocillo y añadir 250 l de medio fresco contienenING Ara-C. PRECAUCIÓN! Ara-C es un irritante.

5. Co-cultura Preparación

  1. En el día 11 de cultivo neuronal, capa una placa de 6 pocillos con poli-D-lisina (0,1 mg / ml) en condiciones estériles y se incuba durante la noche a 37 ° С en un 5% humidificado atmósfera de CO 2 (CO 2 incubadora).
  2. El día siguiente (día 12 de cultivo neuronal), aspirar el exceso de poli-D-lisina y se lavan los pocillos 2x brevemente y 2x por 5 min con agua estéril antes de añadir medio de cultivo celular fresco (sin antibióticos) para recubrir los pocillos con una pequeña cantidad de suero a partir del medio.
  3. Aspirar el medio de cultivo del matraz de cultivo de tejido (T-75). Enjuagar las células dos veces con PBS antes de la adición de 1 ml de Ca 2 + / Mg 2+ quelatizantes de agente de EDTA (0,48 mM) que se disocia con suavidad y no enzimáticamente células. Agitar las células para separarlas de la parte inferior del matraz de tejido.
  4. Añadir 10 ml de medio de cultivo celular (sin antibióticos, ya que esto puede interferir con la transfección), aspirar las células y el lugar en un tubo de centrífuga estéril. Sedimentar las células a 440 xg durante 5 min usando una baja velocidad de centrífuga de sobremesa.
  5. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de medio de cultivo celular fresco. Utilizando un hemocitómetro, contar las células y la placa a una densidad de 3 x 10 5 células por pocillo en una placa de 6 pocillos. Agite suavemente y se incuba durante 24 horas a 37 ° С en un 5% humidificado atmósfera de CO 2 (CO 2 incubadora).
  6. Al día siguiente (día 13 de cultivo neuronal) transfectar transitoriamente las células HEK293 con ADNc mCherry en construcción de expresión pcDNA3 utilizando el reactivo de transfección liposomal. Brevemente, en un tubo de microcentrífuga estéril, añadir 500 l de medio de suero reducido y 5 g de cDNA mCherry. Añadir 5 l de reactivo buffering liposomal y mezclar suavemente antes de dejar a temperatura ambiente durante 5 min.
  7. Añadir 8,75 l de reag transfección liposomalent y mezclar suavemente antes de dejar a temperatura ambiente durante 30 min. Pipetear los contenidos del tubo de microcentrífuga de arriba y abajo dos veces, la transferencia gota a gota a cada pocillo en la placa de cultivo tisular de 6 pocillos y se incuba a 37 ° С en una atmósfera de 5% CO 2 humidificado (CO 2 incubadora).
  8. El día siguiente (día 14 de cultivo neuronal), aspirar el medio de cultivo de células HEK293 de cada uno de los 6 pocillos y lavar cada brevemente así dos veces con PBS (pH 7,4). Añadir 300 l de Ca 2 + / Mg 2+ agente quelatizantes de EDTA (0,48 mM) y 200 l de tripsina-EDTA - solución a cada pocillo y se incuba a 37 ° С durante 5 min (0,02 0,48 mM).
  9. Añadir 1 ml de medio de cultivo fresco HEK293 células por pocillo (esto apaga la tripsina) y aspirar las células separadas en un tubo de centrífuga de 15 ml estéril. Centrifugar las células a 440 xg durante 5 min a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 500 l de medio de cultivo neuronal (pH 7,4).
  10. Utilizando un hemocitómetro, contar las células y semillas a una densidad de 30.000 células por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos que contiene las neuronas. Agite la placa para dispersar las células e incubar co-cultivos a 37 ° С en un 5% humidificado atmósfera de CO 2 (CO 2 incubadora) durante 24 horas.

