Ver y acceder al embrión de pollo durante el desarrollo puede ser un desafío. Hemos desarrollado un método ex ovo que es simple, rentable y se puede usar fácilmente en un aula o en un entorno de investigación. Este método proporciona acceso al embrión en etapas tardías del desarrollo embrionario (HH 40).
Artículo de método
Optimizado Ex-ovo El cultivo de embriones del polluelo a etapas avanzadas de desarrollo
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Resumen
Resumen
La investigación en anatomía, embriología y biología del desarrollo se ha basado en gran medida en el uso de organismos modelo. Con el fin de estudiar el desarrollo en embriones vivos, a menudo se utilizan organismos modelo, como el pollo. El pollo es un excelente organismo modelo debido a su bajo costo y mínimo mantenimiento, sin embargo, presentan desafíos de observación porque están encerrados en una cáscara de huevo opaca. Con el fin de ver correctamente el embrión a medida que se desarrolla, la cáscara debe estar cerrada o removida. Tanto las técnicas de ventana como las técnicas ex ovo se han desarrollado para ayudar a los investigadores en el estudio del desarrollo embrionario. Sin embargo, cada uno de los métodos tiene limitaciones y desafíos. Aquí, presentamos una técnica de cultivo ex ovo simple y optimizada para embriones de pollo que permite la observación del desarrollo embrionario desde la etapa HH 19 hasta las etapas tardías del desarrollo (HH 40), cuando muchos órganos se han desarrollado. Esta técnica es fácil de adoptar tanto en las clases de pregrado como en los laboratorios de investigación más avanzados donde se realizan manipulaciones de embriones.
Introducción
El cultivo ex ovo ha desempeñado un papel importante en el estudio del desarrollo de los pollos1, 2. Este método de cultivo se ha utilizado para estudiar enfermedades neurológicas, desarrollo de extremidades, desarrollo craneofacial y como modelo para investigar malformaciones asociadas con la diabetes 3, 4, 5.
Hay muchas variaciones de la técnica ex ovo. El enfoque más común es usar un vaso de espuma de poliestireno6,7,8 o un tazón de vidrio5. En estos métodos, la taza o tazón se forra con una envoltura de plástico para acunar el embrión, se coloca una tapa en la taza y luego se coloca el embrión en una incubadora con la humedad adecuada6. Sin embargo, esta configuración puede ser técnicamente desafiante. El primer reto es la envoltura de plástico que se utiliza para acunar al embrión. Esta envoltura es difícil de trabajar y, a menudo, no se adhiere muy bien a la copa. Para resolver este problema, se coloca una banda elástica alrededor de la copa para mantener la envoltura en su lugar. A pesar de esto, la envoltura aún puede deslizarse, lo que es fatal para el embrión. La envoltura de plástico tiene el potencial de romperse o perforarse con fórceps o agujas que pueden usarse durante las manipulaciones y observaciones de embriones. Finalmente, esta configuración no es muy estable y los estudiantes pueden derribar fácilmente las tazas. La altura de las copas también hace que sea muy difícil colocar el embrión bajo un microscopio estereoscópico, que tiene un objetivo limitado a la altura del estadio. Estos desafíos dificultan que los estudiantes de pregrado trabajen con embriones de pollo vivos en laboratorios de enseñanza, como cursos avanzados de biología del desarrollo.
Los desafíos anteriores en el método ex ovo han significado que los investigadores recurran al método de ventanas 9,10 para ver el desarrollo embrionario de los pollitos. En esta técnica, se hace un agujero o "ventana" en la cáscara del huevo que recubre el embrión. El orificio se puede volver a sellar con cinta adhesiva o cera9 para permitir un mayor desarrollo embrionario. Aunque el método de ventanas tiene algunas ventajas, como la capacidad de ver el desarrollo embrionario y el fácil mantenimiento, este método también tiene varias limitaciones. La primera es que la ventana debe ser bastante grande para poder ver todo el embrión (especialmente en las últimas etapas). En segundo lugar, las ventanas grandes son difíciles de sellar; Un sellado inadecuado provocará problemas de esterilidad y supervivencia. El uso de cera fundida como sellador agrega otro paso inconveniente y desordenado al protocolo. Por lo tanto, aunque el método de ventana puede ser ideal para embriones de pollo en etapas jóvenes (HH 11 – HH 27), la visualización del embrión completo en etapas tardías no es fácil de lograr.
