Imagen basada en Citometría de Flujo Técnica para evaluar los cambios en función de los granulocitos In Vitro

Summary

Este método demuestra una técnica para evaluar la función de los granulocitos midiendo simultáneamente la fagocitosis de las bacterias y el estallido oxidativo. La citometría de flujo basada en imágenes permitió la identificación de tres subconjuntos distintos de granulocitos activados que diferían en su capacidad funcional relativa.

Abstract

Los granulocitos desempeñan un papel clave en la respuesta inmunitaria innata del cuerpo a las infecciones bacterianas y virales. Si bien existen métodos para medir la función de los granulocitos, en general estos son limitados en términos de la información que pueden proporcionar. Por ejemplo, la mayoría de los ensayos existentes simplemente proporcionan un porcentaje de cuántos granulocitos se activan después de una sola incubación de longitud fija. Para complicar las cosas, la mayoría de los ensayos se centran en un solo aspecto de la función debido a las limitaciones de la tecnología de detección. Este informe demuestra una técnica para la medición simultánea de la fagocitosis de granulocitos de bacterias y el estallido oxidativo. Al medir ambas funciones al mismo tiempo, se identificaron tres fenotipos únicos de granulocitos activados: 1) Baja Activación (fagocitosis mínima, sin estallido oxidativo), 2) Activación moderada (fagocitosis moderada, algo de estallido oxidativo, pero sin colocalización de los dos eventos funcionales), y 3) Alta Activación (alta fagocitosis, alto estallido oxidativo, colocalización de fagocitosis y estallido oxidativo). También se identificó una cuarta población constituida por granulocitos inactivados. Utilizando incubaciones de ensayo de 10, 20 y 40 min, se evaluó el efecto de la duración de la incubación del ensayo en la redistribución de los fenotipos de granulocitos activados. Se realizó una cuarta incubación en hielo como control. Mediante el uso de incubaciones en tiempo seriadas, el ensayo puede ser capaz de detectar cómo un tratamiento afecta espacialmente la función de los granulocitos. Todas las muestras se midieron utilizando un citómetro de flujo basado en imágenes equipado con una opción de imágenes cuantitativas (QI), muestreador automático y múltiples láseres (488, 642 y 785 nm).

Introduction

Los granulocitos representan un componente del sistema inmune innato del cuerpo, que proporciona la primera línea de defensa contra los antígenos invasores. Los métodos anteriores para evaluar la función de los granulocitos se centraron en la capacidad de fagocitosis o la explosión oxidativa usando métodos separados, por lo que es difícil determinar colectivamente cómo han cambiado los granulocitos ^1-4. Los avances en el campo de la citometría de flujo han dado lugar a la producción de instrumentos de laboratorio capaces de alta resolución, formación de imágenes multi-color de las celdas de una manera de alto rendimiento ^5. La capacidad de combinar formación de imágenes con el flujo tradicional representa citometría de un avance que proporciona la plataforma tecnológica necesaria para innovar dentro de citometría de flujo existente métodos y extraer nueva información sobre el sistema inmune.

Durante los últimos diez años, nuestro laboratorio, entre otros, se ha enfocado agudamente en el efecto de varios tratamientos Patte nutricional y de ejerciciorns sobre la función inmune innata ^6-9. El método se demuestra en este manuscrito tiene implicaciones prácticas en el campo de la inmunología clínica. El presente método aprovecha el poder de la imagen basada en la citometría de flujo para medir simultáneamente la fagocitosis de partículas bacterianas y explosión oxidativa. Con este enfoque, uno es capaz de separar los granulocitos activados mediante variables proporcionadas por la parte basada en imágenes de los análisis. Estos subgrupos fueron sólo identificable después de evaluar las imágenes celulares en los granulocitos individuales. Además tiempo de incubación de ensayo afectó a la transición entre los tres subconjuntos de activación ^10. Por lo tanto, es plausible que el uso de múltiples tiempos de incubación puede permitir a un método para examinar el cambio en la función de granulocitos después de un tratamiento experimental específico. El propósito de este manuscrito era demostrar un método de evaluación de función de los granulocitos mediante el uso de la imagen basada en citometría de flujo para medir simultáneamente la fagocitosis con oxidative estalló.