6. Análisis de sinápticas Contactos y su Actividad

  1. Después de 23 horas en el co-cultivo, investigar la formación de contactos "activas" entre las neuronas GABAérgicas medio espinosos y células HEK293 utilizando la actividad dependiente de la captación de anticuerpo específico del dominio luminal anti-sinaptotagmina conjugado con un colorante fluorescente (Cy5, véase la Tabla 1) .
    NOTA: El anticuerpo sólo tendrá acceso a el dominio luminal de sinaptotagmina, al que se une cuando hay continuidad entre el lumen de las vesículas sinápticas y espacio extracelular. Esto ocurre especialmente durante la liberación de neurotransmisores, por lo que este ANTIBOdy un excelente marcador de las terminales presinápticas activos.
  2. En primer lugar aclarar los co-cultivos con medio neuronal (Neurobasal Un medio, pH 7,4; ver Tabla 1) y añadir ratón marcado con Cy5 anticuerpo anti-sinaptotagmina, diluido 1:50 en medio neuronal (Neurobasal Un medio, pH 7,4), a la culturas, durante 30 min. Se incuban las células durante este tiempo a 37 ° С en un 5% humidificado atmósfera de CO 2 (CO 2 incubadora).
  3. Para quitar el acceso del anticuerpo, lavar los co-cultivos brevemente tres veces: primero con PBS frío normal (pH 7,4), segundo con PBS frío (pH 7,4) que contenía NaCl 200 mM, y la tercera con PBS normal de frío (pH 7,4)
  4. Fijar las células con 300 l de paraformaldehído al 4% / 4% de sacarosa en PBS (PFA, pH 7,4) durante 10 min con agitación. Lavar las células dos veces brevemente con PBS (pH 7,4) y luego con dos más largos 10 min lavados.
  5. Añadir glicina (0,3 M) a cada pocillo durante 10 min con agitación para saciar PFA.
  6. Lavar las células forma concisay dos veces con PBS (pH 7,4), después con más largos dos lavados de 10 min antes de añadir 300 l de solución de bloqueo (1% (w / v) de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS, pH 7,4) para reducir la unión no específica de anticuerpos.
  7. Aspirar la solución de bloqueo y añadir el conejillo de indias anticuerpo anti-GABA A R-γ2 dirigido contra el γ2 N-terminal de dominio 33 (1: 3000 en PBS, pH 7,4) durante la noche a 4 ° С.
  8. El día siguiente, aspirar el anticuerpo primario de los pocillos y lavar las células dos veces con PBS brevemente a continuación con más de dos lavados de 10 min.
  9. Permeabilizar las células utilizando Triton X-100 (0,1%) en solución de bloqueo durante 30 min a temperatura ambiente.
  10. Lavar las células dos veces brevemente con PBS (pH 7,4) y luego con dos más largos 10 min lavados antes de añadir el ratón anti-descarboxilasa del ácido glutámico (GAD) 65 anticuerpo (1: 4000, Tabla 1) o el anticuerpo de ratón anti-sinapsina I ( 1: 1000, Tabla 1) durante 120 minutos en la sala de temperatura.
  11. Lavar las células dos veces brevemente con PBS (pH 7,4) y luego con dos lavados de 10 min más largo y luego añadir la solución de bloqueo durante 30 min a temperatura ambiente.
  12. Centrifugar los anticuerpos secundarios apropiados (típicamente de cabra anti-IgG de conejillo de indias conjugado con Cy5, IgG de cabra anti-ratón conjugado con Alexa Fluor 488 o de cabra anti-IgG de ratón Alexa Fluor 405, todo a 2 mg / ml) para eliminar los agregados de anticuerpos en 21.910 xg durante 10 min, y añadir anticuerpos (1: 750) a la solución de bloqueo. Aplicar a los pocillos apropiados durante 1 hora y cubrir con papel de aluminio para proteger los fluoróforos de exposición a la luz y la consiguiente fotoblanqueo.
  13. Finalmente, se lavan las células brevemente dos veces con PBS (pH 7,4) y luego con dos lavados de 10 min más largo para eliminar cualquier anticuerpo secundario no unido y montar los cubreobjetos usando el reactivo de montaje (Prolong Oro, Tabla 1) aproximadamente 10 l por cubreobjetos. Permita 24 horas para establecer a temperatura ambiente mientras que está protegido de la luz antes de transferir a 4° С para almacenamiento a largo plazo.
  14. Analizar las muestras utilizando un microscopio confocal de barrido con láser con un objetivo de inmersión en aceite 63X. Asegúrese de que los niveles de luz y la ganancia del detector se ajusta para evitar la saturación.
  15. Observe posibles contactos sinapsis como como regiones de co-localización entre las terminales presinápticas positivos para GAD65, synapsin marcado con Cy5 I o anti-sinaptotagmina y las células postsinápticas HEK293 visualizados por la CID o por el indicador fluorescente mCherry.
  16. Contar potenciales contactos sinapsis como utilizando series Z-pila de secciones ópticas (8 - 10) a través de una profundidad de 4 - 5 micras por célula utilizando el software de imágenes.

