FIM Imaging y FIMtrack: Dos nuevas vías que hagan de alto rendimiento y Análisis de Costo Efectivo Locomoción

La mayoría de los animales tienen la capacidad de moverse de una manera altamente sofisticada y controlada. Para descifrar la base genética de control de la locomoción subyacente es obligatorio para evaluar cuantitativamente diferentes patrones de comportamiento. A este respecto, Drosophila puede servir como un modelo ideal. Seguimiento de volar libremente Drosophila es tentador ^1-4 pero el rastreo de las larvas de Drosophila se produce en dos dimensiones a una velocidad relativamente baja y por lo tanto se puede controlar fácilmente. Montajes basados ​​en cámaras combinadas con adecuada iluminación se utilizan para adquirir imágenes ^5. Tanto incidente o luz transmitida se emplea en experimentos de comportamiento ^6,7. Sin embargo, debido a que el cuerpo semi-transparente de las larvas y los posibles reflejos de luz de la superficie que se arrastra fiel registro de los movimientos de las larvas puede ser un reto. Para superar estos problemas, algunos métodos complejos se han ideado. Recientemente, iluminación de campo oscuro se introdujo para mejorar el primer plano / fondo contRAST ^8. Como alternativa a la grabación basada en la cámara, la imagen óptica de lentes menos y del sensor de imagen-en-chip menos se han introducido técnicas de adquisición de ^9-11.

Varios programas de seguimiento se han introducido recientemente, incluyendo el software de ¹² y personalizadas soluciones disponibles en el mercado. Ejemplos de programas de rastreo de alto rendimiento son el Rastreador Gusano Multi (MWT) ¹³ y Multianimal marcha y Track (MAGAT) ^8. Ambos tienen en común, que muchos animales pueden ser rastreados en un solo escenario de campo abierto para que los animales que chocan conducen a múltiples nuevas identidades animales. Para superar esta limitación, una configuración de múltiples pocillos se introdujo la separación de 12 animales en pocillos individuales ^14. La cuantificación precisa de la locomoción de las personas individuales se puede lograr mediante el uso de una etapa de seguimiento móvil en combinación con un microscopio ^15. Sin embargo, todos estos enfoques son o poco rentables, la falta suficiente resolución o demasiado tiempo para alta fenotipificación rendimiento.

FIM Para superar las limitaciones mencionadas anteriormente, hemos desarrollado (método de imagen basada en FTIR), basado en Frustrado Reflexión Interna Total (FTIR) ¹⁶ (Figura 1). Este nuevo enfoque de imagen proporciona un alto contraste sin precedentes e incluso permite la grabación de varios colores de animales rastreros ^16. El principio subyacente de este método práctico y eficaz es fácil. Una placa de vidrio acrílico se inunda de luz (por ejemplo, 875 nm infrarrojo). Debido a los diferentes índices de refracción de vidrio acrílico y el aire, la luz se refleja totalmente en el límite vidrio / aire. No hay calefacción del vidrio acrílico se observó ^16. Sólo si los objetos con un índice de refracción más alto toquen la mesa luminosa, puede iluminar introducir estos objetos. Si los animales tocan la superficie, la luz se refleja y se puede capturar desde abajo (Figura 1). En consecuencia, sólo el contactoárea de los animales aparece como un punto brillante, que permite imágenes detalladas con un fondo negro en general. Por lo tanto, la FIM-imagen permite grabar películas perfectas para los algoritmos de visión por computador. El uso simple y robusto de FIM ahora trae un análisis detallado del comportamiento animal complejo de alto rendimiento en alcance y se puede utilizar para el estudio de tratamiento de la información: por ejemplo, el olfato ^{8, 16;} visión ¹⁷ o thermosensation ^18.

