Todo el montaje de imágenes de embriones de ratón Proyecciones sensorial Axon

Resumen

Presentamos aquí un protocolo optimizado para genotipar, teñir y preparar ratones fetales para la obtención de imágenes de proyecciones de axones nociceptores periféricos en todo el animal, como un método eficaz para evaluar los fenotipos de crecimiento sensorial de axones en ratones modificados genéticamente en desarrollo.

Resumen

La visualización de proyecciones neuronales de larga duración en los embriones es esencial para obtener una comprensión de cómo los mamíferos desarrollan redes neuronales. Aquí se describe un método para etiquetar in situ un subconjunto de ganglios de la raíz dorsal (GRD) proyecciones axón para evaluar sus características fenotípicas utilizando varias líneas de ratones manipulados genéticamente. Las neuronas TrkA-positivo son las neuronas nociceptivas, dedicada a la transmisión de señales de dolor. Utilizamos una línea de ratones TrkA ^taulacZ para etiquetar las trayectorias de todos los axones periféricos TrkA-positivo en el embrión de ratón intacto. Criamos aún más la línea TrkA ^taulacZ sobre un fondo nulo Bax, que esencialmente suprime la apoptosis neuronal, a fin de evaluar las preguntas relacionadas con el crecimiento independientemente de los posibles efectos de las manipulaciones genéticas sobre la supervivencia neuronal. Posteriormente, los ratones modificados genéticamente de interés son criados con el TrkA ^TaullacZ / Bax línea nula y son entonces listo para su estudio usando las técnicas descritas en el presente documento. Esta presentación incluye información detallada sobre los planes de cría de ratón, genotipificación en el momento de la disección, la preparación del tejido, la coloración y el desmonte para permitir la visualización de larga duración trayectorias axonal en la preparación de todo el montaje.

Introducción

Establecimiento de redes neuronales precisos es un complejo proceso de desarrollo esencial para la funcionalidad del sistema nervioso. Perturbación en este proceso conduce a la disfunción neuronal que ha sido implicado en enfermedades neurológicas humanas ^1-3. Para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes de crecimiento de los axones y la inervación diana en mamíferos, hemos desarrollado un protocolo para visualizar las trayectorias axonales de TrkA-expresión de las neuronas sensoriales usando una combinación de dos líneas de ratones modificados genéticamente.

TrkA es un receptor para el factor de crecimiento nervioso NG....

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos se ajusten a la Guía del NIH para el uso y cuidado de animales de laboratorio. El animal protocolo fue aprobado por el IACUC en el Weill Cornell Medical College.

1. Preparación del tejido

1. La eutanasia hembras cronometrada del embarazo por dislocación cervical ^15. Diseccionar embrionarias E16 - E18 embriones de las hembras cronometrada del embarazo y colocar los embriones individualmente en los pocillos de una placa de 6 pocillos, llenos de solución salina tamponada con fosfato fría (PBS).
2. Enjuague los embriones en PBS frío.
3. Retirar una pequeña porción de la membrana ....

Resultados

Los genotipos de TrkA ^{WT / taulacZ:} Bax ^{- / -} y TrkA ^{taulacZ / taulacZ:} Bax ^{- / -} embriones se pueden determinar de forma inequívoca por genotipo PCR estándar (Figura 1). Tinción pantallas X-gal detallan cenadores axonales periféricos por vía subcutánea en embriones convencionalmente manchadas (Figuras 2, 3a), y en todo el embrión después de la compensación de tejido (Figuras 3b, 4).

Hemos criado l.......

Discusión

El procedimiento de tinción X-gal-descrita anteriormente de ratones embrionarios TrkA ^taulacZ permite la visualización rápida y detallada de las proyecciones de los axones de larga distancia en el embrión intacto fijo. Debido a la nula fondo Bax estos ratones permiten el sondaje de los mecanismos que pueden contribuir tanto al crecimiento del axón neuronal y la supervivencia de señalización. El apareamiento con transgénicos o knockout ratones de interés permite una evaluación completa de los.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
PFA	Sigma-Aldrich	P6418
PBS	Life Tech	10010-023
Solución de enjuague de pañuelos A	Millipore	BG-6-B
Solución de enjuague de tejidos B	Millipore	BG-7-B
tinción de tejidos	Millipore	BG-8-C
X-gal	Sigma-Aldrich	B4252
Frasco de centelleo de vidrio	Kimble Chase	74500-20
Incubadora	Labline	Modelo 120
Alfileres de insectos	FST	26000-30
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Plato de 6 pocillos	USA Scientific	CC7672-7506
Imprimaciones	IDT
Mezcla dNTP	Takara	4030
Tampón Takara LA	Takara	RR002A
Takara LA Taq	Takara	RR002A
Máquina de PCR	Bio-Rad	DNA Engine Díada
Alcohol bencílico	Sigma-Aldrich	B-1042
Benzoato de bencilo	Sigma-Aldrich	B-6630
Microscopio de disección	Leica	M205A
Cámara	Leica	DFC310FX
Anillo de luz	Leica	MEB110
Photoshop	Adobe	Photoshop 4.0

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