Resultados

El protocolo para esta neurona-HEK293 sistema modelo de células de co-cultivo se ha afinado para permitir la supervivencia celular óptimo. En este sistema, la formación de los contactos sinápticos como y su análisis se basa en la expresión estable y coherente de todas las tres subunidades GABA A R que se ensamblan en un receptor funcional. Por tanto, es importante utilizar análisis inmunocitoquímico de prueba para la expresión de la subunidad en la superficie de células HEK293 antes de añadirlos a cultivos neuronales. En estos experimentos, se detectó expresión en la superficie celular de α1, β2 y γ2 subunidades (Figura 1A), o α1, β3 y γ2 subunidades (Figura 1B), utilizando anticuerpos de la subunidad específica que se unen a los epítopos extracelulares de estas subunidades. Se demostró un alto grado de co-localización entre estas subunidades en la superficie HEK293.

Después de confirmar la expresión en la superficie y co-localización de GABA ASubunidades R en HEK293 células, co-cultivos se prepararon usando HEK293 células que expresan las subunidades α1 / β2 / γ2 GABA A R y las neuronas espinosas medianas cultivadas durante 14 días (14 días in vitro (DIV)). Las células en co-cultivo se incubaron durante 24 h, se fija y se analizaron usando inmunocitoquímica y microscopía confocal. Análisis de contactos indicó que GABAérgicas terminales de los axones GAD65-positivas forman sólo los contactos esporádicos con las células HEK293 de control (Figura 2A, 2B). El número de contactos detectados en 4 horas fue de 7,3 ± 0,9 por célula HEK293, y este número se redujo a 5,5 ± 0,5 conexiones (media ± SEM) por célula HEK293 a las 24 horas después de la adición de las células HEK293 a las neuronas cultivadas. Por el contrario, los terminales GAD65-positivas axones GABAérgicas formaron numerosos contactos-sinapsis como con células HEK293 que expresan GABA A Rs. El número de contactos obtenidos a las 4 horas después de la adición de las células HEK293 fue 28,3 ± 4,7 células HEK293, y este número era mayor aumentod a 52,1 ± 6,3 (media ± SEM) por célula HEK293 a las 24 horas en el co-cultivo (Figura 2A, 2B).

Para determinar si estos contactos-sinapsis como eran 'activa', es decir, apoyaron la liberación del transmisor vesicular, se añadió una vesícula luminal de dominio específico anti-anticuerpo sinaptotagmina Cy5-conjugado con el medio de co-cultivo después de 23 horas de incubación. Este anticuerpo sólo se incorpora en los terminales nerviosos presinápticos cuando se forma un poro entre el lumen de las vesículas sinápticas y el fluido extracelular en la hendidura sináptica durante la liberación de neurotransmisores. Después de la liberación, el poro se cierra, dejando la sinaptotagmina anticuerpos fluorescentes Cy5-conjugado unido a sinaptotagmina dentro de la vesícula. De esta manera, sólo las vesículas que participan activamente en la liberación de neurotransmisores están etiquetados con el anticuerpo. En estos experimentos pocos o ningún contacto entre el control de las células HEK293 y las terminales de las neuronas espinosas medianas eran "activo & #8217; como se muestra por la falta de co-localización entre el presináptica GAD65 / fluorescencia sinaptotagmina y mCherry de fluorescencia en las células HEK293 (Figura 3A). Por el contrario, se formaron muchos contactos "activas" entre las terminales de las neuronas espinosas medianas y α1 / β2 / γ2-que expresan las células HEK293, según lo revelado por un alto grado de co-localización entre GAD65 / sinaptotagmina y mCherry, expresa específicamente en las células HEK293 ( Figura 3B).

Α1 Para probar si un subtipo diferente de GABA A R también puede promover la formación de sinapsis-como in vitro, hemos co-cultivadas / β3 / γ2 expresando células HEK293 con neuronas espinosas medias. Una vez más, las células de control HEK293 rara vez recibieron contactos con terminales presinápticas sinapsina positivo alcanzando 10,8 ± 0,48 contactos por célula HEK293 después de las 24 horas en el co-cultivo (Figura 4A izquierda, 4B) (± SEM significar). Sin embargo, las células HEK293 que expresanα1 / β3 / γ2 forma GABA A Rs significativamente más contactos sinapsis como con sinapsina positivo terminales presinápticas de las neuronas espinosas medias que alcanzan 25.3 ± 0.27 (media ± SEM) contactos por célula HEK293 después de las 24 horas en el co-cultivo (Figura 4 A la derecha, 4B). Esto indica que α1 / β3 / γ2 GABA A Rs expresado en células HEK293 también son capaces de promover la formación de contacto sináptico, aunque su potencia es menor que la potencia de α1 / β2 /-γ2 que contiene GABA A Rs.