Aquí, describimos una técnica de cultivo ex ovo mejorada y simple11 que evita la necesidad de equipos de alta tecnología, es fácil de manejar bajo un microscopio estereoscópico, proporciona al embrión suficiente soporte para realizar manipulaciones microscópicas y permite a los investigadores ver el crecimiento del embrión en su totalidad hasta bien entrada la fase final del desarrollo (hasta HH 40-41). Con estos avances en la técnica ex ovo, los individuos obtienen acceso a una comprensión más completa del desarrollo embrionario. Por ejemplo, el crecimiento en etapas posteriores permite a los individuos observar procesos de desarrollo que no ocurren hasta este punto de tiempo, como la osificación, el desarrollo de las plumas y el desarrollo avanzado de las extremidades y los ojos. Todo el embrión y las membranas y vasculatura extraembrionarias son claramente visibles. También se pueden realizar investigaciones más avanzadas, como manipulaciones embrionarias (es decir, implantar perlas empapadas en inhibidores o insertar barreras entre las capas de tejido), y los investigadores pueden observar el efecto de las manipulaciones en embriones en etapas posteriores.
Protocolo
Nota: Todos los suministros se enumeran en la Tabla 1.
1. Almacenamiento del pollo embriones
- Incubar huevos de gallina de la cepa de la especie Gallus gallus horizontalmente a 37 ° C, con aproximadamente 40% de humedad y girar los huevos una vez o dos veces al día. Volviendo huevos es importante para evitar que el embrión se adhiera a la cáscara del huevo.
- No girar el huevo en la 24 horas antes de la creación de la cultura de lo contrario el embrión se encuentra ventral a la masa de yema y puede dañarse al abrir el huevo en el paso 3. Además, mantener los huevos a 4 ° C grados para no más de una semana antes de la incubación a "alto" desarrollo pero esto no es lo ideal.
2. Puesta pollo embriones
- Etapa los embriones de pollo utilizando la hamburguesa y Hamilton 12 tabla provisional. El escenario ideal para establecer el cultivo ex ovo es HH etapa 19-20 (alrededor de 3 días de incubación) becausa esto es poco después de la cabeza se convierte en 53 HPF.
Nota: HH etapa 19-20 se caracteriza por los siguientes rasgos morfológicos: somitas se extienden en la mayoría de la cola, sin embargo, el final de la cola permanece no segmentado, el brote de la cola está curvado, el alantoides es pequeña y ha limitado vasculatura, las piernas brotes son más grandes que los de ala-brotes y los ojos son sin pigmentar o tienen un tono grisáceo.
3. Extracción del Embrión de la Shell
- Antes de extraer el embrión de la cáscara, rocíe la cáscara con etanol al 70% y deje que se seque. No encienda el huevo rápidamente ya que podría dañar el embrión.
- Con cuidado de no alterar la orientación del huevo, el crack con cuidado el huevo en la parte inferior (es decir, el lado que estaba ventral durante la incubación) y suelte el embrión en una estéril pesan barco (88 x 88 x 23 mm). Limpie sopesar barcos con etanol al 70%. Inspeccionar el embrión para asegurarse de que el saco vitelino no está dañado. Si la yema hcomo quebrado, deseche el embrión, ya que no va a sobrevivir.
- Observar el embrión para asegurarse de que es viable; el corazón está latiendo, vasculatura parece normal, y no hay anomalías obvias están presentes. Asegúrese de que los bordes del recipiente para pesar están secos.
- Con una pipeta, soltar 40 l de penicilina / estreptomicina (5.000 unidades de penicilina, 5 mg de estreptomicina por ml) en la parte superior de la albúmina para ayudar a prevenir la infección.
4. Preparación de la Cámara de humedad
- Coloque una pequeña pila de Kim-toallitas y / o una almohadilla absorbente hecho de algodón en el fondo de un recipiente de plástico estéril (12 x 12 x 6 cm) limpió con etanol al 70%.
- Añadir, agua destilada estéril para humedecer los Kim-toallitas y / o algodón (aproximadamente 150 ml de agua).
5. Montaje de la Ex Ovo Cultura
- Coloque el barco pesar que contiene el embrión en la parte superior del relleno húmedo. Luego, coloque la mitad de un plato petri estéril cuadrada (9,5 x 9,5 cm) en la parte superior de la tque pesan barco para formar una tapa suelta.
- Cubra el recipiente de plástico con su tapa. Presione las dos esquinas de la tapa, asegurando un sello parcial que aún permite una buena circulación de aire dentro de la cámara.
- Coloque cuidadosamente la configuración en la incubadora a 37 o hasta la etapa deseada.