Protocol

NOTA: Todos los procedimientos de recogida de sangre que se describen en este método se realizaron de conformidad con la Declaración de Helsinki y aprobado por la UNT junta de revisión institucional (IRB) para los sujetos humanos. Todos los sujetos dieron su consentimiento por escrito para la recogida de sangre, que fue utilizado en el presente método para asegurar que eran aparentemente sanas, de peso corporal normal, y libre de la enfermedad.

1. Reactivo Fuente y Preparación

1. Uso CD66b-APC (clon # G10F5; DF = 1: 50) y CD45-APCeFluor780 (clon # 2D1; DF = 1: 50) para este ensayo.
   NOTA: Antes del estudio, los anticuerpos CD45 y CD66b se titularon para determinar la dilución óptima que claramente resueltos granulocitos (CD45 + / + 66b) de otros leucocitos (CD45 + / 66b-) ^11. Después de la adición del anticuerpo diluido para la tinción de la dilución final en el tubo era de 875.
2. Compra y deshielo stock S. aureus biopartículas etiquetado con pHrodo tinte rojo. Suspender a una concentración de 1 mg de biopartículas por ml en PBS estéril. Biopartículas diluidas alícuotas y almacenar congeladas a -20 ° C hasta su uso en el ensayo.
3. Disolver dihydroethidium (DHE), que se convierte en bromuro de etidio fluorescente de la presencia de radicales libres de oxígeno (es decir, la explosión oxidativa), en DMSO a una concentración final de 10 g / ml.
4. Mezclar N-etilmaleimida (utilizado para evitar la fagocitosis adicional tras el ensayo de duración de incubación indicado) con PBS estéril en una dilución 2 paso de 200 mg / ml y 17,5 mg / ml, respectivamente. En el ensayo, utilizar una concentración final de 15 mM. Al descongelar N-etilmaleimida, use un bloque de calor a 37 ° C, como la N-etilmaleimida no permanece en solución.
5. Después de la etapa de fijación final, utilizar 7AAD para teñir el ADN nuclear. Antes de la adición, se diluye el 7AAD 1:10 con PBS estéril.

2. La sangre recogida de muestras

1. Pregunte sujetos a llegar al laboratorio después de una O / N rápido (> 8 horas) y abstentidesde la actividad física (> 12 h).
2. Después de limpiar la piel con una almohadilla con alcohol, inserte una aguja estéril de recolección de sangre en una vena periférica del brazo.
3. Recoger la sangre en tubos evacuados que se llenan comercialmente con heparina sódica.
4. Después de la recogida, aplique una venda adhesiva en el brazo del sujeto.
5. Invierta tubos de sangre para mezclar 10 veces y luego se coloca en un agitador hasta su análisis.

3. Ensayo de fagocitosis Técnica

1. Biopartículas Descongelar S. aureus (RT), DHE (RT), y N-etil-maleimida (37 ° C).
2. Añadir 20 l de biopartículas S. aureus a 4 individuales 1,2 ml tubos mientras se trabaja en la campana estéril.
3. Añadir 40 l de DHE a cada tubo que contiene las biopartículas.
4. Golpear suavemente los tubos sobre la superficie del banco para recoger los reactivos en el fondo del tubo.
5. Añadir 100 L de sangre entera mixta a cada tubo que ha sido llenado con biopartículas y DHE.
6. Limpie el borde interior de los tubos con un aplicador con punta de algodón para eliminar la sangre contaminante.
7. Mezclar la sangre y los reactivos con una pipeta electrónica programada para mezclar la sangre y reactivos para tres ciclos después de la adición de la sangre.
8. Coloque los tubos de ensayo en un cubo de hielo y la cubierta para protegerla de la luz.
9. Incubar los tubos de ensayo de 10, 20, y 40 min. Iniciar con el tubo 40-min para asegurar que todos los tubos de ensayo terminan al mismo tiempo.
10. Descongele la N-etilmaleimida en 37 ° C baño de grano.
11. Pipetear 15 L de N-etilmaleimida (descrito anteriormente en 1.4) en cada tubo de ensayo, se incuba durante 30 min.
12. Pipetear 10 L de CD66b-APC y 10 L de CD45-APCeFluor780 anticuerpos diluidas (descritos anteriormente en el punto 1.1), se incuba durante 60 min.
13. Pipetear 750 L de solución de lisis CMB fix / RBC en cada tubo de ensayo, se incuba durante 60 min.
14. Se centrifuga (10 min a 400 xg) tubos de ensayo para recoger el sedimento celular.
15. Vacío aspirar la solución de lisis WBC / RBC solución, dejando un fl residualvolumen uid (100 L) por encima del sedimento celular.
16. Pipetear 10 L de solución diluida 7AAD (descrito más arriba en 1.5) y 50 L de PBS en cada tubo de ensayo.
17. Añadir una gota de bolas de calibración (~ 25 L) a cada tubo de ensayo, colocar tapones en los tubos de ensayo, tubos de envoltura en papel de aluminio y colocar en un refrigerador.
18. Cargue el tubo de la muestra en el flujo basado en imágenes citómetro y recoger un mínimo de 3.000 eventos de granulocitos utilizando parámetros predefinidos: Automuestreador, azul (488 nm; 60 mW), rojo (640 nm, 100 NW), SSC (785 nm; 8,5 mW) láser (Figura 1).

