Aquí describimos un ensayo simple para la cuantificación de la respuesta alimentaria en hidra inducida por la forma reducida de glutatión. Este ensayo se basa en medir la distancia entre el extremo apical del tentáculo y la boca de la hidra.
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Artículo de método
Medición inducida glutatión-Alimentación Respuesta en Hydra
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Resumen
Resumen
Hydra es uno de los organismos más primitivos que posee un sistema nervioso y quimiosensación para detectar glutatión reducido (GSH) para capturar a la presa. El movimiento de los organismos presa provoca la descarga mecanosensorial de las células urticantes llamadas nematocistos de la hidra, que se insertan en la presa. La respuesta alimentaria en la hidra, que incluye el enroscamiento de los tentáculos para llevar a la presa hacia la boca, la apertura de la boca y el consiguiente engullimiento de la presa, se desencadena por el GSH presente en el líquido liberado por la presa herida. Para poder identificar el mecanismo molecular de la respuesta alimentaria en hidra, que se desconoce hasta la fecha, es necesario establecer un ensayo para medir la respuesta alimentaria. Aquí, describimos un método simple para la cuantificación de la respuesta de alimentación en el que se mide la distancia entre el extremo apical del tentáculo y la boca de la hidra y se determina la relación de dicha distancia antes y después de la adición de GSH. Se encontró que la proporción, llamada dispersión relativa de los tentáculos, proporciona una medida de la respuesta a la alimentación. Este ensayo se validó utilizando un modelo de inanición en el que la hidra hambrienta muestra una mejor respuesta alimentaria en comparación con la hidra alimentada diariamente.
Introducción
Hydra es el organismo más primitivo que posee un sistema nervioso y quimiosensación para detectar glutatión reducido (GSH) para capturar a la presa1. Se alimenta de una variedad de animales como nematodos, crustáceos, larvas de insectos, renacuajosy peces recién nacidos. El movimiento de estos organismos presa provoca la descarga mecanosensorial de las cápsulas urticantes llamadas nematocistos de la hidra, que se insertan en la presa2. El GSH presente en el líquido liberado por la presa herida activa posteriormente la respuesta de alimentación en la hidra, que incluye el enroscamiento de los tentáculos para acercar a la presa a la boca, la apertura de la boca y el consiguiente engullimiento de la presa. Se ha demostrado que múltiples moléculas, como la dopamina3, el glutamato4, el GABA, la glicina5, los receptores NMDA6 y la alatotropina7, están involucradas en la respuesta alimentaria de la hidra. También se ha demostrado que la respuesta quimiosensorial inducida por el GSH está modulada por el estado de alimentación del animal, de modo que la hidra hambrienta exhibió una respuesta alimentaria mejorada1. Este aumento en la sensibilidad al GSH es biológicamente relevante, ya que bajo inanición, la hidra necesita encontrar a su presa con una sensibilidad más alta.
Aunque la respuesta alimentaria inducida por GSH se puede observar claramente bajo el microscopio, los métodos típicamente utilizados para medir las observaciones de la respuesta alimentaria no son cuantitativos. En la mayoría de los casos, el tiempo durante el cual la boca de la hidra permanece abierta se tomó como medida de la respuesta alimenticia8,9; mientras que en otro caso, la cuantificación se basó en el número de hidras de una población que mostraban la respuesta alimentaria10. Sin embargo, observar el tiempo de apertura de la boca de los pólipos de hidra es engorroso y está sujeto a variaciones inducidas por parámetros incontrolables como la dirección de la orientación de la boca durante las observaciones. Del mismo modo, dado que la respuesta alimentaria es un parámetro cuantitativo, los enfoques basados en la población están sujetos a variaciones/errores causados por la opinión o el sesgo observacional del observador individual. Para evitar estos problemas, hemos desarrollado un método para la cuantificación relativa de la respuesta alimentaria en hidra (Hydra vulgaris Ind-Pune11) basado en la distancia del extremo apical del tentáculo desde la boca del pólipo de hidra.
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Protocolo
1. Hydra Cultura y medición de la respuesta de alimentación
- Mantener pólipos Hydra en cultivo mediante la alimentación diariamente con artemia y mantenerlos en un medio (mM de tampón Tris-HCl 1, pH 7,6, NaCl 1 mM, 1 mM CaCl 2, 0,1 mM KCl, y 0,1 mM MgSO 4) contenida en una tazón de vidrio a 18 ° C por debajo de 12 hr hr luz-12 ciclos oscuros como se describe anteriormente 12.
- Para la medición de la respuesta de alimentación, transferir uno maduro pólipo hidra que tiene de 5 a 6 tentáculos a un solo pocillo de una placa de 24 pocillos. Retire el medio residual del bien por la inclinación, y luego añadir inmediatamente 500 l de medio fresco.
- Prepare la solución de glutatión 9 M en medio hidra. Dado que la solución de glutatión es propenso a la oxidación, siempre utilizar la solución de glutatión recién preparado para cada experimento.
- Transferencia de la placa a la plataforma de imágenes de un microscopio que tiene disposiciones para la grabación de imágenes. Utilice un fondo oscuro de manera que el comportamiento of pólipo hidra puede ser claramente fotografiado contra el fondo de contraste.
