Artículo de método

Microscopía Electrónica de Alta Resolución de la Helicobacter pylori Cag secreción tipo IV Sistema Pili Producido en condiciones variables de Hierro disponibilidad

DOI:

10.3791/52122

⸱

21 de noviembre de 2014

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1Department of Medicine - Division of Infectious Diseases, Vanderbilt University School of Medicine, 2Tennessee Valley Healthcare Systems, U. S. Dept. of Veterans Affairs

En este artículo

Resumen

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Aquí describimos un método para visualizar el orgánulo bacteriano oncogénico conocido como el Sistema de Secreción Cag Tipo IV (Cag-T4SS). Encontramos que el Cag-T4SS se produce diferencialmente en la superficie de H. pylori en respuesta a diferentes condiciones de disponibilidad de hierro.

Resumen

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Helicobacter pylori es una bacteria gramnegativa de forma helicoidal que coloniza el nicho gástrico humano de la mitad de la población humana1,2. H. pylori es la principal causa de cáncer gástrico, la segunda causa de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo3. Un factor de virulencia que se ha asociado con un mayor riesgo de enfermedad gástrica es la isla de patogenicidad Cag, una región de 40 kb dentro del cromosoma de H. pylori que codifica un sistema de secreción de tipo IV y la molécula efectora afín,4,5. El Cag-T4SS es responsable de la translocación de y peptidoglicano a las células epiteliales del huésped5,6. La actividad del Cag-T4SS da lugar a numerosos cambios en la biología de la célula huésped, incluida la regulación positiva de la expresión de citocinas, la activación de vías proinflamatorias, la remodelación del citoesqueleto y la inducción de redes de señalización celular oncogénica5-8. El Cag-T4SS es una máquina macromolecular compuesta por componentes de subensamblaje que abarcan la membrana interna y externa y se extienden hacia afuera desde la célula hacia el espacio extracelular. La porción extracelular del Cag-T4SS se conoce como "pilus"5. Numerosos estudios han demostrado que los pili Cag-T4SS se forman en la interfaz huésped-patógeno9,10. Sin embargo, las características ambientales que regulan la biogénesis de este importante orgánulo siguen siendo en gran medida oscuras. Recientemente, reportamos que las condiciones de baja disponibilidad de hierro aumentaron la actividad de Cag-T4SS y la biogénesis del pilus. Aquí presentamos un protocolo optimizado para cultivar H. pylori en diferentes condiciones de disponibilidad de hierro antes del co-cultivo con células epiteliales gástricas humanas. Además, presentamos el protocolo completo para la visualización del fenotipo hiperpiliado exhibido en condiciones restringidas de hierro mediante análisis de microscopía electrónica de barrido de alta resolución.

Introducción

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La infección por H. pylori es un factor de riesgo significativo para el cáncer gástrico1. Sin embargo, los resultados de las enfermedades varían y dependen de numerosos factores, como la genética del huésped, la diversidad genética de las cepas de H. pylori y elementos ambientales como la dieta del huésped11. Informes previos han establecido que existe una correlación entre la infección por H. pylori, la deficiencia de hierro (medida por la disminución de las concentraciones de ferritina y hemoglobina en sangre) y el aumento de la producción de citocinas proinflamatorias, incluida la secreción de IL-8, que en última instancia conduce a una mayor progresión de la enfermedad gástrica12. La infección aguda por H. pylori también se asocia con hipoclorhidria, que afecta la capacidad del huésped para absorber el nutriente hierro y, en última instancia, conduce a cambios en la homeostasis del hierro13. Estos hallazgos clínicos sugieren que la disponibilidad de hierro dentro del nicho gástico podría ser un factor importante en el resultado de la enfermedad. De hecho, modelos animales de infección por H. pylori han demostrado que el bajo consumo de hierro en la dieta exacerba la enfermedad gástrica14. Los niveles reducidos de hierro en estos animales requieren que H. pylori induzca una respuesta de adquisición de hierro con el fin de obtener el hierro necesario para la replicación bacteriana. H. pylori tiene la capacidad de perturbar el tráfico de hierro dentro de las células huésped para facilitar la replicación bacteriana de una manera dependiente de15. Curiosamente, se ha demostrado que la isla de patogenicidad cag está regulada por el factor de transcripción Fur16,17 que responde al hierro. Además, las cepas de Cag+ se asocian con un aumento de la inflamación y enfermedades gástricas como el cáncer1. Estos hallazgos respaldan un modelo en el que H. pylori altera la expresión de Cag-T4SS en un esfuerzo por obtener hierro de las células huésped que residen en un entorno sin hierro, lo que resulta en resultados de enfermedad exacerbados.