Estos experimentos indican que el sistema modelo de co-cultivo desarrollado en nuestro laboratorio permite el análisis cuantitativo de la formación de contacto sináptico in vitro así como la evaluación de la eficacia de diferentes subtipos de GABA A Rs en este proceso. Estos experimentos demuestran además que Rs GABA A, además de ser componentes funcionales críticos de las sinapsis GABAérgicas, pueden jugar un papel claveen el proceso de reconocimiento y formación de contactos sinápticos entre neuronas inhibitorias y las células diana neuronales apropiados, independientemente de otras proteínas de adhesión sinápticas.

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Figura 1. inmunocitoquímica análisis de la expresión de GABA A R α1 / β2 / γ2 o α1 / β3 / γ2 en líneas estables de células HEK293. Los anticuerpos que reconocen los dominios extracelulares de las subunidades GABA A R se utilizaron para los receptores de la etiqueta expresadas en la superficie celular. ( A) línea celular HEK293 que expresa α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) y γ2 (Cy5) en niveles altos. (α1 B) línea celular HEK293 que expresa (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) y γ2 (Cy5)subunidades en niveles altos. Barra de escala:. 10 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

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Figura 2. GABAérgicas neuronas espinosas medianas forman contactos sinapsis como con α1 / β2 / γ2- que expresan las células HEK293 en co-cultivo. (A) el etiquetado fluorescente de terminales presinápticas con anticuerpos anti-GAD65 (en verde) y las células HEK293 con mCherry (en rojo, izquierda) o el GABA A subunidad γ2 R (en azul, a la derecha), reveló los puntos de co-localización entre estos marcadores que indican la formación de contactos-sinapsis como después de 4 o 24 horas en co-cultivo. Barra de escala:. 10 mm (B) Análisis cuantitativo de la sinapsis como co ntacts. Células HEK293 fueron identificados en base a su forma tal como se revela mediante formación de imágenes DIC y / o expresión mCherry, y el número de contactos entre GAD-65 puncta positivo (en verde) y la superficie de las células HEK293 se contó por el ojo en cada sección óptica de una serie Z-pila (8 - 10) por célula utilizando el software de formación de imágenes, y se expresa como el número de contactos / célula. El gráfico muestra el número de contactos entre neuronas espinosas medianas y control de células HEK293 (gris claro) o α1 / β2 células / γ2-HEK293 (negro) después de 4 y 24 horas en el co-cultivo (media ± SEM, n = 8 en cada condición a partir de dos experimentos independientes). Esta cifra ha sido modificado desde Fuchs et al. (2013) 30. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

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Figura 3. GABA A Rs promueven la formación de los contactos sinápticos activos. Immunolabeling de contactos como sinapsis formadas después de 24 horas en co-cultivo entre terminales de las neuronas espinosas medias positivas para GAD65 (Alexa Fluor 405 cian) y control de las células HEK293 (A), o (B) / β2 / γ2 células HEK293-α1, tanto transfectadas transitoriamente con mCherry construyen (rojo). Contactos activos son identificados por la co-localización entre el dominio específico luminal vesícula anticuerpo anti-sinaptotagmina (Cy5) y anticuerpo-GAD65 específica tanto en terminales presinápticos, y mCherry expresan en células HEK293. Barra de escala:. 10 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

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Figura 4. GABAérgicas neuronas espinosas medianas forman contactos sinapsis como con α1 / β3 / subunidad γ2- expresar HEK293 células en co-cultivo. (A) etiquetado fluorescente de terminales presinápticas con anti-anticuerpos sinapsina I (en verde), y de control de las células HEK293 (izquierda), o α1 / β3 / γ2 expresando células HEK293, tanto transfectadas transitoriamente con mCherry (en rojo), reveló puntos de co-localización entre estos marcadores que indican la formación de contactos sinápticos como después de 24 h en co-cultivo. Barra de escala: 10 mm (B). El análisis cuantitativo de los contactos como sinapsis. Células HEK293 fueron identificados por la expresión mCherry, y el número de contactos entre sinapsina I-positivo puncta (en verde) y la superficie de las células HEK293 se contó por el ojo en cada sección óptica de una serie Z-pila (8 - 10) por célula utilizando el software de formación de imágenes, y se expresa como el número de contactos / célula. El gráfico muestra el número de contactos entre neuronas espinosas medianas y control de células HEK293 (gris claro) o α1 / β3 células / γ2-HEK293 (negro) después de 24 horas en el co-cultivo (media ± SEM, n = 8-12 células en cada condición, a partir de dos experimentos independientes). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Discusión