Figura 1. Configuración FIM con la integración de calor-estímulo y los principios físicos subyacentes. (A) La configuración de FIM. Intensidad de iluminación se puede regular en el panel frontal. (B) Para entregar un estímulo de calor, un negro pintado placa de aluminio, perfundido con agua fría y caliente en ambos lados, se coloca 2 mm por encima de la superficie del agar quesí es de 2 mm de espesor. El gradiente se establece en la placa del radiador de calor y el agar por las diferencias de temperatura (C) El principio físico de la frustrada reflexión interna total:. Una placa de vidrio acrílico es iluminado por la luz infrarroja. θ _1, θ _2, y θ ₃ indican los ángulos de reflexión de luz. n _A, n _1, n ₂ yn ₃ denotan los índices de refracción del aire, vidrio acrílico, agar y la larva, respectivamente, y cumplir con la desigualdad n _A <n ₁ <n ₂ <n _3. Debido a la refracción, el ángulo de reflexión cambia durante la transición. Si el ángulo está por debajo del ángulo crítico, la luz no se refleja más, puede pasar a través de las capas y pueden ser capturados desde abajo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El spectrum de los procesos que pueden ser analizados por la FIM es amplio. Sin ningún otro ajuste, la imagen de la FIM se puede utilizar para controlar todas las fases larvarias de Drosophila (Figura 5B) o se puede utilizar para seguir las pisadas de adultos Drosophila ^19. Del mismo modo, las trayectorias de C. elegans o el movimiento de los gusanos planos planarias se pueden grabar fácilmente (Figura 5C). Incluso el análisis de hifas o el pelo de raíz el crecimiento de hongos parece factible ^19. En nuestra configuración actual FIM, 4 x 16 diodos emisores de luz infrarroja (LED) IR- están integrados en una placa de vidrio ² cm acrílico 32 x 32, llamada la tabla de seguimiento (Figura 1). La intensidad de la IR-LED se ajusta dependiendo del peso de los objetos en la tabla de seguimiento, que se puede hacer fácilmente por un micro controlador conectado al circuito a través de la modulación de ancho de pulso (PWM). FIM produce imágenes de muy alta de contraste a través de una amplia gama de intensidades de iluminación. Es importante destacar que la GENtamente excelentes resultados en ya baja irridation infrarrojos general.

Una cámara con un filtro de infrarrojos se coloca por debajo de la tabla de seguimiento, lo que permite la integración de estímulos adicionales a la configuración. Estímulos de calor pueden ser aplicados fácilmente por una placa de radiador de calor y estímulos de luz se aplican mediante un proyector LCD. También odorantes pueden estar contenidos en los gradientes de tapas sencillas ^8. Para los experimentos de gradiente de calor, la placa de radiador de calor se perfunde con agua caliente y fría en ambos lados, respectivamente, y se coloca 2 mm por encima de las larvas (Figura 1B).

La generación de alto contraste, películas de alta calidad abre la posibilidad de sofisticados análisis de imágenes por computadora, por lo que se implementó el software FIMTrack para extraer un gran conjunto de características a partir de imágenes (Figura 2). Las primeras seis funciones principales se definieron a partir del contorno del animal (Figura 3A). Estas características proporcionan la línea de basePara más cálculo de seis características secundarias que describen la forma animales y su posición en ciertos estímulos en un punto de tiempo dado (Figura 3B). Actualmente, nueve características terciarias se calculan que están integrando aspectos temporales y por lo tanto caracterizar la locomoción del animal junto con las características primarias y secundarias (Figura 3C).

Figura 2. Panorama FIMTrack, flujo de trabajo algorítmico y la representación de las larvas. (A) ¿Cómo utilizar FIMTrack. Las imágenes se cargan. Umbral de valor de gris y umbrales de tamaño de las larvas que definen las larvas solo deben establecerse. El área de larvas debe estar en [-min tamaño, de tamaño max]. El seguimiento se inició por el botón resaltado. Flujo de trabajo (B) Seguimiento. Después de hacer clic en el botón de inicio, la imagen de fondo es calculated (intensidades mínimas en el tiempo). Mientras hay marcos de la izquierda, las larvas se segmentado basado en el umbral de gris y la minería y el umbral máximo de tamaño. Para todas las segmentaciones las representaciones de larvas se calculan (comparar con (C)). Cada nuevo modelo se asocia a una trayectoria dada si una pista válida disponible. Si se alcanza el último cuadro, finalizando el procesamiento posterior se realiza seguido por la generación de salida. (C) la representación de las larvas. El animal se compone de una cabeza y un punto de cola (h y t). Entre estos puntos un número impar arbitrario de puntos de la columna s _i se puede configurar con un radio r _i. Además, el centro de masa m y el cuerpo principal de flexión γ ángulo se calculan. Varios parámetros relacionados con el movimiento se esbozan por líneas de color púrpura. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