Dos factores que aumentan la inflamación y la morbilidad son la expresión de Cag y la baja ingesta de hierro en la dieta. Estos hechos apoyan la hipótesis de que la disminución de la disponibilidad de hierro aumenta la producción de Cag-T4SS pili en la interfaz patógeno del huésped, lo que resulta en una peor enfermedad gástrica11-14. El objetivo del método proporcionado en este manuscrito es establecer el papel del micronutriente hierro en la regulación de la biogénesis del pilus Cag-T4SS. En trabajos anteriores, utilizamos dos enfoques para observar un aumento dependiente del hierro en la expresión de Cag-T4SS. En primer lugar, se analizaron las cepas de producción de animales mantenidos con dietas altas y bajas en hierro y se reveló que las cepas de producción de la dieta baja en hierro produjeron más pili de Cag-T4SS que las cepas de la dieta alta en hierro14. En segundo lugar, el cultivo de la cepa 7.13 de H. pylori in vitro en condiciones repletas de hierro dio lugar a una reducción de la formación de pili, mientras que las células cultivadas en presencia de un quelante de hierro produjeron significativamente más pili.

Hemos continuado investigando la regulación dependiente del hierro del fenotipo Cag-T4SS pili y ofrecemos el siguiente protocolo optimizado y resultados representativos realizados con una cepa adicional de Helicobacter pylori, PMSS1. La justificación detrás del desarrollo de esta técnica fue correlacionar el aumento de la actividad de Cag-T4SS en condiciones de limitación de hierro con una mayor formación de pilus Cag-T4SS. La implicación y el uso más amplios de esta técnica proporcionarán condiciones de cultivo optimizadas que resultarán en una producción elevada del pili Cag-T4SS. Este ensayo será útil para los investigadores que buscan determinar la composición y la arquitectura del Cag-T4SS mediante el enriquecimiento de esta importante característica de la superficie bacteriana. La preparación y visualización de la muestra por microscopía electrónica de pistola de emisión de campo tiene numerosas ventajas sobre técnicas alternativas como los métodos de microscopía óptica para visualizar el Cag-T4SS y será apropiada para los investigadores interesados en estudiar la regulación de este orgánulo10.

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Protocolo

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1. H. Crecimiento pylori en distintas situaciones de disponibilidad de hierro y co-cultivo con células gástricas epiteliales humanas

  1. Seleccione H. PMSS1 pylori cepa para estos estudios debido a que tiene una isla de patogenicidad cag intacta y expresa un sistema de secreción de tipo IV funcionamiento. También utilizar un mutante cagE isogénica (PMSSI Δ jaula) como un control negativo. Crecer las bacterias en placas de TSA suplementadas con 5% de sangre de oveja (placas de agar sangre) durante 24 horas a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2.
    NOTA: Preparar reactivos y ensamblar materiales como se indica en la Tabla de Materiales y Equipos. Las concentraciones finales de cada reactivo se enumeran entre paréntesis.
  2. Raspe las bacterias de la placa utilizando un aplicador con punta de algodón estéril e inocular en caldo brucella modificado preparado a partir de los componentes (ver Materiales y Equipos tabla) y se completará con el colesterol. Incubar durante una noche a 37 culturas° C en aire ambiente, complementado con 5% de CO 2 con agitación a 200 revoluciones por minuto (rpm).
    NOTA: El colesterol se utiliza en lugar de suero bovino fetal debido al hecho de que el suero es complejo; que contiene numerosas fuentes de hierro de nutrientes tales como heme que provoca variabilidad en los resultados.
  3. En el día de cultivo bacteriano, semilla de células epiteliales gástricas humanas AGS (ATCC CRL-1739) sobre cubreobjetos tratados con poli-D-lisina en placas de 12 pocillos (alrededor de 1 x 10 5 células por pocillo).
  4. El día siguiente, diluir cultivos bacterianos a una DO600 de 0,3 en caldo Brucella modificado solo o suplementado con 100 mM FeCl 3, 200 dipiridilo mu M (un quelante de hierro sintético), o 200 mM dipiridilo más 250 M FeCl 3. Incubar estos cultivos durante 4 horas a 37 ° C en aire ambiente, complementado con 5% de CO 2 con agitación a 200 rpm.
  5. Bacterias centrifugar a 1000 xg para recoger las células y eliminar los sobrenadantes antes de resuspender in un volumen igual de caldo de Brucella modificado fresco suplementado con colesterol. Medida DO600 del cultivo (OD600 = 1,0 = 5,5 x 10 8 células / ml) y añadir las bacterias a las células epiteliales en una multiplicidad de infección (MOI) de 20: 1. Realizar diluciones en serie y las células bacterianas de la placa sobre placas de agar de sangre para evaluar la viabilidad celular bacteriana.
  6. Incubar H. células epiteliales gástricas humanas pylori y AGS co-cultivos de 4 horas a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2 en condiciones estáticas antes de realizar la microscopía electrónica de barrido (SEM) de preparación de muestras.

