Microscopía de Fuerza Atómica de Red-Light fotorreceptores a través de cartografía PeakForce cuantitativa nanomecánico Propiedad

Resumen

En este artículo se describe un método para investigar la estructura de un fotorreceptor de proteína utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). El mapeo de propiedades nanomecánicas cuantitativas de PeakForce (PF-QNM) revela dímeros de proteínas intactos en una superficie de mica.

Resumen

Microscopía de fuerza atómica (AFM) utiliza una punta piramidal unida a un voladizo para investigar la respuesta de la fuerza de una superficie. Las deflexiones de la punta se pueden medir a ~ 10 pN por un láser y un detector sectorizado, que puede ser convertido a la imagen topografía. La modulación de amplitud o AFM "modo de tocar" implica la sonda de toma de contacto intermitente con la superficie mientras oscilante a su frecuencia resonante para producir una imagen. Utilizado conjuntamente con una célula de fluido, de modo tapping AFM permite la obtención de imágenes de macromoléculas biológicas tales como proteínas en condiciones fisiológicamente pertinentes. -Modo de tocar AFM necesita un ajuste manual de la sonda y ajustes frecuentes de una multitud de parámetros de análisis que puede ser un reto para los usuarios sin experiencia. Para obtener imágenes de alta calidad, estos ajustes son los que más tiempo consume.

PeakForce cuantitativa nanomecánico Asignación de propiedades (PF-QNM) produce una imagen mediante la medición de una respon vigorSE curva para cada punto de contacto con la muestra. Con el software ScanAsyst, PF-QNM se puede automatizar. Este software ajusta el punto de ajuste, frecuencia de accionamiento, velocidad de barrido, las ganancias, y otros parámetros importantes de escaneado automáticamente para una muestra dada. No sólo este proceso de proteger ambas sondas frágiles y muestras, se reduce significativamente el tiempo requerido para obtener imágenes de alta resolución. PF-QNM es compatible para el AFM de imágenes en el líquido; por lo tanto, tiene una amplia aplicación para obtener imágenes de materiales biológicamente relevantes.

El método presentado en este trabajo se describe la aplicación de PF-QNM para obtener imágenes de una bacteriana fotorreceptor de luz roja, RpBphP3 (P3), a partir de la fotosíntesis R. palustris en su estado de luz adaptado. Usando este método, los dímeros de proteínas individuales de P3 y agregados de dímeros se han observado en una superficie de mica en presencia de un tampón de formación de imágenes. Con los ajustes apropiados a la superficie y / o concentración de la solución, este métodopuede aplicarse en general a otras macromoléculas biológicamente relevantes y materiales blandos.

Introducción

Microscopía de fuerza atómica (AFM) se ha convertido en una herramienta muy importante para la investigación de las propiedades estructurales y mecánicas de superficies, películas delgadas, y las moléculas individuales desde su invención en 1986 (Figura 1). ^1-3 Uso de una célula líquido, el método tiene llegado a ser particularmente útil en los estudios de macromoléculas biológicas y células incluso que viven en un ambiente fisiológicamente relevante. ^4-10 Tapping-mode AFM se ha utilizado tradicionalmente para obtener imágenes de materiales blandos o moléculas unidas débilmente a la superficie, ya que el modo de contacto-AFM es ....

Protocolo

1. Informática y Microscopio Set Up

1. Abra la válvula del cilindro N ₂ y ajustar las perillas para asegurar la mesa de aire está flotando y el nivel.
2. Encienda el ordenador, el controlador y la luz de fibra óptica en este orden.
3. Ajuste el escáner al modo / LFM AFM y centrar la cámara en la cabeza AFM.
4. Software de código abierto. Seleccione categoría experimento "Propiedades nanomecánicos", "Quantitative nanomecánico Mapping" en el grupo experimento, y "PeakForce QNM en Fluid" bajo experimento. Haga clic en Experimento de carga y luego Configuración.
5. Enfoque la cámara con el objetivo Z para ver la superficie d....

Resultados

Imágenes de AFM representativos de una proteína de fotorreceptores, P3, en su estado de luz adaptado se presentan en las Figuras 3 y 4. Un sustrato de mica recién escindido (Figura 3A) es una superficie adecuada, plana para la adsorción de proteínas. El cobro de una imagen de mica limpio como un control negativo es importante por varias razones. En primer lugar, asegura la célula líquido se limpia y sin materiales residuales de los experimentos anteriores se contamine l.......

Discusión

AFM es un método de microscopía de sonda de barrido completamente capaz de visualizar las proteínas y otras macromoléculas biológicas en condiciones fisiológicamente pertinentes. En comparación con la cristalografía de rayos X y RMN, una limitación de AFM es su incapacidad para lograr la misma resolución, en particular la resolución lateral. Cuando se utiliza AFM para analizar una molécula en cualquier superficie, el impacto de la superficie y la sonda en la imagen de la molécula también deben ser considerados cuando se.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tris-HCl	Fisher Scientific	O4997-100
NaCl	Acros Organics	7647-14-5
MgCl2	Acros Organics	7791-18-6
Multimodo 8 AFM	Bruker-Nano	492-008-011	equipado con controlador Nanoscope V y escáner J
Sonda	Bruker-Nano	SNL-10, ScanAsyst-Fluid+
Modo de roscado Célula fluida	Bruker-Nano	MTFML
Mica V-4 Grado	SPI suministros	1150503	25 x 25 x .26 mm
Disco de soporte de muestra	nanoSurf	BT02236
Placa de Petri	Plasta-Medic, Inc.		100 mm x 15 mm
micropipetas	Denville Scientific	XL 3000i
RpBphP3			Preparados según las referencias citadas
Software de nanoscopio	Bruker-Nano
Fiber Optic Light	Digital Instruments Inc.	F0-50
Pinza de disco Pelco AFM	Ted Pella Inc	1668	Jeringa de 12 mm
1 ml	McKesson	102-ST1C
Tubos Eppendorf Denville	Scientific	C2171
El sistema gráfico molecular Pymol v.1.5.0.1	Schrödinger, LLC