Figura 1. Método y Plantilla de Adquisición. Las muestras fueron adquiridas en un flujo basado en imágenes citómetro (A). Durante la adquisición, gráficos de puntos de relación de aspecto brillante Campo vs. CD66b-APC se generaron a granulocitos separados de bolas de calibración de pinchos using INSPIRE v. 100.2.292.0 software (B). Un mínimo de 5.000 granulocitos fueron adquiridos para cada muestra utilizando un inyector automático, azul (488 nm; 60 mW), rojo (640 nm, 100 NW), SSC (785 nm; 8,5 mW) láser. Tenga en cuenta que una serie de histogramas están presentes durante la adquisición de los ajustes de monitor láser y otros aspectos de los datos coleccionar. Todos estos histogramas son opcionales y sólo es necesario si los procedimientos de operación estándar de laboratorio que requiere el control de calidad. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Muestra Adquisición y Análisis

1. Utilice el asistente de compensación software automatizado del software IDEAS aplicar una matriz de compensación a los archivos de imagen RAW (RIF) y crear archivos de compensar la imagen (CIF).
2. Cargar archivos CIF individuales en el software de IDEAS y generar las siguientes parcelas para identificar los subgrupos de granulocitos:
Establecer puertas iniciales para identificar las células que se consideraban en el enfoque mediante un histograma de brillantes RMS gradiente de campo (Figura 2A). Hacer esta determinación para cada muestra utilizando el control sin estimular como patrón de referencia.
3. Usar tramas secundarias a células singlete separados de los desechos y dobletes utilizando un gráfico de puntos de campo brillante relación de aspecto (relación de altura de las células frente a la anchura) vs. área de campo claro (Figura 2B). Hacer esta determinación para cada muestra utilizando el control sin estimular como patrón de referencia.
4. Una vez que se había identificado una población limpia de células, establecer un diagrama de puntos de CD45 vs. CD66b (Figura 2C) para identificar positivamente los granulocitos (CD45 + / + 66b). Crear una parcela hija (Figura 3) de intensidad detalle brillante para S. aureus (eje x) frente a la intensidad de detalle brillante para el estallido oxidativo (DHE, eje y) para identificar subconjuntos de granulocitos activados. Recoger brimágenes de campo ight en el canal 1 y 9, biopartículas en el canal 2, DHE en Channel 4, 7AAD en Canal 5, CD66b en el canal 11, y CD45 en el Canal 12.

Figura 2. Plantilla de análisis. Esta cifra la serie de parcelas que se generaron para identificar las células que estaban en el foco (A), las células individuales (B), granulocitos (C). Se utilizaron parcelas adicionales para identificar los tres subgrupos de granulocitos activados vs. granulocitos inactivos. Se completó Todos los análisis de archivos de imagen adquiridos utilizando software IDEAS v.6. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Results

El uso de la imagen basada en la citometría de flujo nos permitió separar una población homogénea de granulocitos activados en tres subgrupos diferentes de activación (Figura 3). En este método, la forma más eficaz para resolver los tres subconjuntos de activación es por el trazado de la intensidad detalle brillante para la fagocitosis (S. aureus) vs. estallido oxidativo (DHE) (Figura 3; Figura 4). También, el uso del asistente de co-localización en software IDEAS permitirá la cuantificación de la presencia simultánea de la fagocitosis y el estallido oxidativo, que es un signo distintivo de granulocitos altamente activados.

