Artículo de método

La unión neuromuscular: Medición Synapse Tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica Uso confocal microscopía de fluorescencia

DOI:

10.3791/52220

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26 de diciembre de 2014

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1Physiology and Bosch Institute, University of Sydney, 2Motor Neuron Disease Research Group, Australian School of Advanced Medicine, Macquarie University, 3Advanced Microscopy Facility, Bosch Institute, University of Sydney

En este artículo

Resumen

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La unión neuromuscular (NMJ) está alterada en una variedad de condiciones que a veces pueden culminar en una falla sináptica. Este informe describe los métodos basados en microscopios de fluorescencia para cuantificar dichos cambios estructurales.

Resumen

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La unión neuromuscular (UNM) es la sinapsis relé grande, colinérgica a través del cual las neuronas motoras de mamíferos controlan la contracción muscular voluntaria. Los cambios estructurales en la UNM pueden resultar en el fracaso de la neurotransmisión, resultando en debilidad, atrofia e incluso la muerte de la fibra muscular. Muchos estudios han investigado cómo las modificaciones genéticas o enfermedades pueden alterar la estructura de la UNM ratón. Desafortunadamente, puede ser difícil comparar directamente los resultados de estos estudios ya que a menudo emplean diferentes parámetros y métodos analíticos. Tres protocolos se describen aquí. El primero utiliza la proyección de intensidad máxima imágenes confocal para medir el área de receptor de acetilcolina (AChR) ricos en dominios de la membrana postsináptica en la placa terminal y el área de tinción de las vesículas sinápticas en la terminal nerviosa presináptica suprayacente. El segundo protocolo se comparan las intensidades relativas de inmunotinción para proteínas sinápticas en la membrana postsináptica. La tercera protocol utiliza la transferencia de energía de fluorescencia por resonancia (FRET) para detectar cambios en el embalaje de AChR postsinápticos en la placa terminal. Los protocolos se han desarrollado y perfeccionado a lo largo de una serie de estudios. Los factores que influyen en la calidad y la consistencia de los resultados se discuten y datos normativos se proporcionan para NMJs en ratones adultos jóvenes sanos.

Introducción

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La unión neuromuscular (NMJ) es la sinapsis relé crítico que media la comunicación entre el sistema nervioso y músculo esquelético. Se requiere para todo el movimiento voluntario. La microscopía de fluorescencia se ha utilizado para estudiar los efectos de los transgenes en el ratón NMJ 1-3 o para comparar los efectos de la edad, la dieta, el ejercicio y la enfermedad en roedores NMJs 4-11. Tales estudios han enseñado mucho acerca de la fisiología y la fisiopatología de la UNM, pero los diversos parámetros informado (por ejemplo, área AChR, área de placa terminal, longitud del perímetro, los índices de fragmentación) a menudo hacen que ....

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Protocolo

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NOTA: El diseño, la realización y presentación de informes de los experimentos con animales deben tener en cuenta las directrices actuales 24. Este tipo de trabajo debe ser aprobado previamente por la autoridad local de protección de los animales (en nuestro caso, el Comité de Ética Animal de la Universidad de Sydney).

1. La eutanasia del animal y la disección muscular

  1. Transferir el ratón desde la sala de espera a una habitación separada donde se practicó la eutanasia con una inyección intraperitoneal de solución de pentobarbital (30 mg / kg), utilizando el método de manejo del ratón detallado por Shimizu 25. Coloca el ratón d....

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Resultados

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Medición de Synaptic Área en la UNM

Cualquier estimación del área se basa en el dibujo de un límite para definir la extensión de especializaciones sinápticas. En los músculos adultos jóvenes sanos imágenes NMJ deben mostrar los límites bien definidos, tanto para AChR y tinción sinaptofisina (Figura 2 A y B). La intensidad de fluorescencia para ambos AChR y sinaptofisina aumenta de forma pronunciada en el límite entre la porción peri-sináptic.......

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Discusión

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Los protocolos descritos aquí nos han permitido medir y cuantificar los cambios en las propiedades de la UNM en toda una serie de condiciones, incluyendo los estados normales de envejecimiento y la enfermedad. Los métodos descritos para en face imágenes NMJ permitirán a los investigadores comparan el área de especialidades pre y postsinápticos y el área de superposición sináptica / alineación. Para comparar la intensidad relativa de las proteínas pre y postsinápticos el segundo protocolo, que utiliza secciones ópticas t.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud [570930]. Las imágenes se llevaron a cabo en el Centro de Microscopía Avanzada del Instituto Bosch. Se agradece a los antiguos miembros del laboratorio, cuyo trabajo se cita, por sus contribuciones al desarrollo de estos métodos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microscopio confocal de barridoLeicaDM 2000 con  Sistema TCS SP2La mayoría de los microscopios confocales de barrido deberían ser adecuados.
ZeissLSM 510 Meta 
LeicaSPE-II
Alexa555-a-bungarotoxina (rojo-BGT)technologiesB35451Utilizado para el etiquetado de AChRs
Alexa647-α-bungarotoxina (far-red-BGT)Life technologiesB35450Fluorescencia de rojo lejano: apenas visible a través del ocular 
conejo anti-sinaptofisinaLife technologies18-0130Los diferentes lotes de anticuerpos primarios difieren en la dilución de trabajo efectiva
FITC-anti-rapsyn mab1234MiliporeFCMAB134FAnticuerpo monoclonal conjugado con FITC
FITC-burro anti-conejo IgGJackson711-095-152anticuerpos secundarios policlonales pueden variar en calidad según la fuente y el lote
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Referencias

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  1. Schmidt, N., et al. Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin. J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).
  2. Amenta, A. R., et al. Biglycan is an extracellular MuSK binding ....

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Microscop a confocalmedici n del tama o de la sinapsistransferencia de energ a de resonancia de fluorescenciaproyecci n de m xima intensidadtinci n del receptor de acetilcolinacolocalizaci n de la sinaptofisinaan lisis con ImageJan lisis de la uni n neuromuscular del rat n

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