NOTA: Aquí, el uso de FIM se presenta para análisis de alto rendimiento práctico de la locomoción de larvas para el cribado en condiciones de libre movimiento y bajo la influencia de un estímulo de calor. Otras aplicaciones, como el análisis de los estímulos olfativos locomoción dependiente o de alta resolución de imagen de comportamientos rodantes u otros podrían necesitar cambios sutiles en el protocolo, que se proporcionan bajo petición.

1. Configuración de Experimentos

1. Use aproximadamente 100 larvas por genotipo en total (tiempo de 1 hora requerido) para obtener valores estadísticamente significativos. NOTA: En el caso de varios genotipos necesitan ser comparados y registrados en diferentes días, grabar el mismo número de larvas por genotipo por día.
2. Para la mayoría de las aplicaciones, ficha a 10 Hz para el análisis de parámetros. Para aplicaciones de alta resolución de imagen, variar la velocidad de imagen si es necesario.
3. Para el seguimiento de las larvas de tercer estadio, realizar experimentos alrededor de 120 horas después de la puesta de huevos. Haga sure que las culturas producen suficiente larvas en el período experimental (véase 4.3).
4. Para aplicaciones no-estímulo, preparar una superficie de rastreo que contiene agar translúcido (ver sección 2). Para contener larvas en el rango de estímulo para la aplicación del gradiente térmico, rodear el campo de visión con una barrera agar sal aversivo (ver sección 3).
   NOTA: Otras aplicaciones pueden requerir diferentes superficies.
5. Asegúrese de utilizar una habitación con condiciones constantes ambientales (temperatura, luz, flujo de aire, la humedad del aire, etc.).

2. Arrastre a la preparación de superficies (translúcido Agar)

NOTA: En la configuración de la FIM se añade una superficie de agar para proporcionar una superficie de rastreo húmedo. Además, también mejora las propiedades de iluminación.

1. Hervir agar de calidad alimentaria 0,8% en agua ultra pura desionizada. Para la aplicación de cribado preparar 400 ml.
2. Vierta el agar a 50 ° C (frío-mano) en una separada de 33 cm x 33 cm acplaca rylic-vidrio. La tensión de la superficie del agar y por lo tanto la temperatura definir el espesor de la losa de agar. A 50 ° C, se obtienen 2 mm de espesor losas de agar. No agite después de hervir y verter constantemente para evitar burbujas. Preparar placas de agar frescas para cada período de formación de imágenes de alrededor de 4 horas.
3. Llenar platos estándar 6 cm de Petri con la solución restante agar 0,8% para ordenar, limpiar y habituarse larvas antes del experimento (1 plato por genotipo).
4. En caso de que se necesita una barrera agar aversivo para la aplicación, pase a la sección 3.
5. Se quita aproximadamente 2 cm del perímetro de la losa de agar para obtener una superficie cuadrada plana para la grabación. Retire el exceso de agar.
   NOTA: El tamaño depende de la aplicación.
6. Transferir la losa de agar a la configuración de la FIM directamente después del enfriamiento empujando suavemente el agar de deslizamiento sobre el borde de la placa de vidrio acrílico.

3. Opcional: Agregar un aversivo Agar Barrera al Crawling Superficie (Sal Agar)

1. Hervir agar de calidad alimentaria 2,5% con 3 M de NaCl en agua ultra pura desionizada. Para la detección de un gradiente de calor preparar 200 ml.
   NOTA: El volumen depende de la aplicación.
2. Cortar un 2 cm de ancho muesca en la superficie previamente vierte rastreo que rodea el campo de visión (22 x 22 cm).
   NOTA: Las diferentes formas de barrera y los campos de visión pueden ser necesarios dependiendo de la aplicación.
3. Llene la muesca con agar sal 0.1-0.3 cm más alto que la superficie de seguimiento.