2. Preparación de muestras para SEM Visualice H. pylori CagA-T4SS Pili

  1. Retire H. pylori y co-cultivos AGS de la incubadora y decantar el sobrenadante de cultivo (a ahorrar para la IL-8 ELISA). Lavar suavemente tres veces con 0,05 M tampón de cacodilato de sodio (pH 7,4). Fijar las muestras durante 2-4 horas a temperatura ambiente en una solución de 2,0% de paraformaldehído, 2.5% De glutaraldehído, y tampón de cacodilato de sodio 0,05 M. Después de la fijación primaria, lavar las muestras tres veces con tampón de cacodilato de sodio 0,05 M.
  2. Realizar fijación secundaria usando 0,1% de tetróxido de osmio en tampón de cacodilato de sodio 0,05 M secuencial en dos pasos 10 min de fijación. Después de la fijación secundaria, lavar las muestras tres veces con tampón de cacodilato de sodio 0,05 M.
  3. Después de la fijación primaria y secundaria, deshidratar muestras por lavado secuencial con concentraciones crecientes de etanol según la Tabla 1.
  4. Después de la deshidratación de etanol, realizar tres lavados secuenciales de dióxido de carbono líquido. A continuación, las muestras secas en un punto crítico utilizando una máquina secadora de punto crítico a una temperatura de 31,1 ° C y la presión de 1,073 psi.
  5. Monte cubreobjetos en aluminio SEM talones de la muestra y la pintura con una línea delgada de plata coloidal en el borde de la muestra para lograr la conexión a tierra apropiada y evitar la carga durante la proyección de imagen SEM.
  6. Muestras Coat con 5 nm deoro-paladio usando una máquina de capa por pulverización catódica para aumentar la señal de electrones secundarios de la muestra y efecto de borde.

3. Los parámetros de imagen para análisis de alta resolución de SEM

  1. Ver muestras con una emisión de campo Pistola microscopio electrónico de barrido (FEG-SEM).
  2. Image en un modo de alto vacío a una distancia de trabajo de 5-10 mm.
  3. Ajuste el voltaje de aceleración a 5 kV.
  4. Establecer tamaño de punto a 2-2,5.
  5. Incline la muestra entre 15-25 grados para conseguir una mejor vista de la interfaz de huésped-patógeno.
  6. Dar prioridad a la formación de imágenes bacterias adheridas a los bordes de las células epiteliales para la visualización de gran aumento, ya que estas áreas de interacción huésped-patógeno se enriquecen para las bacterias de formación de pili.

4. Los análisis estadísticos para Evaluar Pili cuantificaciones

  1. Analizar H. pili pylori Cag-T4SS utilizando el software ImageJ para cuantificar número de pili / célula, así como por ciento de células que presentan el piliated phenotype según las instrucciones de abajo.
  2. Micrografía archivos abiertos en el software ImageJ. Identificar pili como estructuras formadas entre la célula bacteriana y la célula huésped, con anchura uniforme (10-13 nm) y la longitud (60-150 nm).
    NOTA: La estructura pilus está presente en cepas bacterianas WT, pero ausente en las cepas isogénicas tales como cepas mutantes Δ jaula, que albergan una inactivación en el gen que codifica la ATPasa importante que el conjunto de la secreción de tipo IV poderes pilus.
  3. Calibrar la herramienta de medición dibujando una línea con la herramienta de línea recta y luego hacer clic en la pestaña "Analizar". Seleccione "Escala de Ajuste" en el menú desplegable e introduzca el valor de la barra de ampliación en el cuadro denominado "distancia conocida" y establecer la unidad de longitud en el valor adecuado (nm). Haga clic en "Aceptar".
  4. Mida pili Cag-T4SS utilizando la herramienta de línea recta para dibujar sobre la longitud o anchura del pilus y luego presione "Ctrl-M" para medir cada pilus. Observar un cuadro de diálogo con los valores medidos. Anote estos valores o copiar y pegar en un programa de hoja de cálculo.
  5. Utilice la longitud y el ancho de los parámetros previamente establecidos 24, hacen caso omiso de las características que no se ajustan al perfil de Cag-T4SS. Entonces cuantificar el número de pili sobre la base de los valores que están dentro de los puntos de corte 10-13 nm de anchura y 60-150 nm de longitud.
  6. Analizar la cuantificación de pili estadísticamente por la prueba t de Student de dos colas utilizando el software GraphPad Prism.