Aunque este protocolo no es técnicamente difícil de realizar, hay varios pasos críticos que se deben seguir para alcanzar los ensayos de co-cultivo más precisos y repetibles. En primer lugar, las neuronas espinosas medias cultivadas deben ser sembradas a una densidad óptima. Si sembrado demasiado escasa, las neuronas tienden a desarrollar muy lentamente y la supervivencia se reduce en gran medida. Por otro lado, si se sembraron demasiado densamente, las neuronas tienden a agregarse que compromete el análisis de los contactos con las células HEK293. En segundo lugar, se recomienda para expresar transitoriamente un reportero fluorescente, GFP o mCherry en células HEK293 que expresan establemente GABA A Rs, antes de platting ellos en el co-cultivo. Esto permite el reconocimiento fiable de las células HEK293, que puede verse comprometida por la semejanza en forma y tamaño entre estas células y raras células glía sobrevivir en cultivos neuronales. Para lograr la transfección eficiente con GFP o ADNc mCherry, las líneas celulares HEK293 tienen que estar en la fase de crecimiento exponencial ycabeza de serie en la densidad adecuada en placas de 6 pocillos. Siembra Sparse seguido por transfección hará que las células crezcan mal, mientras que sobre-siembra evitará que las células de tomar el ADNc. Idealmente, las células deben ser sembradas para que estén entre el 70 - 90% de confluencia en el día de la transfección. En tercer lugar, la transfección debe ser optimizado para cada línea celular utilizada, ya que algunas líneas celulares son más sensibles que los demás. Esto es debido a GABA Una expresión constitutiva R en células HEK293 reduce la supervivencia celular y la capacidad de las células para recuperarse después de la transfección. Por otra parte, la supervivencia depende del tipo de Rs GABA A expresada en células HEK293, con algunas líneas celulares de ser significativamente más sensible que los otros. La transfección usando el reactivo liposomal es un método óptimo para la expresión de proteínas extrañas en líneas de células de crecimiento rápido, proporcionando tanto la alta eficiencia de la transfección y el nivel de expresión. Sin embargo, este reactivo causa demasiado daño a las líneas de células de crecimiento lento, porque utilizamos regularmente un reactivo de transfección liposomal no. Esto funciona de forma similar al reactivo liposomal pero la cantidad de ADN necesario para la transfección eficiente se reduce significativamente. Esto permite una mayor supervivencia de las células (aproximadamente el 80 - 90% en comparación con 60% usando reactivo liposomal) pero con menor eficiencia de transfección (60%). Por último, el número de HEK293 control o α1 / β2 / γ2 HEK293 que expresan las células añadidas a cultivos neuronales necesita ser optimizado. Adición de muy pocas células compromete el éxito del análisis de los contactos entre las células HEK293 y las neuronas, porque se vuelven muy raro. Por el contrario, la adición de demasiadas células HEK293 causa la muerte de las células neuronales dentro de pocas horas.

Cultivos de neuronas espinosas medianas embrionarias idealmente deben ser preparados usando tejido estriado disecados de edad embrionaria 15 - 17. Sin embargo, a menudo sucede que los embriones son un poco más joven o más viejo que la edad óptima. En este caso, el número de neuronas sembradas en Culturanecesitará variar. El tejido que es menor de E15 puede necesitar ser sembradas a una densidad ligeramente inferior, mientras que el tejido que es mayor de E17 puede necesitar ser sembradas a una densidad más alta, para permitir la supervivencia celular óptimo. Además, puede ser necesario añadir a los cultivos de más edad para prevenir el crecimiento de la glía, que es más abundante en el tejido mayores arabinósido de citosina (Ara-C).