4. Fly Manejo

1. Posterior vuela en 25 ° C incubadora con 12 h de luz / oscuridad ciclo ajustado a la hora del experimento en comida mosca estándar a 65% de humedad del aire.
2. Para cruces, anestesiar a 30 moscas hembras vírgenes y 8 hombres con CO ₂ y cruzarlos en 130 viales de cultivo ml con 35 ml de alimentos.
   NOTA: Uno de 130 ml frasco de cultivo con 35 ml de alimentos producirá alrededor de 20-30 lcomieron las larvas en el lapso de imagen de 4 horas. Imaging y seguimiento de obras para todas las etapas estadio larval.
3. Caída de un poco de agua en los frascos de cultivo para conducir finales del tercer estadio larval movimiento y recoger el mayor larvas de las paredes del vial utilizando un pincel pequeño.
4. 2-5 min antes de la grabación, larvas de transferencia de un vídeo a una placa de Petri que contiene agar de calidad alimentaria 0,8% en agua ultrapura desionizada para habituar y limpiarlos.

5. Ajuste de la configuración del FIM Imaging para Grabaciones (no Estímulo Condiciones)

1. Ajuste el enfoque de la lente de la cámara y la abertura si es necesario. Ajuste el tiempo de exposición para la cámara respectiva.
   NOTA: Estos valores no necesitan ser cambiados durante un experimento.
2. Ajuste la intensidad de iluminación para obtener un buen contraste de imagen una larva.
3. Mantenga las condiciones ambientales en la constante de habitación durante las grabaciones. Oscurecer la habitación para no molestar a las larvas con luz direccional.

6. Opcional: Ajuste de la configuración del FIM Imaging para Grabaciones (Temperatura gradual del estímulo Condiciones)

NOTA: El dispositivo de gradiente de calor es una ^cm3 placa 42 x 42 x 0,2 de aluminio con una pintura negro mate y material aislante en el sitio superior. La placa se perfunde con agua a partir de dos circuitos diferentes conectados a acumuladores / refrigeradores y bombas en ambos extremos (véase la Figura 1B). Las temperaturas pueden ser reguladas -5-50 ° C.

1. Encienda el gradiente de calor dispositivo de 1 hora antes de los experimentos y colocarlo encima de la configuración para permitir establecer el perfil de temperatura deseado y los componentes que se equilibre.
2. Transferir el agar superficie arrastrándose con una barrera de sal a la configuración.
3. Coloque la placa de radiador sobre el agar y ajustar el espacio entre la placa y la superficie de rastreo a 2 mm (~ 1 mm por encima de las larvas).
4. Establecer un gradiente lineal deal menos 0,8 ° C / cm a partir de 34 ° C (aprox. 2 cm de la barrera en el campo de visión) a 18 ° C (aprox. 2 cm de la barrera en el lado opuesto en el campo de visión) mediante el ajuste de la temperatura de los circuitos de agua a 1 ° C y 45 ° C.
   NOTA: Diferentes propiedades del gradiente de la placa de metal requieren diferentes temperaturas que necesitan ser comprobada empíricamente. Estos ajustes no necesitan ser cambiados durante los experimentos.
5. Ajustar la configuración como se describe en la sección 5.
6. Permitir que la superficie de rastreo se equilibre en el gradiente antes de los experimentos de 20 min. Pruebe el gradiente de temperatura con un pirómetro.
7. Continúe con la sección 8.

