Cultura de embriones de ratón explantes cocleares y Gene Transfer por electroporación

Resumen

Presentamos un método que describe el aislamiento y cultivo de explantes cocleares del oído interno de ratones embrionarios. También demostramos un método para la transferencia de genes a explantes cocleares a través de electroporación de onda cuadrada. El cultivo in vitro de explantes, junto con la técnica de transferencia de genes, permite a los investigadores estudiar los efectos de la alteración de la expresión génica durante el desarrollo.

Resumen

Las células ciliadas auditivas ubicadas dentro del órgano de ratón de Corti detectan y transmiten información sonora al sistema nervioso central. Las células ciliadas mecanosensoriales están alineadas en una fila de células ciliadas internas y tres filas de células ciliadas externas que se extienden a lo largo del eje basal a apical de la cóclea. La técnica de cultivo de explantes descrita aquí proporciona un método eficiente para aislar y mantener explantes cocleares del oído interno del ratón embrionario. Además, la morfología y las características moleculares de las células ciliadas sensoriales y las células de soporte no sensoriales dentro de los cultivos de explantes cocleares se asemejan a las observadas in vivo y pueden estudiarse dentro de su entorno celular intrínseco. Los explantes cocleares pueden servir como importantes herramientas experimentales para la identificación y caracterización de vías moleculares y genéticas que están involucradas en la especificación y el modelado celular. Aunque los modelos de ratones transgénicos proporcionan un enfoque eficaz para los estudios de expresión génica, un número considerable de ratones mutantes mueren durante el desarrollo embrionario, lo que dificulta el análisis y la interpretación de los fenotipos del desarrollo. El órgano de Corti procedente de ratones mutantes que mueren antes de nacer puede ser cultivado para analizar su desarrollo in vitro y sus respuestas a diferentes factores. Además, describimos una técnica para electroporar explantes cocleares embrionarios ex vivo que se puede utilizar para regular a la baja o sobreexpresar genes específicos y analizar su posible función endógena y probar si un producto génico específico es necesario o suficiente en un contexto dado para influir en el desarrollo coclear de mamíferos^1-8.

Introducción

El órgano de los mamíferos de Corti está compuesto por un mosaico de tipos de células especializadas, incluyendo dos tipos de células ciliadas mecanosensoriales, así como al menos cuatro tipos de células de soporte no sensoriales, lo que lo convierte en un sistema modelo ideal para estudiar los procesos celulares normales como la proliferación, la especificación del destino, la diferenciación y el patronaje. Además, el desarrollo normal de estos diferentes tipos de células es esencial para la función auditiva normal. Por lo tanto, es crucial comprender los factores, tanto moleculares como celulares, que regulan su desarrollo. Sin embargo, el pequeño tamaño de la cócle....

Protocolo

NOTA: Todos los protocolos que utilizan animales vivos debe ser revisado y aprobado por el Cuidado y Uso de un Comité Institucional Animal (IACUC) y debe seguir los métodos para el cuidado y uso de los animales de laboratorio homologado. Todas las disecciones se deben realizar utilizando una técnica estéril en un banco de flujo laminar limpio. Guantes y una máscara, si se desea, se deben usar durante este procedimiento.

1. La disección de la Oreja embrionarias de ratón Interior

1. Configuración para órgano de cultivos de explantes Corti:
   1. Esterilizar el flujo laminar campana de cultivo de tejido mediante la activación de l....

Resultados

Describimos un método para aislar la cóclea de oídos internos embrionarios y microdiseccionarla con el fin de exponer el epitelio sensorial. Una vez diseccionada, puede sembrarse y cultivarse como un conducto coclear intacto (Figura 3) y analizarse mediante inmunohistoquímica. Los explantes cocleares cultivados proporcionan un ensayo útil para examinar el efecto de una variedad de factores solubles y fármacos farmacológicos sobre el desarrollo coclear. Tras la disección de los explantes cocleares, puede .......

Discusión

Todas las células dentro de la laberinto membranoso del oído interno de ratón incluyendo sensorial, no sensorial y las neuronas del ganglio espiral se derivan de placodally derivados de otocyst situado adyacente a la parte posterior del cerebro del ectodermo, alrededor de ^10-14 E8. En E11, la región ventral de la otocyst se extiende para formar el conducto coclear y como sigue el desarrollo, un grupo de células epiteliales dentro de la cóclea, así como en otras regiones del otocyst, convertido especifica como.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
HBSS	Gibco	14065-056
HEPES	Gibco	15630-080
Dulbecco' s Medio modificado	Gibco	12430-054
Suero fetal bovino	Gibco	10082
N-2 Suplemento (100x)	Gibco	17502-048
Clorhidrato de ciprofloxacino	Cellgro	61-277-RF
Plato de vidrio 60 mm	Kimble Chase	23062-6015/23064-6015
Plato de vidrio 100 mm	Kimble Chase	23064-10015/23062-10015
Pines de minucias	Fine Science Tools	26002-15
Pinzas Dumont #5	Fine Science Tools	11251-10
Generador de impulsos	Protech International Inc	CUY21Vivo-SQ
Platos de cultivo con fondo de cristal	MatTek	P35G-0-10-C
Matrigel matrix	BD Biosciences	356237
Plato de cultivo, 60 x 15 mm	Becton Dickinson	353037
Platos de cultivo de tejidos	Greiner Bio-one	639160
Solución salina tamponada con fosfato	Gibco	10010-023
OS-30	Dow Corning	4021768
Fluoromount	Southern Biotech	0100-01
Tubos cónicos, 15 ml	Greiner Bio-one	188261
Myosin 6	Proteus Biosciences Inc	25-6791
Myosin 7a	Proteus Biosciences Inc	25-6790
TuJ1	Sigma	T2200