- La sala utilizada para observar y obtener imágenes del comportamiento de hidra libre de las luces de intensidades fluctuantes, las corrientes de aire y el ruido. Tales perturbaciones también podrían causar el pólipo hidra para mostrar la contracción de los tentáculos - incluso en ausencia de glutatión.
- Deje que el pólipo se relaje durante 5 min.
- Asegúrese de que el pólipo se encuentra a lo largo de la región central del pozo de manera que el comportamiento se pueden obtener imágenes con claridad. Si el pólipo está en el borde del pozo, llevarlo al centro de lavado del medio utilizando una pipeta y otra vez permitir que se relaje.
- Captura de una imagen de la hidra en el estado relajado. Este será el punto de observación en tiempo cero.
- Añadir rápidamente 9 M solución de glutatión para llegar a una concentración final de 3 mM en el pozo. Dependiendo de la finalidad del experimento y la respuesta mostrada por hydra, ensayar una serie de diferentes concentraciones de glutatión y ChooSE La concentración apropiada requerida.
- Inicie el temporizador inmediatamente después de añadir la solución de glutatión y capturar imágenes después de cada 15-30 segundos durante 4-5 min. No cambie la configuración de ampliación durante el time-lapse.
- Añadir la solución de glutatión suavemente y con flujo uniforme de tal manera que la posición del animal en el pozo se vería perturbado mínimamente en el campo de visión del microscopio. Sin embargo, si el pólipo se mueve ampliamente después de la adición de solución de glutatión, mover muy suavemente la placa para llevar el pólipo en el campo de visión para la captura de imagen.
- En el experimento de control, utilice medio que carece de glutatión, manteniendo todos los demás parámetros idénticos.
- Asegúrese de realizar todos los pasos experimentales anteriores durante la primera mitad del día - antes de 13:00 para evitar el posible efecto del ritmo circadiano de la magnitud de respuesta de alimentación.
- Abra cada una de las imágenes capturadas utilizando el GNU Image Manipulation Program (GIMP). Utilice la herramienta de "Medida" disponible en Menú> Herramientas> Medir para determinar la distancia entre el extremo apical de cada uno de los tentáculos y hipostoma. Si se observa la abertura de boca en cualquiera de las imágenes, determinar la distancia entre el centro de la boca abierta y el extremo apical de la tentáculo. Consulte esta distancia como la propagación tentáculo.
- Calcular el diferencial medio tentáculo para cada pólipo antes y después de la exposición glutatión. Calcular la relación de promedio propagación tentáculo en el punto de tiempo cero para que en cada uno de los puntos de tiempo posteriores. Esta relación se denomina propagación tentáculo relativa.
- Repetir las mediciones para al menos 20 pólipos.
2. Método de validación mediante elEl hambre Modelo
- Para el hambre, transferir unos pólipos hidra a un recipiente de vidrio separada y no darles de comer durante 5 días. Pase el grupo de control de unos pólipos diario con artemia en un recipiente de tamaño similar. Cambie el medio de copas de ambos experimental diaria para evitar el crecimiento de hongos en el medio.
- En el día del experimento, alimentar al grupo de control de hidra con artemia durante 1 hora y utilizar estos hidra para los experimentos posteriores después de la eliminación de todos artemia sin comer y muertos desde el medio.
- Medir la respuesta de alimentación de la hidra de hambre en comparación con la hidra de grupo de control por el método descrito anteriormente en el paso 1. Para evitar cualquier sesgo debido a momento de la observación, alternar las mediciones de cada uno de los hambrientos y controlar pólipos hidra.
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Resultados
El glutatión provoca hydra exponer rizado de los tentáculos hacia la boca con el propósito de que envuelve la presa. Tal rizado de tentáculos trae extremos apicales de los tentáculos más cerca de la hipostoma. Esto resulta en la reducción de la propagación tentáculo, o la distancia lineal entre el extremo apical del tentáculo y hipostoma (Figura 1). La propagación tentáculo relativa, o la relación de tentáculo promedio propagan antes y después de la adición de glutatión, promediados a través de múltiple...
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Discusión
La alimentación en el comportamiento hidra representa uno de los sistemas quimiosensoriales más ancestrales en los metazoos. Aunque la presencia de GSH en el fluido crustáceo en libertad después de la captura de presas nematocisto asistida se detectó hace mucho tiempo 1, ni la proteína GSHR ni los genes de codificación putativo / s se han caracterizado desde hidra hasta la fecha. Pocos intentos se han realizado para caracterizar las proteínas de unión GSH en Hydra 8, 14, 15. Sin embargo, la identid...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores están agradecidos a K. P. Madhu, Nita Beliappa y al personal del Centro de Medios del Instituto Indio de Educación e Investigación Científica, Pune, por su ayuda en la producción del video. El trabajo contó con el apoyo financiero del programa del Centro de Excelencia del Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India para SG y una beca postdoctoral del Departamento de Ciencia y Tecnología del Gobierno de la India para RK.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Incubadora refrigerada | Panasonic | Microscopio MIR-254-PE | |
| Leica | S8AP0 | ||
| Cámara para el microscopio | Leica | EC3 | |
| Glutatión reducido | Sigma | G4251 | Almacenado a 4 °C. Lleve la botella a temperatura ambiente antes de abrirla para evitar la oxidación |
| Programa de edición de imágenes | GIMP | Versión 2.8 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