7. Imaging FIM (no Estímulo Condiciones)

1. Use una pequeña brocha húmeda para recoger suavemente 15 larvas de las placas de Petri de habituación y transferirlas al centro de la superficie de seguimiento. No transferir alimentos sigue siendo o demasiadaagua (véase 7.8).
2. Record 1-50 larvas en un 22 cm x 22 cm de superficie de control. Utilice 15 animales por vídeo para la mayoría de aplicaciones de detección (por razones estadísticas utilizan al menos 100 individuos por genotipo).
3. Separar suavemente las larvas y esperar unos 10-20 segundos hasta que todas las larvas comenzó a moverse en línea recta antes de la grabación.
4. Anote la locomoción de larvas durante 2 minutos a 10 fotogramas por segundo para condiciones no de estímulo. Utilice imágenes tif sin comprimir como formato de salida.
5. Durante la grabación, recolectar larvas para el próximo video de viales habituar ellos crítico:. No molestar larvas grabado con luz.
6. Después de la grabación, eliminar las larvas con una brocha grande y desecharlos de acuerdo con las normas de la legislación de seguridad y locales.
7. Después de la eliminación de las larvas, utilice el pincel para limpiar y humectar la superficie de rastreo con agua ultra pura desionizada.
8. Crítica: Mantenga la superficie húmeda en todo momento, pero evitar mo excesivoisture, que puede ser visto como halos o gotas que rodean larvas en grabaciones y perturbar de seguimiento.

8. Opcional: Imaging FIM (Temperatura gradual del estímulo Condiciones)

1. Después de establecer el gradiente de temperatura (ver sección 6), preparar el software de grabación para grabar dentro de 20 seg instante después de la colocación de las larvas en la superficie de rastreo (véase 8.2), por ejemplo, ajustar el número de fotogramas por vídeo y definir la ruta de almacenamiento.
2. Levante la placa del radiador ligeramente y colocar las larvas a los 33 ° C a 2 cm de la barrera de sal. Consulte 6. y 7. Para obtener más instrucciones generales. Baje la placa del radiador de nuevo y comenzar a grabar durante 3-4 min directamente después de larvas comenzó a moverse en línea recta.
3. Después de la grabación, eliminar las larvas directamente, limpia y humecta la superficie. No toque el agar sal para evitar la propagación de NaCl.
4. Crítica: Mantenga la superficie húmeda en todo momento, pero evitarhumedad excesiva, que puede ser visto como halos o gotas que rodean larvas en grabaciones y perturbar de seguimiento.
5. Deje que la superficie del agar se equilibre de nuevo después de la hidratación durante 1-2 minutos, mientras que guardar las imágenes y la recolección de nuevos animales antes de preparar para el próximo video. Controlar el gradiente de temperatura utilizando un pirómetro cada 5 vídeos y ajustar si es necesario dispositivo de temperatura (temperatura del agua, la altura y la orientación xy con respecto a la superficie de seguimiento).

9. Seguimiento de las larvas Locomoción

NOTA: Para obtener más detalles, consulte el manual adjunto para FIMTrack (suplemento). Para un diagrama de flujo del programa véase la Figura 2.

1. Ajustar parámetros de seguimiento para los respectivos experimentos utilizando la opción de vista previa.
   1. Ajuste de píxeles por cm de acuerdo a la cámara y campo de visión.
   2. Ajuste fotogramas por segundo en función de los ajustes de la cámara.
   3. Ajustar umbrales de luminosidad así ªa todos los animales se detectan correctamente (retroalimentación se da en la vista previa).
   4. Ajuste larvas umbrales de tamaño de área. Tenga en cuenta la opción de comentarios en la vista previa: animales individuales se resaltan en amarillo, chocando larvas se resalta en rojo y el área de cada animal se le da en azul.
2. Iniciar el seguimiento utilizando el botón en la parte inferior derecha.
   NOTA: Después de una exitosa localización, una imagen que ofrece pistas de larvas y un archivo CSV que contiene las características de locomoción y postura calculados se almacena en el directorio de imágenes.
3. Utilice el módulo espectador Resultados de la FIM (Editar> Resultados Visor ...) para revisar y ajustar manualmente los resultados de rastreo. Si es necesario, definir las regiones de estímulo para evaluar los datos en relación con el régimen de estímulo por ejemplo, arrastrándose orientación con respecto al gradiente de calor o la distancia a una fuente odorante. Para una descripción más detallada, por favor utilice el manual (suplemento).