Al crear co-cultivos, es importante a la placa el número optimizado de HEK293 transfectadas o α1 / β2 / γ2 células HEK293 que expresan, como se mencionó anteriormente. Sin embargo, puede ser necesario para determinar esto para cada línea celular individual, debido a las diferencias en su supervivencia. Típicamente 30.000 células en un volumen máximo de 50 l, debe añadirse a cada pocillo de una placa de 24 pocillos, que ya contiene 500 l de medio de cultivo neuronal, ya que esto asegura que el medio acondicionado no neuronal se diluye demasiado y que las condiciones dentro de cada pocillo permanecer bastante constante, por ejemplo, La concentración de factores de crecimiento. Adición de volúmenes superiores a 50 l a cada pocillo sería generalmente matar a las neuronas.

Una de las principales desventajas de la técnica de co-cultivo es que los cultivos neuronales son creados a partir de células disociadas cultivadas como una monocapa, lo que significa que las neuronas se han eliminado de su microambiente normal y no son capaces de establecer su organización anatómica normal. Por lo tanto carecen de las conexiones adecuadas, insumos y moléculas secretadas por otras células que pueden influir en las etapas iniciales del desarrollo de la sinapsis. Por ejemplo, in vivo neuronas espinosas medias están densamente inervadas por entradas glutamatérgicas de la corteza, el tálamo y otras regiones del cerebro 34, sin embargo, en nuestros cultivos neuronales sinapsis glutamatérgicas no forman debido a que estas entradas están dañados durante la disección del tejido estriatal. ¿Cómo la ausencia de las sinapsis glutamatérgicas funcionales en las neuronas espinosas medias cultivadas affeja su capacidad para formar sinapsis GABAérgicas entre sí y / o células HEK293 que expresan GABA A Rs sigue siendo una cuestión abierta. Esta pregunta podría ser fácilmente dirigida por el cultivo de neuronas espinosas medianas junto con las neuronas glutamatérgicas corticales lo que les permite formar sinapsis funcionales 35 antes de la adición de las células HEK293. Un enfoque alternativo sería diseñar un sistema modelo de co-cultivo basado en cultivos de cortes organotípicos, que mantienen algo de la citoarquitectura que puede ser importante para la maduración y la formación de sinapsis. Sin embargo, cultivos de cortes organotípicos tienen neuropil densa y heterogénea que puede comprometer el análisis realizado aquí. Otra desventaja importante del uso de ensayos de co-cultivo es que GABA A Rs expresada en la superficie de las células HEK293 no se agrupan como lo son en las neuronas, aunque esto no parece ser necesario para la formación de sinapsis dado una expresión en la superficie lo suficientemente alto como 30. Por ejemplo, en el rOdent cerebro y en cultivos de hipocampo, la α1 subunidad GABA A R se encuentra en la mayoría de las sinapsis GABAérgicas en todos los dominios postsinápticos de las células piramidales. Sin embargo, la α2 se encuentra específicamente en un subconjunto de las sinapsis en el somas y dendritas pero es altamente enriquecido en el segmento inicial del axón, según lo revelado por inmunofluorescencia y microscopía electrónica 36. Dado que la formación de sinapsis en los co-cultivos todavía se puede detectar de forma fiable y se analizó 30, esto sugiere que la densidad de GABA A Rs en la superficie celular de las células HEK293 puede ser similar a, o incluso mayor que la densidad de estos receptores dentro sináptica clusters en las neuronas. Esto puede explicar, al menos en parte, por qué las proteínas sinápticas de adhesión, tales como neuroligin, y proteínas de densidad postsinápticas, tales como gephyrin, no son necesarios para la formación de sinapsis en los co-cultivos, si los Rs adecuadamente ensamblados GABA A están presentes en suficiente densidad.

Está bien documentado que el GABA A Rs son estructuralmente y funcionalmente heterogénea, y que la composición de la subunidad del receptor determina su localización subcelular y propiedades farmacológicas. Por ejemplo, la incorporación de las 2 subunidades es conocido por ser un requisito previo para la localización sináptica de GABA A Rs mientras que la subunidad es casi exclusivamente presente en extrasinápticos GABA A Rs. Los receptores que incorporan sólo αβ combinaciones también se cree que están localizados predominantemente a los dominios extrasinápticos 12- 14. Ya sea que esta especificidad se mantiene en nuestro sistema de co-cultivo puede ser fácilmente probado por transfección transitoria de 2 o subunidades ADNc en las líneas celulares HEK293 que expresan de forma estable α y β subunidades, antes de añadirlos a cultivos neuronales. Nuestros experimentos preliminares utilizando este enfoque han sugerido que los contactos sinápticos se forman fácilmente sólo en presencia de la subunidad 2, lo que indica que la especificidadespecifici- observado in vivo es probable que se conserva in vitro (datos no presentados).

