Describimos aquí un método de extensión de cebadores basado en fluorescencia para determinar los puntos de partida transcripcionales a partir de transcripciones bacterianas y el procesamiento de ARN in vivo utilizando un secuenciador de gel automatizado.
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Artículo de método
Fluorescencia Basado Técnica de extensión del cebador para determinar la transcripción puntos de partida y los sitios de escisión de RNasas En Vivo
En este artículo
Resumen
Resumen
Fluorescencia de extensión del cebador basado (FPE) es un método molecular para determinar los puntos de partida de la transcripción o sitios de procesamiento de moléculas de ARN. Esto se consigue mediante la transcripción inversa del ARN de interés usando cebadores marcados con fluorescencia específicos y el análisis posterior de los fragmentos de ADNc resultantes mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida. Simultáneamente, una reacción tradicional de secuenciación de Sanger se ejecuta en el gel para mapear los extremos de los fragmentos de ADNc a sus bases correspondientes exactas. En contraste con 5'-RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc), donde el producto debe ser clonado y secuenciado múltiples candidatos, la mayor parte de fragmentos de ADNc generados por la extensión del cebador se puede detectar simultáneamente en una carrera gel. Además, todo el procedimiento (de la transcripción inversa para el análisis final de los resultados) se puede completar en un día laborable. Mediante el uso de cebadores marcados con fluorescencia, el uso de isótopos radiactivos peligrosos reactivos marcadosse pueden evitar y los tiempos de procesamiento se reducen como productos pueden ser detectados durante el procedimiento de electroforesis.
En el siguiente protocolo, se describe un método de extensión de cebador fluorescente in vivo para detectar de forma fiable y rápida los extremos 5 'de los ARN para deducir puntos de partida de la transcripción y sitios de procesamiento del ARN (por ejemplo, por componentes del sistema toxina-antitoxina) en S. aureus, E. coli y otras bacterias.
Introducción
La extensión del cebador 1 es un método molecular para determinar los extremos 5 'de moléculas de ARN específicas hasta una resolución una base. La ventaja de otros métodos tales como 5'-RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc) es el tiempo de respuesta rápido y la capacidad de analizar fácilmente una mezcla de diferentes longitudes de moléculas de ARN.
Este método funciona sometiendo moléculas de ARN para revertir reacciones de transcripción utilizando cebadores fluorescentes específicas, generando fragmentos de ADNc de ciertas longitudes. Estas moléculas de ADNc se ejecutan junto tradicionales reacciones de secuenciaci....
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Protocolo
1. Alto Rendimiento Preparación de ARN
- Aislamiento de ARN
NOTA: Las altas concentraciones de ARN total se necesitan para la reacción de extensión del cebador. Kits columna de centrifugación por lo general no producen la cantidad de ARN necesaria (~ 5-16 g en 5 l de volumen). Por lo tanto se recomienda la purificación utilizando el método de extracción de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio ácido, se describe a continuación.
NOTA: El fenol es cancerígeno, tóxico y corrosivo. Por favor, lea las hojas de datos de seguridad de los materiales y el uso bajo una campana de humos con la protección adecuada!- Crecer o tratar las células bact....
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Resultados
Como se representa en la figura 6, una reacción de extensión del cebador se puede utilizar para determinar los puntos de partida de la transcripción de las transcripciones de interés y puede ayudar a deducir regiones promotoras (normalmente identificado por -10 y -35 elementos). El fragmento de ADNc más alta (más larga) representa el extremo 5 'del ARNm y por lo tanto se puede asignar fácilmente cuando se compara con la escalera de secuenciación.
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Discusión
Extensión del cebador fluorescente es un método sencillo y rápido para determinar los extremos 5 'de los ARN, ya sea para TSP- o identificación procesamiento del ARN secundaria. Debido a la utilización de cebadores fluorescentes, las reacciones se pueden configurar y ejecutar sin las precauciones de seguridad adicionales (a diferencia de en el caso de cebadores marcados radiactivamente). Como las muestras son detectados por fluorescencia, que pueden obtenerse imágenes, mientras que la electroforesis está en progreso.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar que presente un conflicto de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a Anne Wochele por su ayuda en el laboratorio y a Vera Augsburger por su ayuda con el secuenciador de gel automatizado. Agradecemos a la Deutsche Forschungsgemeinschaft la financiación de las subvenciones BE4038/2 y BE4038/5 dentro de los "programas prioritarios" SPP1316 y SPP1617.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| AMV Transcriptasa Inversa (20-25 U/µ l) | NEB / Roche | NEB: M0277-T / Roche: 10109118001 | |
| DNasa I (libre de RNasa) | Ambion (tecnologías de vida) | AM2222 | |
| FastPrep-24 Instrumento | MPBio | 116004500 | |
| Imprimaciones marcadas con fluorescencia | Biomers | n/a | 5' DY-681 modificación de " ordinario" Oligonucleótidos de ADN. Los tintes compatibles, como el LICOR IRDye 700/800, también están disponibles en otros proveedores, como IDTdna. |
| Secuenciador Li-Cor 4200 incl. ImagIR Software de recopilación de datos | Li-Cor | Producto descatalogado | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Agua libre de nucleasas | Ambion (life technologies) | AM9915G | |
| Mini kit de preparación de plásmidos | QIAGEN | 12125 | |
| RapidGel-XL-40% Concentrado | USB | US75863 | |
| TAMPÓN DE ALMACENAMIENTO DE ARN | Ambion (life technologies) | AM7000 | |
| Roti-Aqua-P/C/I | Carl Roth | X985.3 | Alternativa: " Ácido-fenol: cloroformo, pH 4.5 (con IAA, 125:24:1)" de Ambion (AM9720) |
| SUPERase• En el kit | Ambion (tecnologías de vida) | AM2696 | |
| Thermo Sequenase con fluorescencia con 7-deaza-dGTP | GE Healthcare | RPN2538 | |
| TRIzol | reactivo life technologies | 15596-026 | |
| Zirconia/Perlas de sílice 0,1 mm | BioSpec | 11079101z |
Referencias
- Simpson, C. G., Brown, J. W. Primer extension assay. Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).
- Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K.
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Reimpresiones y permisos
