Artículo de método

Un híbrido método de extracción de ADN para la Evaluación de las comunidades bacterianas cualitativa y cuantitativa de Aves de Corral en muestras de producción

DOI:

10.3791/52161

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10 de diciembre de 2014

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1Egg Safety and Quality Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 2Poultry Microbiological Safety and Processing Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 3Department of Biochemistry and Biophysics, Oregon State University, 4College of Public Health, University of Georgia, 5Department of Biological Sciences, Center for Microbial Genetics and Genomics, Northern Arizona University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se desarrolló un novedoso método semiautomatizado de extracción de ADN híbrido para su uso con muestras de producción avícola ambiental y demostró mejoras sobre un método de extracción mecánico y enzimático común en términos de las estimaciones cuantitativas y cualitativas de las comunidades bacterianas totales.

Resumen

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La eficacia de los protocolos de extracción de ADN puede ser altamente dependiente de tanto el tipo de muestra que se está investigado y los tipos de análisis realizados aguas abajo. Teniendo en cuenta que el uso de nuevas técnicas de análisis de la comunidad bacteriana (por ejemplo, microbiomics, metagenómica) es cada vez más frecuente en las ciencias agrícolas y medioambientales y muchas muestras ambientales dentro de estas disciplinas puede ser physiochemically y microbiológicamente único (por ejemplo, muestras fecales y basura / ropa de cama de el espectro de la producción de aves de corral), los métodos de extracción de ADN apropiadas y eficaces deben ser elegidos cuidadosamente. Por lo tanto, un método de extracción de ADN híbrido automatizado semi-novela fue desarrollado específicamente para su uso con muestras de producción de aves de corral del medio ambiente. Este método es una combinación de los dos tipos principales de extracción de ADN: mecánica y enzimática. Una intensa etapa de homogeneización mecánica de dos pasos (utilizando perlas paliza específicamente formulado para ambienmuestras TAL) se añadió al principio del método de extracción de ADN enzimática "patrón oro" para muestras fecales para mejorar la eliminación de bacterias y el ADN de la matriz de la muestra y mejorar la recuperación de miembros de la comunidad bacterianas Gram-positivos. Una vez que se inició la parte de extracción enzimática del método híbrido, el proceso de purificación restante se automatizó usando una estación de trabajo robótica para aumentar el rendimiento y disminuir el error de muestra procesamiento de la muestra. En comparación con los métodos de extracción de ADN mecánicos y enzimáticos estrictas, este método híbrido novela proporciona el mejor rendimiento general combinado al considerar cuantitativa (qPCR utilizando 16S rRNA) y cualitativa (utilizando microbiomics) las estimaciones de las comunidades de bacterias totales en el tratamiento de las heces de aves de corral y las muestras de cama .

Introducción

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Al analizar muestras clínicas o ambientales complejas (por ejemplo, heces, suelos), se utilizan dos metodologías principales para la extracción de ADN. La primera es una disrupción mecánica de la matriz mediante un intenso paso de batido de perlas, mientras que la segunda es una disrupción enzimática de la matriz para liberar químicamente las células bacterianas e inhibir los inhibidores de PCR de la matriz simultáneamente. Teniendo en cuenta los diferentes medios por los que funcionan estos dos tipos de métodos de extracción, no es sorprendente que estudios anteriores hayan demostrado que el método de extracción de ADN adecuado depende en gran medida de la muestra y del análisis. Los estudios comparativos de extracción de ADN mostraron previamente que algunos métodos son más apropiados para mejorar la calidad y cantidad de ADN de muestras ambientales1-3, mientras que otros demostraron mejoras para los análisis a nivel de comunidad, como la electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE)4-6, el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal (T-RFLP)7, el análisis automatizado de espaciadores intergénicos ribosómicos (ARISA)8 y los microarrays filogenéticos9. Por lo tanto, es necesario utilizar o desarrollar métodos de extracción de ADN apropiados de acuerdo con los tipos de muestras ambientales y los tipos de análisis que se realizan en esas muestras, especialmente dados los avances recientes en los análisis de la comunidad bacteriana.

La secuenciación de próxima generación, junto con evaluaciones comunitarias más cuantitativas (por ejemplo, PCR cuantitativa (qPCR)), se está volviendo más frecuente en las ciencias ambientales y clínicas, sin embargo, se han realizado muy pocas investigaciones para determinar el efecto de los métodos de extracción de ADN en estos conjuntos de datos. La mayoría de los estudios comparativos de extracción de ADN se centraron en estimaciones de la comunidad microbiómica a partir de muestras humanas o de modelos humanos10,11, no de muestras de animales agrícolas. Los pocos estudios de secuenciación de próxima generación centrados en las aves de corral se ocuparon de cuestiones metagenómicas12,13 o microbiómicas14 específicas; no discutieron el efecto del método de extracción de ADN en los análisis microbiómicos resultantes. Teniendo en cuenta la naturaleza compleja de las muestras ambientales relacionadas con la producción avícola (por ejemplo, heces, cama/cama, tierra de pastos), los métodos de extracción de ADN deben seleccionarse cuidadosamente. Se sabe que las muestras ambientales relacionadas con las aves de corral contienen un gran número de inhibidores de la PCR y se han requerido diluciones de extracto de ADN de hasta 500 veces para la PCR y el análisis posterior15-17. Por lo tanto, es esencial que los métodos de extracción de ADN se optimicen para este tipo de muestras no solo con el fin de interrumpir físicamente la matriz, sino también para poder reducir/eliminar la gran cantidad de inhibidores que están presentes.

El QIAamp DNA Stool Mini Kit, un método de extracción enzimática, ha sido considerado el "estándar de oro" al extraer ADN de muestras intestinales/fecales difíciles1,18,19 y se ha aplicado con éxito a muestras ambientales de aves de corral8,14. La eliminación enzimática de los inhibidores de PCR mediante el uso de una matriz patentada es una de las mayores ventajas de utilizar este método para este tipo de muestras ambientales, al igual que la capacidad de mejorar significativamente el rendimiento (y reducir el error de procesamiento de muestras) utilizando estaciones de trabajo automatizadas. Una desventaja importante es la falta de un paso de homogeneización mecánica para disociar físicamente las células bacterianas de la matriz ambiental. Al analizar muestras intestinales y fecales de origen no avícola, la adición de un paso de batido de cuentas o de disrupción mecánica dentro de un protocolo de extracción de ADN aumentó significativamente la eficiencia de la extracción9, el rendimiento/calidad del ADN1,4,5 y mejoró significativamente los análisis de la comunidad posterior en términos de riqueza, diversidad y cobertura5,6,11. Estos estudios compararon no solo los métodos mecánicos de batido de cuentas con el método enzimático "estándar de oro", sino que algunos también agregaron el paso mecánico de batido de cuentas al protocolo enzimático para mejorar los resultados6,9,11.

De acuerdo con los resultados de los estudios anteriores, los análisis de la comunidad bacteriana (tanto cualitativos como cuantitativos) podrían mejorarse a partir de muestras ambientales relacionadas con las aves de corral mediante la adición de un paso de homogeneización mecánica al método enzimático. Por lo tanto, el objetivo de este estudio era doble: (1) desarrollar una nueva técnica de extracción de ADN que utilizara los aspectos más deseables de los métodos de extracción mecánicos (potente paso de homogeneización) y enzimáticos (eliminación de inhibidores de PCR y automatización) y (2) comparar las evaluaciones cuantitativas (a través de qPCR) y cualitativas (a través de microbiómica) de la comunidad bacteriana de este nuevo método con métodos mecánicos y enzimáticos representativos.

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Protocolo

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1. La homogeneización mecánica de Aves de Corral Ambiental muestras de producción

  1. Antes de la extracción, establezca un baño de agua a 95 ° C y permitir que el tiempo de baño de agua para llegar a esa temperatura.
  2. Pesar 0,33 g de suelo o material fecal en un tubo de 2 ml de lisado Matrix E.
    1. No exceda de 0,33 g de la muestra en el tubo, ya que esto hará que las siguientes soluciones para superar la capacidad del tubo.
    2. Descongele las muestras a temperatura ambiente antes de pesar.
    3. Con el fin de analizar un total de 1 g de suelo / heces, pésese 3 replicar 0,33 g de muestras para cada muestra ambiental individual.
    4. Almacene las muestras a -20 ° C dentro de los tubos cónicos de matriz antes de la extracción, si es necesario.
  3. Añadir 825 l de sodio tampón fosfato y 275 l de solución de PLS a un tubo de muestra. Mezclar utilizando un vórtex durante ~ 15 segundos y centrifugar las muestras a 14.000 xg durante 5 min.
  4. Decantar el supernatante y añadir 700 l de Buffer ASL. Mezclar utilizando un vórtex durante 5 seg.
    1. Asegúrese de que haya espacio de cabeza (~ 10% del volumen total) disponible en el tubo cónico en este punto. Si no hay espacio de cabeza, los tubos tendrán una tendencia a tener fugas durante la siguiente etapa de homogeneización que podría conducir a la contaminación cruzada y / o la pérdida de muestra.
  5. Colocar las muestras en un FastPrep 24 Instrumento, y homogeneizar las muestras a una velocidad de 6,0 m / s durante 40 s.
  6. Centrifugar la muestra homogeneizada a 14.000 xg durante 5 min. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 2 ml estéril.
  7. Para maximizar la recuperación de ADN de la muestra, repita los pasos 1.4 a 1.6, combinando los sobrenadantes en el mismo tubo de microcentrífuga estéril, 2 ml.