Figura 3. Identificación de activado subconjuntos de granulocitos. Después de la identificación de los granulocitos utilizando marcadores de la superficie celular (CD45 + / 66b +), una parcela hija se generó con brillante detalle intensidad de la fagocitosis vs. intensidad detalle brillante para el estallido oxidativo. Con este enfoque, el porcentaje de inactivos (púrpura), bajo activo (rojo, A), moderado-activo (azul, B) y (C) de color amarillo, granulocitos-altos activo se determinó. Esta técnica gating también se utilizó para evaluar el efecto del tiempo de incubación del ensayo sobre la abundancia relativa de los diversos subconjuntos de granulocitos activados. El mayor porcentaje de granulocitos "de alto activo" estaba presente después de la incubación de 40 min. Se completó Todos los análisis de archivos de imagen adquiridos utilizando software IDEAS v.6. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Además de demostrar la presencia de tres subconjuntos distintos de los granulocitos activados, se demostró que el tiempo de incubación del ensayo influyó en la abundancia relativa de cada subconjunto granulocitos activado. Específicamente, el 40 min incubation resultó en el mayor porcentaje de granulocitos "de alto activa". Mediante la inclusión de al menos tres duraciones de incubación de ensayo puede ser posible para determinar cómo un tratamiento clínico dado altera el estado de activación temporal de los granulocitos. Este es el primer método publicado usando la imagen basada en citometría de flujo para identificar diferentes subconjuntos de granulocitos activados como una función de las mediciones simultáneas de la fagocitosis y el estallido oxidativo.

Figura 4. Imágenes representativas de marcadores celulares. Una galería de imágenes de células clasificadas como de alta actividad (A), moderado-activo (B), y baja actividad (C) se presenta en esta figura. Biopartículas S. aureus son en CH03 , estallido oxidativo está en CH04, 7AAD para el núcleo está en CH05, dispersión lateral está en CH06, CD66b está enCh11, y CD45 es en Salida C12. Además, se muestra una imagen de combinación co-localizada de la fagocitosis (CH03) vs. explosión oxidativa (CH04). Las áreas de color amarillo en la imagen de combinación denotan que la fagocitosis y oxidativo ráfaga se están produciendo en el mismo espacio anatómico al mismo tiempo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El presente método representa un refinamiento de los métodos existentes para la evaluación de la función de los granulocitos mediante citometría de flujo ^1,3,4,12-14. Los pasos críticos de este ensayo tienden a estar relacionados con la mezcla apropiada de la muestra de sangre con las biopartículas y DHE. Una mezcla incompleta dará lugar a resultados inexactos. Mientras que la mezcla completa es crítica, el método de mezcla debe ser suave en la naturaleza. Se sugiere que el mezclado se lleva a cabo utilizando una pipeta electrónica con una función de mezcla en lugar de un mezclador de vórtice. Otro paso crítico en el ensayo es para asegurar siempre no hay sangre contaminar el medio superior del tubo de ensayo. Esta sangre residual se puede eliminar con un aplicador con punta de algodón estéril. La eliminación completa es importante porque de no hacerlo, puede contaminar la preparación de ensayo final con los glóbulos rojos no lisados.

Antes de utilizar este método de controles apropiados de compensación debe añadirse a controlar spectral solapamiento entre los reactivos utilizados para identificar los distintos aspectos de la función de los granulocitos. Para este método, los controles de compensación implican recoger muestras de sangre que se han sugerido la incubación de ensayo 40 min y después marcaje con un único marcador (es decir, E. coli, DHE, etc.). Después de etiquetado, eventos positivos individuales se recogen y una matriz de compensación se genera mediante un asistente automatizado en el software de análisis de IDEAS. Es crítico que si se utiliza este ensayo, controles de compensación adecuados se completan para garantizar el rendimiento del ensayo adecuado.