- Colocar los recipientes de agua en la incubadora para ayudar a controlar la humedad, si un incubador de humedad controlada no está disponible. Esterilizar todo el agua en las cámaras de humedad y en la incubadora y reponer cuando sea necesario durante el período de incubación. 40% de humedad es ideal.
Resultados
Este ex ovo método permite la observación de los embriones desde las primeras etapas de desarrollo (HH 19/20) a las etapas finales de desarrollo (HH 40-41) (Figura 1A y 1B). La creación de la cultura en HH 19-20 aumenta la supervivencia de los embriones en la cultura. Antes de la cabeza de giro (antes de 53 hpf) de supervivencia es muy baja en cultivo y después de la etapa 21, el embrión tiende a pegarse más a la cáscara en la eliminación de por lo menos se obtienen embriones intactos. En general, la supervivencia del embrión en ex ovo cultura es alta hasta HH 35-36 (90-100%), pero sí caída en las etapas más avanzadas de desarrollo (alrededor del 40% sobrevive a HH 40-41). Además, aunque se ha demostrado que el desarrollo parece normal en estas etapas finales y los patrones del esqueleto se ve afectada 4,15, hemos observado que las extremidades están dobladas en estas etapas finales de los años que sugieren que el grado o el momento de la osificación pueden verse afectadas. Esno es de extrañar teniendo en cuenta la necesidad de que el calcio de la cáscara para la osificación. Una comparación detallada del desarrollo del embrión en comparación con los controles está en marcha y está más allá del alcance de este documento métodos.
La obtención de acceso a lo largo del desarrollo del embrión es importante por dos razones principales. En primer lugar, los investigadores son capaces de ver el desarrollo sobre una base diaria sin tener que quitar el sello y vuelva a sellar una ventana. Por ejemplo, los individuos son capaces de observar las extremidades y el desarrollo del ojo en múltiples etapas (Figura 1C y 1D). En segundo lugar, el ex ovo cultivo permite un mayor acceso (sin restricciones) para el embrión, lo que permite manipulaciones fáciles o cirugías.
Manipulaciones embrionarias más a menudo, tienen que llevarse a cabo utilizando un estereomicroscopio. Utilizando el ex ovo método de cultivo descrito aquí en comparación con el método / envoltura de plástico de espuma de poliestireno 6,7,8 embrión set-up es fácil de colocar under el microscopio, es menos profundo y no volcar. Esto permite al investigador para posicionar la cámara de humedad, precisamente como sea necesario y para girarla para optimizar el acceso al embrión, ya que no hay barreras (cáscara de huevo) que oscurecen el embrión y puesto que la cámara es muy estable. En general, el apoyo que el embrión recibe desde el barco pesaje permite una suave presión que debe aplicarse para el embrión durante la manipulación sin el set-up vuelque.
Varios métodos de biología del desarrollo pueden llevarse a cabo en los embriones en este sistema de cultivo. Estos incluyen observaciones detalladas de órgano (por ejemplo, ojo, cerebro, etc.) o el desarrollo de tejidos (por ejemplo, crecimiento de vasos sanguíneos) o aplicación de agentes teratogénicos. Las manipulaciones incluyen injerto de tejidos sobre las membranas corioalantoideas para estudiar el efecto de la combinación de diferentes capas de tejido o estudiar el crecimiento del tumor y la metástasis 14. Otra manipulación populares que se realizan durante el desarrollo es bead o barrera de la implantación. La implantación de bolas permite al investigador en remojo un inhibidor o factor en la perla y luego implantar el talón localmente para inhibir o inducir genes a nivel local en el área de interés. Esto se suele hacer mediante AffiGel o heparina granos (Figura 2). Por ejemplo, las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) se pueden inhibir localmente durante la inducción de la cresta neural derivada de hueso 4, 15, o en la extremidad en desarrollo brote 13. Después se implanta una perla, el embrión puede ser devuelto a la incubadora y se seguirá desarrollando. Esto permite a los investigadores para ver los efectos aguas abajo de la inhibición de un gen particular (en este caso BMP), tales como la inhibición de la formación de huesecillos escleral en el anillo esclerótico (Figura 2B y 2C) 15. Del mismo modo, las barreras se pueden insertar fácilmente entre las capas de tejido con el fin de estudiar la señalización de tejido a tejido y la microinyección de colorantes también puede ser fácilmente llevado a cabo.