2. Inhibición enzimática de los inhibidores de homogeneizados de ejemplo

NOTA: Este protocolo utiliza el kit QIAamp ADN en heces Mini.

  1. Incubar lasobrenadante en un 95 ° C baño de agua durante 5 min para maximizar la recuperación de ADN de las células restantes en el sobrenadante.
    1. Incubar a 70 ° C para muestras que contienen organismos sobre todo Gram-negativos. Sin embargo, si los organismos Gram-positivos están presentes (que es el caso de las muestras de heces de aves de corral), se incuba a 95 ° C.
    2. Utilice clips de plástico de bloqueo en los tubos de microcentrífuga para asegurar que los tubos no se "pop" abierta y potencialmente perder volumen de la muestra como la presión puede acumularse en estos tubos de microcentrífuga sellados.
  2. Abra cada tubo de microcentrífuga para liberar los, re-capitalización de los tubos de microcentrífuga de presión y mezcle utilizando un vortex durante 15 segundos.
  3. Centrifugar la muestra a 14.000 xg durante 1 minuto, retirar 1,2 ml del sobrenadante y colocarlo en un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml estéril.
  4. Añadir 1 ficha Inhibitex a cada muestra y mezclar utilizando un vórtice hasta que la muestra se convierte en un / líquido blanquecino uniforme blanco.
    1. Evite touching la pestaña Inhibitex mientras se coloca en el tubo de microcentrífuga que contiene la muestra. Para lograr esto, coloque el paquete de ampolla que contiene la ficha directamente sobre el tubo de microcentrífuga abierta y empuje suavemente la lengüeta del blister y en el tubo de microcentrífuga.
  5. Incubar la muestra durante 1 min a TA (~ 25 ° C) y se centrifuga a 14.000 xg durante 5 min.
  6. Transferir todo el líquido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril y se centrifuga a 14.000 xg durante 5 min.
    1. Evitar cualquier partículas restantes que pueden haber sedimentadas en el fondo del tubo de microcentrífuga al final de la etapa 2.5 cuando se transfiere el líquido.

3. Automated DNA Purification Uso de la estación de trabajo robótica QIAcube

NOTA: El número de consumibles de plástico, la disposición de los adaptadores de rotor de muestra dentro de la centrífuga, y los volúmenes requeridos de los tampones / soluciones dependen de la numero de muestras que están en ejecución.

  1. Añadir tubos de elución y tubos de filtro a las ranuras correspondientes dentro de los adaptadores de rotor. Para cada muestra, añadir 400 l de la ranura central del adaptador de rotor. Coloque los adaptadores del rotor de la centrífuga estación de trabajo en la disposición correcta de acuerdo con el número de muestras que se purificó.
    1. Asegúrese de que todas las tapas del tubo de microcentrífuga se fijan correctamente en el adaptador de rotor desde una de no hacerlo podría resultar en la esquila durante una de las etapas de centrifugación del protocolo de purificación.
  2. Añadir el número requerido de 1.000 ly 200 l de filtro consejos para la estación de trabajo, y rellenar las botellas de amortiguamiento suministrados con el volumen requerido de tampones.
    NOTA: Los tampones necesarios para este protocolo de purificación (AL, AW1, AW2, y AE) están contenidos en el kit QIAamp DNA Mini heces. El usuario necesita para suministrar el 100% de etanol que se necesita para el bu AWfertas y como una solución utilizada en el proceso de purificación.
  3. Añadir el volumen requerido de la solución de proteinasa K suministrado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril y colocarlo en la ranura A en la estación de trabajo. Además, añadir el número requerido (igual al número de muestras que se purificada) de 2 ml de seguridad de bloqueo de tubos de muestra de microcentrífuga de RB a la sección de agitador de la estación de trabajo.
    1. Asegúrese de que las tapas de los tubos de muestra se colocan de forma segura en las ranuras correspondientes en la estación de trabajo, ya que una no hacerlo resultará en un error cuando el equipo escanea inicialmente la estación de trabajo para asegurarse de que todos los plásticos y líquidos necesarios están disponibles para el pedido correr.
  4. El uso de la pantalla táctil en la estación de trabajo, seleccione el ADN de las heces - Taburete Humano - Protocolo de detección de patógenos, y leer a través de las pantallas siguientes para asegurarse de que la estación de trabajo se ha cargado correctamente. Una vez que todas las pantallas de verificación se pasan, seleccione Inicio para ejecutar este protocolo.
    1. Si la extracción de ADN de más de 12 muestras, iniciar el proceso de homogeneización (Paso 1) para el siguiente conjunto de muestras, ya que una racha de 12 muestras de toma ~ 72 min para completar en la estación de trabajo.
  5. Retire las muestras de los adaptadores de rotor, la tapa, y el lugar a -20 ° C hasta que sea necesario para los análisis posteriores posteriores.
    1. En este punto, combinar los 3 purificaciones repetidas para una muestra individual (un total analizado cantidad = 1 g) usando un sistema de centrifugación / basado en la evaporación. Combinar las repeticiones y re-eluyen a un volumen final de 100 l de tampón Tris-EDTA.