Además, Rs GABA A que incorporan diferentes subunidades α se localizan selectivamente a los contactos sinápticos formadas con tipos específicos de neuronas presinápticas. Por ejemplo, en el globo pálido, el RS α1-GABA A se encuentran generalmente en striatopallidal (str-GP) y (GP-GP) sinapsis palliopallidal, que se encuentran en las dendritas y regiones somáticas de las neuronas espinosas medianas, respectivamente. Los Rs α3-GABA A se encuentran en regiones perisomática de neuronas espinosas medias y se ponen en contacto por axón colaterales GP locales, mientras que los Rs α2-GABA A se encuentran en las dendritas distales de estas neuronas y en contacto principalmente por las entradas desde el cuerpo estriado 32. Expresión de subunidades α específicos en diferentes tipos de sinapsis y en diferentes compartimentos neuronales también se ha demostrado en otras áreas del cerebro, tales como hippocampus 21 y neocórtex 18,20. Estos resultados plantean la cuestión de cómo se forman las sinapsis inhibitorias específicas en el cerebro. ¿La adhesión de un tipo específico de terminal presináptica inducen la inserción de los subtipos específicos de GABA A R en los puntos de contacto? ¿Los receptores de víctimas de la trata de localizaciones subcelulares específicas de acuerdo a su composición de la subunidad, donde su inserción en la membrana plasmática es un requisito previo para la adhesión de los terminales axonales de origen específico? Hasta la fecha, estas preguntas siguen sin respuesta. El uso de sistemas de modelos reducidos, tales como el modelo de sistema de co-cultivo, nos permite empezar a responder esta pregunta complejas porque el sistema es fácilmente susceptible de transfección de construcciones de ADN y la aplicación de los reactivos y, sobre todo, es adecuado para el análisis de imágenes de células vivas 30. Por lo tanto, el uso de este modelo de sistema que podemos empezar a probar el papel de las moléculas individuales, incluyendo diferentes tipos de GABA A Rs, saben para estar presente en los contactos sinápticos. Otra ventaja es que las sinapsis en el formulario modelo de sistema rápidamente, en cuestión de minutos a horas, la reducción de la duración de los experimentos. Sistemas modelo de co-cultivo similares fueron empleados con éxito en el pasado para la detección de las nuevas moléculas sinaptogénica 27,37,38.