Figura 1. Visualización del embrión ex ovo. (A) Etapa de HH 20 embrión de pollo después de la eliminación de la cáscara, flecha apunta al embrión con membranas embrionarias vascularizados. (B) Un HH etapa 40 embriones en una cámara de humedad libre. (C) HH etapa 35 embriones que muestra esbozos de los miembros tempranos (flecha). (D) Etapa HH 41 embriones que muestra el desarrollo de la etapa posterior de estructuras como el ojo (flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Ejemplo de Noggin empapado talón Implantación experiment 4. (A) embriones HH etapa 35 expuesta a través de un pequeño agujero rasgado en las membranas que recubren el fin de obtener acceso al ojo subyacente para la implantación de bolas. De alta magnificación de la perla Affigel adyacente a una papila conjuntival se muestra en el recuadro. La barra de escala en C es de 75 m. (B) La fosfatasa alcalina manchado ojo derecho después de la implantación de bolas Noggin (flecha) que muestra vacío en el anillo de huesecillos, HH 38 (C) AP manchado ojo izquierdo sin mostrar alteración al anillo de huesecillos (control ), HH 38. Los detalles de este experimento se proporcionan en Duench y Franz-Odendaal 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discusión
Ex ovo cultivo y de ventanas ambos tienen ventajas y desafíos. Aquí se comparan las ventajas y desafíos de la taza de espuma de poliestireno ex ovo método y el método de ventanas a nuestro ex optimizado ovo método que se muestra aquí. Nuestro método permite la manipulación y la fácil observación del embrión de pollo en las etapas finales de desarrollo y nuestros refinamientos al ex ovo tradicional método 1, 2, 3 lo hacen, además, muy fácil de utilizar en las clases de laboratorio de enseñanza de pregrado.
Aunque muchos investigadores prefieren el método de ventanas para estudiar el desarrollo de pollo, ya que es fácil de realizar y tiene una excelente capacidad de supervivencia de las últimas etapas de desarrollo (HH 41-42), tiene limitaciones. La mayor de las cuales es la limitada capacidad de ver todo el embrión después de HH etapa 30. Después de la etapa HH 30, la ventana en la cáscara del huevo tiene que ser muy grande para ver el crecimiento, embrión en movimiento. Esta gran ventana es diffcil para sellar por completo (que conduce a problemas de esterilidad y capacidad de supervivencia), y la obtención de una buena iluminación en el interior del huevo puede ser un reto. Además, los embriones en etapa avanzada son grandes y de difícil acceso (o manipular) a través de la ventana.
El ex ovo método descrito aquí proporciona acceso sin restricciones completo al embrión. Una vez que el barco peso se coloca en la cámara de humedad, todo el set-up es muy estable. La cámara de toda la humedad se puede colocar bajo un microscopio de disección y una gran ampliación puede utilizarse para observar todo el embrión. En comparación, el método de copa de espuma de poliestireno tiene una cámara de humedad que es alto (altura taza) y esto hace que sea muy difícil colocar bajo los objetivos del microscopio. El diseño de la taza es también mucho menos estable que la plana sopesar barco y estos vasos puede ser volcado fácilmente. Nuestras mejoras al ex ovo método hacen que este método sencillo de usar en el aula o en el laboratorio y permite el student tener acceso completo a los embriones de etapa HH 19 a través de HH 40; etapas cuando se está produciendo organogénesis principal. La mayor desventaja de nuestra ex ovo método es la esterilidad. Con el fin de prevenir la infección, nuestro método incluye la adición de antibióticos. Otra dosis de antibiótico puede administrarse al embrión en etapas posteriores. Los antibióticos administrados durante el cultivo configuración también no parece afectar el desarrollo del embrión. La esterilización de recipientes con etanol al 70% antes de su uso puede aumentar drásticamente la supervivencia.
En general, el ex ovo método es ideal para la visualización y manipulación de embriones sin limitaciones de acceso o etapa de desarrollo. Investigaciones anteriores han demostrado que el cultivo de los embriones ex ovo no afecta negativamente modelando 4,15. Por ejemplo, no vemos ningún cambio en el patrón o la inducción del esqueleto a pesar de la ausencia de la cáscara del huevo. Nuestro método mejorado resuelve múltiples cESAFÍOS que existen con la actual ex ovo tradicional método de 1,2, 3.
Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros en competencia en lo que respecta a la información presentada en este manuscrito.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a Paul Poirier, el Productor de Medios, en la Universidad Mount Saint Vincent por su trabajo en la filmación y la edición de la parte de vídeo de este manuscrito. Reconocemos el de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá para su financiación.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Penicilina/Estreptomicina | Sigma | P4458 | Haga pequeñas alícuotas para evitar eventos de congelación/descongelación |
| Petri cuadrada | 9,5 cm x 9,5 cm | ||
| Barco de pesaje | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Contenedor Ziplock | N | /A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
