La fabricación de sustratos de cultivo complejas utilizando robótica microcontacto impresión (R-μCP) y secuencial sustitución nucleófila

Resumen

Los sustratos de cultivo celular funcionalizados con patrones a microescala de ligandos biológicos tienen una inmensa utilidad en el campo de la ingeniería de tejidos. Aquí, demostramos la fabricación versátil y automatizada de sustratos de cultivo de tejidos con múltiples cepillos de poli(etilenglicol) micromodelados que presentan químicas ortogonales que permiten la inmovilización espacialmente precisa y específica del sitio de ligandos biológicos.

Resumen

En ingeniería de tejidos, es deseable exhibir un control espacial de la morfología del tejido y el destino celular en cultivo a escala de micras. Los sustratos de cultivo que presentan cepillos de poli(etilenglicol) (PEG) injertados se pueden utilizar para lograr esta tarea mediante la creación de regiones a microescala, sin incrustaciones y resistentes a la adhesión celular, así como regiones donde las células participan en interacciones bioespecíficas con ligandos anclados covalentemente. Para diseñar tejidos complejos utilizando tales sustratos, será necesario modelar secuencialmente múltiples cepillos de PEG funcionalizados para conferir bioactividades diferenciales y alineados en orientaciones a microescala que imitan nichos in vivo. La impresión por microcontacto (μCP) es una técnica versátil para modelar este tipo de pinceles de PEG injertados, pero la μCP manual no se puede realizar con precisión a microescala. Por lo tanto, combinamos la robótica avanzada con técnicas de litografía blanda y reacciones químicas de superficie emergentes para desarrollar un método asistido por impresión robótica por microcontacto (R-μCP) para fabricar sustratos de cultivo con patrones complejos, a microescala y altamente ordenados de cepillos PEG que presentan químicas ortogonales de "clic". Aquí, describimos en detalle el flujo de trabajo para fabricar dichos sustratos.

Introducción

La capacidad de las superficies injertados con PEG para mostrar ligandos bioquímicos covalentemente unidos, manteniendo al mismo tiempo inherentes propiedades no-fouling ellos una opción ideal para entornos de ingeniería de microescala personalizados sobre sustratos de cultivo ^1,2,3 hacer. Las interacciones bioespecíficas mediados por ligando conjugado de PEG cepillos permite el análisis reduccionista de los efectos de señales bioquímicas que se encuentran dentro del complejo en microambientes de tejido in vivo en fenotipos de células individuales. Además, las químicas "clic" bio-ortogonales se pueden utilizar para facilitar la inmoviliza....

Protocolo

1. Generación de Sellos elastoméricos

1. Para generar maestros de silicio de la estampillas PDMS, diseñar patrones de características de la fotomáscara el uso de software de diseño asistido por ordenador.
   1. Diseñar el primer patrón como una matriz de 20 x 20 de los anillos con 300 m de diámetro interior (ID) y 600 OD m con 1.200 m separación de centro a centro.
   2. Diseñar el segundo patrón como una matriz de 20 x 20 con anillos de 600 micras ID y OD 900 m con 1200 micras separación de centro a centro.
   3. Además, colocar 1 x 1 mm ² marcas de referencia cuadrados en las cuatro esquinas de cada gama de d....

Resultados

El uso de técnicas μCP alineación manuales para diseñar sustratos de cultivo con matrices de cepillos injertados con PEG funcionalizados con ortogonal "clic" químicas se ha demostrado en trabajos previos ^6. Sin embargo, esto ofrece un control mínimo de la orientación de patrón y, a menudo resulta en superposición de áreas funcionalizados. Aquí, un novedoso sistema R-μCP se utiliza para superar esta limitación, y su capacidad de precisión patrón de una matriz de PEG cepillo de anillos con 300 micras y 600 micr.......

