Medición de la estabilidad de proteínas en la sala de embriones de pez cebra Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP)

Resumen

Los niveles de proteína en células y tejidos son a menudo estrechamente regulada por el equilibrio de la producción y eliminación de proteínas. Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP), la cinética de eliminación de proteínas pueden ser medidos experimentalmente in vivo.

Resumen

Estabilidad de la proteína influye en muchos aspectos de la biología, y la medición de la cinética de eliminación de proteínas puede proporcionar importantes conocimientos sobre los sistemas biológicos. En experimentos FDAP, la liquidación de las proteínas dentro de los organismos vivos se puede medir. Una proteína de interés se marca con una proteína fluorescente fotoconvertible, expresada in vivo y photoconverted, y la disminución en la señal de photoconverted lo largo del tiempo se controla. Los datos se ajusta entonces con un modelo de espacio libre apropiado para determinar la vida media de la proteína. Es importante destacar que la cinética de remoción de las poblaciones de proteínas en los diferentes compartimentos del organismo pueden ser examinados por separado mediante la aplicación de máscaras compartimentales. Este enfoque ha sido utilizado para determinar la vida media intra y extracelulares de las proteínas de señalización secretadas durante el desarrollo de pez cebra. Aquí se describe un protocolo para experimentos FDAP en embriones de pez cebra. Debería ser posible utilizar FDAP para determinar la cinética de remoción decualquier proteína taggable en cualquier organismo ópticamente accesible.

Introducción

Los niveles de proteínas en células y organismos están determinadas por sus tasas de producción y el aclaramiento. Proteínas vidas medias pueden variar desde minutos a días ^1-4. En muchos sistemas biológicos, la estabilización o eliminación de proteínas clave tiene efectos importantes sobre la actividad celular. Se requiere la modulación de la estabilidad de la proteína intracelular para la progresión del ciclo celular ^5,6, la señalización del desarrollo ^7-9, apoptosis ^10, y la función normal y el mantenimiento de las neuronas ^11,12. Estabilidad de la proteína extracelular afecta a la distribución y la disponibil....

Protocolo

1. Generación de un fotoconvertible Fusión Construir y Inyectar dechorionated embriones de pez cebra

1. Generar una construcción funcional que contiene la proteína de interés fusionada a una proteína fotoconvertible de verde a rojo (ver Discusión), a continuación, utilizar la transcripción in vitro para generar cubiertas de ARNm que codifica la proteína de fusión como en Müller et al., 2012 ^19.
2. Utilice pronasa para eliminar los chorions de aproximadamente 30 embriones de pez cebra en la etapa de una célula. Alternativamente, dechorionate manualmente embriones utilizando fórceps ^28.
   Nota: ....

Resultados

FDAP se ha utilizado para determinar la vida media de las proteínas de señalización extracelular en embriones de pez cebra ^19. Una de estas proteínas, estrabismo, induce la expresión de genes mesendodermal durante la embriogénesis ^34. Estrabismo-Dendra2 activa la expresión de genes mesendodermal en niveles similares a untagged Estrabismo, como se demuestra por QRT-PCR y en ensayos de hibridación in situ ^19. Los embriones se co-inyectados con Alexa488-dextrano y ARNm que.......

Discusión

El éxito de un experimento FDAP se basa en la generación de una proteína de fusión fotoconvertible funcional. Etiquetado de una proteína puede afectar a su actividad biológica y / o propiedades biofísicas, incluyendo su localización, la solubilidad y la estabilidad ^36-41. Estar preparado para probar la actividad de varias construcciones de fusión diferentes con el fin de encontrar uno que es activo. Hemos encontrado que el cambio de la posición de la proteína fotoconvertible relación a la proteína de interés .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
PyFDAP (descargar desde el siguiente sitio web: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)			Instale y opere siguiendo las instrucciones proporcionadas en el sitio web de PyFDAP; PyFDAP es compatible con los sistemas operativos Linux, Mac y Windows.
mMessage mMachine Sp6 Kit de transcripción	Life Technologies	AM1340	Para generar ARNm tapado para inyectar en embriones
Conjugado Alexa488-dextran, 3 kDa	Life Technologies	D34682	Coinyectar con ARNm para crear mascarillas intracelulares y extracelulares
Plato de plástico de 6 pocillos	BD Falcon		Incubar embriones en pocillos recubiertos de agarosa hasta que estén listos para el montaje
Medio embrionario			250 mg/L de sal oceánica instantánea, 1  mg/L de azul de metileno en agua de ósmosis inversa ajustada a pH 7 con NaHCO3
Proteasa de Streptomyces griseus	Sigma	P5147	Haga un caldo de 5 mg/ml y utilícelo a 1  mg/ml para decorionar embriones en la etapa unicelular
		Petri de vidrio de 5 cm de diámetro	Para la descorionación de embriones
		vidrio de 200 ml	Para la descorionación de embriones
Aparato			Para la inyección de ARNm y colorante en embriones en la etapa unicelular
Microscopio estereoscópico			Para inyectar y montar embriones
1x Medio de			Diluya la agarosa de bajo punto de fusión y realice imágenes en este medio; receta: solución filtrada de 0,2 mm de 58 mM de NaCl, 0,7 mM de KCl, 0,4 mM de MgSO4, 0,3 mM de CaCl2, 5  mM HEPES pH 7.2
UltraPure agarosa de bajo punto de fusión	Invitrogen	16520-100	Para el montaje de embriones; utilizar a una concentración del 1% en el medio de Danieau: añadir 200 mg a 20 ml de medio de Danieau, calentar en el microondas hasta que se disuelva, luego alícuota 1  ml en tubos de microcentrífuga; Las alícuotas se pueden almacenar a 4 & grados; C, refundido a 70  ° C, y enfriado a 40– 42 ° C cuando esté listo para usar
Pipeta Glass Pasteur	Kimble Chase (via Fisher)	63A53WT	Para el montaje de embriones; flamee la punta para evitar que los bordes dentados dañen los embriones
Sonda			Para posicionar los embriones durante el montaje
Platos con fondo de vidrio	MatTek	P35G-1.5-14-C	Utilice el espesor de cubreobjetos adecuado para su objetivo; el número de pieza que aparece aquí es para el cubreobjetos n.º 1.5
Tubo de 15 ml lleno de ~5 ml de medio embrionario	BD Falcon		Para el enjuague residual de la pipeta Pasteur
Microscopio			Una lámpara de arco de mercurio, 488  Se requiere láser nm, láser de 543 nm y los juegos de filtros adecuados
Etapa			Para mantener los embriones a la temperatura óptima de 28 & grados; C durante el experimento
Software confocal capaz de obtener imágenes			Debe ser capaz de definir múltiples posiciones y obtener imágenes automáticamente de ellas a intervalos definidos
		agua 25X o 40X	Objetivo para la imagen
Objetivo			Objetivo para la fotoconversión
Aceite			inmersión Aceite de inmersión con el mismo índice de refracción que el agua