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Resultados

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Para este estudio, los excrementos fecales frescas y muestras de cama se recuperaron de una casa comercial de pollos de engorde (~ 25.000 aves) en el sureste de Estados Unidos. Los pollos (Gallus gallus) fueron Cobb-500 cruza, y eran 59 días de edad en el momento del muestreo. Muestras fecales y basura frescas se recuperaron de cuatro áreas distintas dentro de la casa (cerca de la almohadilla de refrigeración, cerca de las líneas de bebedero / alimentadoras, entre las líneas de bebedero / alimentadoras, y cerca...

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Discusión

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El método de extracción de ADN utilizado efectuarse las estimaciones totales de la comunidad bacteriana cuantitativos y cualitativos, tanto para las muestras fecales y basura, el apoyo a la muestra analiza la naturaleza depende de los métodos de extracción de ADN visto previamente 1,3,6. Tanto para las muestras fecales y basura, el orden de actuación de los métodos de extracción de ADN fue diferente para la cuantitativa (mecánica> Híbrido> enzimática) y el cualitativo (Enzimática> Híbrido> Mecánic...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer a Latoya Wiggins y Katelyn Griffin por su ayuda en la adquisición de muestras, así como a Laura Lee Rutherford por su ayuda en el muestreo y los análisis moleculares. También nos gustaría agradecer a Sarah Owens del Laboratorio Nacional Argonne por la preparación y secuenciación de muestras microbianas. Estas investigaciones fueron apoyadas igualmente por el Servicio de Investigación Agrícola, los proyectos CRIS del USDA "Reducción de patógenos y parámetros de procesamiento en sistemas de procesamiento de aves de corral" # 6612-41420-017-00 y "Enfoques moleculares para la caracterización de patógenos transmitidos por alimentos en aves de corral" # 6612-32000-059-00.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Lysing Matrix E tuboMPBio6914-050Diferentes tamaños disponibles y los últimos 3 números del gato. No. indicar el tamaño (-050 = 50 tubos, -200 = 200 tubos, -1000 = 1.000 tubos)
Solución de fosfato de sodioMPBio6570-205Se puede comprar individualmente o también se puede incluir en el kit de centrifugado FastDNA para heces (Cat. Nº 116570200)
PLS BufferMPBio6570-201
Tampón ASL (560 ml)Qiagen19082
Homogeneizador FastPrep 24MPBio11600450048 x 2 ml Adaptador HiPrep (Cat. Nº 116002527) disponible para duplicar el rendimiento de la etapa de homogeneización mecánica
QIAamp DNA Stool Mini KitQiagen51504
QIAcube24 (110V)Qiagen9001292 Los resultados preliminares muestran que QIAcube HT (Cat. No. 9001793) se puede utilizar para mejorar el rendimiento, pero se requieren diferentes consumibles de esta máquina y se debe realizar más trabajo comparativo.
Puntas de filtro, 1.000 ml (1024)Qiagen990352
Puntas de filtro, 200 ml (1024)Qiagen990332
QIAcubo Adaptadores de rotor (10 x 24)Qiagen990394Para los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml incluidos en el kit adaptador de rotor, existe una alternativa.  Se trata de Sarstedt Micro tubo 1,5 ml Tapón de seguridad, Cat. Nº 72.690
Tubos de muestra RB (2 ml)Qiagen990381Alternativa: Tubo de ensayo Eppendorf Safe-Lok micro, n.º de cat. No. 022363352

Referencias

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