El análisis se lleva a cabo mediante los asistentes buscador función y co-localización para identificar que la intensidad detalle brillante es la mejor variable para separar las poblaciones y también identificar cómo existe mucha superposición entre el estallido oxidativo y señales de fagocitosis. Específicamente, el uso de citometría de la imagen basada proporcionado la capacidad para segregar los granulocitos activados en tres subconjuntos. Tsu desglose subconjunto se determinó utilizando intensidad detalle brillante de la fagocitosis vs. estallido oxidativo. Además de examinar estas funciones celulares singulares, se identificaron las células que presentaban ambos eventos al mismo tiempo en la misma localización anatómica (co-localización). Los granulocitos que cayeron en el subconjunto de "alto activo" fueron el único fenotipo que demostró un co-localización consistente entre la fagocitosis y el estallido oxidativo. Esta identificación de subgrupos de granulocitos activados es la mayor área donde se necesita la solución de problemas. Es muy importante para un nuevo usuario tomar tiempo para entender el flujo de trabajo de proceso muestra en IDEAS y comprender la mecánica de conmutar los poblaciones de células mediante el componente de imagen. Otras modificaciones que un usuario puede tratar de hacer que incluyen la selección de tiempos de incubación de ensayo alternativos o adicionales. El método actual sugiere el uso de una duración de 10-40 min; sin embargo, dependiendo del modelo experimental en el que este método espara ser utilizado, puede ser necesario seleccionar duraciones de ensayo más largo. Tendría que ser evaluado de forma individual tal modificación.

Además se determinó que la duración de la incubación ensayo tiene un efecto significativo en la aparición de los tres subconjuntos activados. El enfoque descrito en este informe representa una extensión de la información que se podría obtener con anterioridad respecto a la función de granulocitos ^3,4,13,15. Otros laboratorios han demostrado la importancia de evaluar los cambios en la función de los granulocitos como parte de una evaluación exhaustiva de la inmunidad y la enfermedad ^15-17. A pesar del potencial de este ensayo no es sin limitaciones. Una de las principales limitaciones es el costo y el tiempo asociado con la alta demanda de procesamiento de muestra de rendimiento. Cuando un diseño de estudio requiere un gran número de muestras en un día dado, estos pueden ser difíciles de procesar. El procesamiento se racionalizará el uso de pipetas y dispensadores electrónicos,pero éstas tienden a ser caros y no están necesariamente disponibles en todos los laboratorios.

Nuestra área de investigación se centra en el estudio de cómo el ejercicio y los hábitos alimenticios influyen en la salud del sistema inmune y la función ^{6,8-10,18-20.} Tales objetivos tienen implicaciones prácticas importantes para una variedad de áreas de la salud humana. Más allá del estudio de ejercicio y los efectos nutritivos el método de la fagocitosis demostrado en este manuscrito podría ser útil en otras áreas de la inmunología clínica donde el control de la función de fagocitosis es crítico para los resultados del tratamiento. El presente ensayo es el primero de muchos que ensayos inmunológicos con el potencial de ser reinventados tomando ventajas de la información única imagen que puede ser posible a partir de un flujo basado en imágenes citómetro.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vacutainers	BD Life Sciences	utilizados para la extracción
Fijador de WBC / Solución de lisis RBC	eBioscience	00-5333-57
CD66b-APC	clon de eBioscience	G10F5
CD45-APCeFluor780	clon de eBioscience	2D1
S. aureus biopartículas	Life Technologies	A10010
dihidroetidio	Sigma-Aldrich	D7008
N-etilmalemida	Sigma-Aldrich	4259
7AAD	EMD Millipore
Analizador de hematología	Mindray	BC-3200
pipeta de 96 canales	Integra Biosciences	ViaFlo
Incubadora de baño de perlas	LabArmour	Citómetro de flujo para imágenes BeadBath
	EMD Millipore	Amnis FlowSight
INSPIRE Software	EMD Millipore	Amnis INSPIRE
IDEAS Software	EMD Millipore	Amnis IDEAS
X-Pierce Sellador de placa perforable	Excel Scientific, Inc.	X-Pierce
Dell Precision Workstation	Dell Computers Varios		utilizados para el análisis de IDEAS