Discusión

Sustratos ideales para la ingeniería de tejidos se recapitulan Bioinspirada y por lo tanto la distribución espacial de los ligandos bioactivos críticos que se encuentran dentro de los tejidos nativos. Ellos también poseer propiedades dinámicas que permiten ajustes temporales de los ligandos y los patrones espaciales en el que se presentan para permitir la morfogénesis de tejidos dirigida y espacialmente restringidas inducción de destino de la célula. La fabricación de este tipo de sustratos requiere la inmovilización de.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
SCARA	Epson	LS3-401ST	Los modelos de gama alta con mayor precisión están disponibles si lo desea.
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil)triclorosilano	Gelest	SIT8174.0	PRECAUCIÓN, Solo debe manipularse en una campana de gases químicos. Al silanizar obleas, nadie debe ingresar a la campana hasta que se haya evaporado todo el silano.
Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona	Ellsworth Adhesive Co	NC9020938	Desgasifica las soluciones mediante exposición al vacío antes de su uso. Los kits alternativos como el Kit 182 son aceptables.
24 mm x 50 mm #1 Portaobjetos de vidrio	Fisher Scientific	48393106	Estos se pueden comprar de varios proveedores con diferentes dimensiones para satisfacer sus necesidades.
CHA-600 Evaporador de haz de electrones Telemark	Telemark	SEC-600-RAP	Requiere formación especializada.
EPSON LS3 SCARA	EPSON	LS3-401ST
ω-mertcaptoundecyl bromoisobutirato	Prochimia	FT 015-m11-0.2	Almacenar a -20 °C. Se pueden utilizar otros iniciadores ATRP como este R-μ La plataforma CP es aplicable a todas las modalidades de micropatrones.
Frasco de tubo Schlenk 50 ml	Synthware	60003-078	Requiere tapones de goma con diafragma.
Poli(etilenglicol) metil éter metacrilato	Sigma Aldrich	447943	Enviado que contiene inhibidores léicos libres de MEHQ y BHT.
Metanol (Certificado ACS)	Fisher Scientific	A412-4	PRECAUCIÓN, solo mango en campana de gases químicos.
Bromuro de cobre (II)	Sigma Aldrich 437867		PRECAUCIÓN, limite la exposición con mascarilla quirúrgica.
2,2'-Bipiridina	Sigma Aldrich	D216305	PRECAUCIÓN, limite la exposición con mascarilla quirúrgica.
L-ascorbato de sodio	Sigma Aldrich	A4034
20 ml de borosilicato Vidrio Viales de centelleo	Fisher Scientific	03-340-4E
Azida de sodio	Sigma Aldrich	S2002	ATENCIÓN, limite la exposición con mascarilla quirúrgica.
N,N-dimetiformamida	Sigma Aldrich	227056	PRECAUCIÓN, solo manéjelo en la campana de gases químicos.
Etanolamina	Sigma Aldrich	398136	PRECAUCIÓN, solo se maneja en campana de gases químicos.
Trietilamina	Sigma Aldrich	T0886	PRECAUCIÓN, solo maneje en campana de gases químicos.
Dimetilsulfóxido Sigma	Aldrich	276855	PRECAUCIÓN, solo manéjelo en la campana de gases químicos.
Propargiramina	Sigma Aldrich	P50900	PRECAUCIÓN, solo mango en campana de gases químicos.
Etanol de 200 grados	Servicios de distribución de materiales de la Universidad de Wisconsin	2292	PRECAUCIÓN, solo manéjelo en la campana de gases químicos.
Azide-PEG3-Biotina	ClickChemistryTools	AZ104-100	Solubilizado en DMF
Sulfato de Cobre (II)	Sigma Aldrich	C1297	PRECAUCIÓN, limite la exposición con mascarilla quirúrgica.
Tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina (TBTA)	Sigma Aldrich	678937
L-ascórbico	Sigma Aldrich	A7506
Tampón de fosfato Suero salino	Invitrogen	14190144
Burro	Sigma Aldrich	D9663	artículos contaminados con suero de burro se consideran material biopeligroso y deben eliminarse en consecuencia. Varios otros compuestos ( por ejemplo, BSA) están disponibles y sirven para este propósito.
Placa de poliestireno de 12 pocillos	Thermo Scientifit - NUNC	07-200-81	Las placas se pueden comprar a varios proveedores con diferentes dimensiones.
DBCO-PEG4-Biotina	Clickchemistytools	A105P4-10	Solubilizado en DMF
Estreptavidina, Alexa Fluor 488 Conjugado	Life Technologies	S-11223	Solubilizado en PBS
Estreptavidina, Alexa Fluor 546 conjugado	Life Technologies	S-11225	Solubilizado en PBS
Nikon A1-R Microscopio Confocal	Nikon	Nikon Eclipse Ti, A1R	Un microscopio epifluorescente es suficiente para obtener imágenes de sustratos micropatrones funcionalizados.

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