5. Opcional: Evaluación de la IL-8 secreción que se correlaciona con Pilus Producción

  1. El uso de sobrenadantes de la Etapa 2.1, realizar una IL-8 ELISA según las instrucciones del fabricante con el kit (véase Materiales y Equipo Tabla).
  2. Analizar la IL-8 secretada por las células huésped y calcular el porcentaje de inducción de IL-8 con respecto a WT PMSS1 crecido en medio solo. Realizar el análisis estadístico utilizando dos colas la prueba t de Student utilizando GraphPad Prisma asíftware.

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Resultados

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En este informe, hemos demostrado que las condiciones de variación de la disponibilidad de hierro tienen la capacidad de modular H. pylori CagA-T4SS biogénesis pilus en la interfaz de patógenos de acogida. Cuando se cultivan en medio solo, H. pylori forma un promedio de 3 pili / célula. Cuando H. pylori se cultiva en condiciones de agotar hierro (utilizando el dipiridilo quelante sintético) que son sub-inhibidor al crecimiento bacteriano (Figura 1), las bacterias producen nume...

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Discusión

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El hierro es un micronutriente esencial para la mayoría de las formas de vida, incluyendo los patógenos bacterianos. En un esfuerzo para restringir la viabilidad de los microorganismos invasores, los huéspedes vertebrados secuestran hierro de nutrientes en un proceso conocido como "inmunidad nutricional" 18. En respuesta a esto, los patógenos bacterianos han evolucionado para utilizar el hierro como una molécula de señalización global para percibir su entorno y regular la elaboración de característi...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Esta investigación fue apoyada por el Premio de Desarrollo Profesional del Departamento de Asuntos de Veteranos 1IK2BX001701 y el UL1TR000445 de premios CTSA del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales. Su contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales o los Institutos Nacionales de Salud. Los experimentos de microscopía electrónica de barrido se realizaron en parte mediante el uso del recurso compartido de imágenes celulares de VUMC, respaldado por las subvenciones de los NIH CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 y EY08126.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
de brucella modificado
Peptona de caseína (10 g/L)Sigma70172
Digestión péptica de tejido animal (10 g/L)Sigma70174
Extracto de levadura (2 g/L)Sigma92144
Dextrosa (1 g/L)SigmaD9434
Cloruro de sodio (5 g/L)Thermo FisherS271-10
Colesterol (250X) (4 ml/L)Life Technologies12531018 Cloruro
férrico (100 o 250 uM)Sigma157740-100G
Dipiridyl (200 uM)SigmaD216305-100G
RPMI
RPMI+HEPES (1X)Life Technologies22400-121
Suero fetal bovino ( 100 ml/L)Life Technologies10438-026
Preparación de Microscopía Electrónica
Paraformaldehído (2,0% acuoso)Ciencias de la Microscopía Electrónica15713
Gluteraldehído (2,5% acuoso)Ciencias de la Microscopía Electrónica16220
Cacodilato de sodio (0,05 M)Ciencias de la Microscopía Electrónica12300
Tetróxido de osmio (0,1% acuoso)Ciencias de la microscopía electrónica19150
Etanol (absoluto)SigmaE7023
Pintura de plata coloidalCiencias de la microscopía electrónica12630
Talones de muestras SEMCiencias de la microscopía electrónica75220
CubreobjetosThermo Fisher08-774-383
de secreciones de IL-8
Quantikine IL-8 kit ELISAR& Sistemas DD8000C
Caldo modificadoEvaluación

Referencias

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