La comprensión de cómo se desarrolla el sistema nervioso central, madura y forma conexiones entre las neuronas tan intrincadamente con el control, por ejemplo, el comportamiento o la cognición, es de fundamental importancia. Este objetivo distante sólo se logrará mediante la delimitación de los mecanismos moleculares que gobiernan los pasos individuales de reconocimiento y la comunicación de célula a célula durante el desarrollo. Debido a la enorme complejidad, los detalles moleculares de estas múltiples interacciones celulares en la actualidad pueden ser estudiados con precisión sólo en sistemas reducidos. Sin embargo, la capacidad de aumentar la complejidad de estos sistemas mediante la expresión de múltiples combinaciones de proteínas y el estudio de cómoque interactuar tiene algunas ventajas en comparación con, por ejemplo, los enfoques supresión genética. Esto es debido a la interpretación precisa de los efectos de una sola deleción del gen es a menudo comprometida por cambios asociados con mecanismos de compensación de enmascaramiento de los efectos de las lesiones originales, particularmente en el cerebro en desarrollo. La técnica de co-cultivo pero informativo simple descrito aquí ha permitido un descubrimiento de la función estructural de GABA A Rs en la formación de sinapsis y se abrió la posibilidad de investigar cómo Rs GABA A y otras moléculas de adhesión celular y / o proteínas de la matriz sinápticas interactúan entre sí durante la sinaptogénesis. Proteínas de la matriz sinápticas son de especial interés dado que recientemente se ha demostrado que desempeñan un papel clave en la formación de sinapsis glutamatérgica 39. Un mayor desarrollo de modelos de co-cultivo es importante, ya que tienen el potencial para avanzar en el conocimiento de los mecanismos moleculares que guían la "normal y# 8217; el desarrollo del cerebro y por lo tanto aumentan nuestra comprensión de cómo estos mecanismos se alteran en muchas enfermedades del neurodesarrollo, tales como la epilepsia, la esquizofrenia, los trastornos del espectro autista y muchos otros.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Nos gustaría reconocer el apoyo financiero del Reino Unido MRC (G0800498). También nos gustaría agradecer al Profesor JM Fritschy, Universidad de Zurich, para proporcionar el anticuerpo GABA AR-subunidad específica γ2 y profesor R. Harvey, Escuela de Farmacia de la UCL, para proporcionar el pcDNA 3.1 (+) vectores de expresión que contiene resistencia a los antibióticos genes para la producción de líneas celulares transfectadas de forma estable HEK293.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Life Technologies11960-044Caliente en baño de agua a 37 ° C antes
de usar L-GlutaminaLife Technologies25030-024
Penicilina/EstreptomicinaLife Technologies15070-063Peligro: irritante
FBS (Suero Fetal Bovino)Life Technologies10106-169
NeuralbasalLife Technologies21103-049Baño de agua caliente a 37 ° C antes de usar
B27 SuplementoLife Technologies17504-044
GlucosaSigma-AldrichG8769
HBSS (10X)Life Technologies14180-046
HEPES (1M)Life Technologies15630-056
PBS (1X)Life Technologies10010-031
pcDNA 3.1(+) Vector de Expresión de Mamíferos (Selección Genética)Life TechnologiesV790-20
pcDNA 3.1(+) Vector de Expresión de Mamíferos (selección de Zeocina)Life TechnologiesV860-20
pcDNA 3.1(+) Vector de Expresión de Mamíferos (selección de higromicina)Life TechnologiesV870-20
HEK estable y alfa; 1 y beta; 2 y gamma; 2 líneasSanofi-Synthelabo, París
Poly-D-lisinaSigma-AldrichP1149
G418 sal de disulfato (Geneticin)Sigma-AldrichG5013Peligro: irritante
Feomicina D1 (Zeocin)Life TechnologiesR25001
Higromicina BLife Technologies10687-010Peligro: tóxico, irritante y corrosivo
Tripsina-EDTALife Technologies25300-054Baño de agua tibia a 37 ° C antes de usar. Peligro: irritante.
Poli-L-lisinaSigma-AldrichP6282
LamininaSigma-AldrichL2020
100 μ m Filtro de células de nailonVWR734-0004
Citosina β-D-arabinofuranósido (Ara-C)Sigma-AldrichC1768Peligro:
Agente quelante irritante (Versene)Life Technologies15040-033
Reactivo de transfección liposomal (Lipofectamine LTX) con reactivo tampón de transfección liposomal (reactivo PLUS).Life Technologies15338-100Método de transfección alternativo: Reactivo Effectene
Reactivo de transfección no liposomal (reactivo Effectene)Qiagen301425
Medio sérico reducido (Opti-MEM)Life Technologies11058-021
Anticuerpo anti-Synaptotagmin de ratón conjugado con Cy5Synaptic Systems105311C5
Neurobasal ALife Technologies10888-022
Cloruro de sodio (NaCl)VWR27810.364
GlicinaSigma-AldrichG1726
BSA (Albúmina sérica bovina)Sigma-AldrichA3294
Conejillo de indias anti-y gamma; 2 Anticuerpo del receptor GABAAProf. Jean Marc FritschyN/A(Instituto de Zúrich, Suiza) Fritschy, JM y Mohler, H. J. Comp. Neurol. 359 (1), 154-194 (1995).
Triton X-100PromegaH5141
Anticuerpo anti-glutamato descarboxilasa (GAD)65 para ratónMerck MilliporeMAB351
Anticuerpo anti-sinapsina para ratonesSynaptic Systems106-011
Anti-y beta para ratón; 2/3 anticuerpo (BD17)Merck MilliporeMAB341
Conejo anti-y alfa; 1 anticuerpo del receptor GABAAProfesora Anne StephensonN/A(Facultad de Farmacia de la UCL, Londres) FA Stephenson et al. J. Comp. Neurol. 416 (2), 158-172
Conejillo de indias de cabra conjugado con el anticuerpo Cy5Merck MilliporeAP1085
Anticuerpo Alexa Fluor 488 antiratón de cabraMerck MilliporeAP124S
Anti-ratón de cabra Anticuerpo Alexa Fluor 405Life TechnologiesA31553
Anticuerpo antiratón de cabra Alexa Fluor 555Life TechnologiesA21422
Anti-conejo de cabra Alexa Anticuerpo Fluor 488Life TechnologiesA11008
Reactivo de montaje (Prolong Gold)Life TechnologiesP36930Uso a temperatura ambiente

Referencias

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