10. Evaluación de los Datos

1. Importe el archivo CSV en Excel, Matlab o cualquier otro programa para su posterior análisis estadístico.

Para obtener imágenes de varias cámaras diferentes con diferentes propiedades de resolución fueron probados (Figura 4). Todas las cámaras donde equipado con un filtro IR apropiada. De acuerdo con la baja resolución de la cámara de precio más bajo en esta prueba, el campo de visión está limitado a 10 cm x 10 cm. Los mejores resultados se obtuvieron usando un 4 megapíxeles (MP) de la cámara. Esto conduce a una resolución de 100 píxeles por tercer estadio larval longitud y se deja reconocer fácilmente las estructuras internas. Además, la peristalsis del animal puede ser fácilmente extraído (Figura 4A). Sin embargo, todavía se pueden obtener películas de alto contraste con cámaras menos costosas, que también pueden ser analizados por FIMTrack. Utilizando una cámara de 1,4 MP con una profundidad de 8 bits y una resolución de 1392 x 1040 píxeles es aproximadamente la mitad del precio y permite una resolución de 45 píxeles por tercer estadio larval longitud en el campo de visión. La cabeza, pero no hay otras estructuras internas pueden ser reconocidos (Figura 4B). Seguimiento y detección de peristaltismo es posible, pero la precisión se reduce (Figura 4B).

Con una cámara de 0,8 MP incluso más barato con una resolución espacial comparable al 1,4 MP cámara, el jefe de las larvas no se puede reconocer con fidelidad más (Figura 4C). Seguimiento y análisis peristaltismo es posible, pero incluyendo más jitter basado en el aumento del ruido. Sorprendentemente, incluso una cámara web de baja resolución USB ofrece películas de calidad suficientes para calcular trayectorias larvales (cámara de 0.3 MP, debajo de los 20 €, Figura 4D). El peristaltismo puede calcularse a partir del área pero las mediciones son muy ruidosas.

En nuestra configuración que utilizamos rutinariamente el 4 MP cámara. Para el cribado, esta cámara permite la monitorización de un 22 cm x 22 cm arena, lo que obviamente ofrece la oportunidad de analizar un gran número de animales simultáneamente de modo que el análisis de alto rendimiento es factible. El uso de este ajuste, la longitud de las larvas is representada por 40 píxeles que todavía permite la grabación y análisis de los movimientos peristálticos. Una imagen de ejemplo de 15 trayectorias de larvas en un gradiente de calor se da en la Figura 5A. Además, el uso de una lente macro permite a las larvas de imagen con una resolución muy alta en muchos órganos internos se hacen visibles y reconocimiento se mejora aún más la cabeza (Figura 5B). Además estos pueden ser utilizados para el análisis ulterior más detallada de los comportamientos de una amplia gama 20. La misma configuración se puede utilizar fácilmente para imagen Arrastre C. gusanos elegans (Figura 5C).

Figura 4. imágenes y seguimiento de los resultados de la FIM para diferentes cámaras. (A) Izquierda: imágenes FIM de tres larvas se arrastra en una etapa de seguimiento de 10 cm x 10 cm capturaron con una cámara de 4 MP con 10 fps. Medio:Clipping y el centro de la trayectoria masa de una sola larva. El área del animal se indica. Derecha: Área de la larva traza más de 100 marcos. La flecha roja indica el punto de la imagen recortada tiempo. (B) Equivalente a (A), pero capturaron con una cámara de 1.4 MP. (C) Equivalente a (A), pero capturaron con una cámara de 0.8 MP. (D) Equivalente a ( A) pero capturaron con una cámara de 0.3 MP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. estímulo de calor, y de alta resolución de las solicitudes. (A) la aplicación estímulo de calor (comparar con la Figura 1). Trayectorias calculan a través de FIMtrack. Imagen de la aplicación de alta resolución de una tercera, segunda y primera larva se utiliza un objetivo macro (B). La longitud de las larvas de tercer estadio está representado por 400 píxeles en un campo de visión de 2,5 x 2,5 cm. (C) A C. elegans gusano capturado utilizando imágenes de FIM. Las barras de escala se indican. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar