Grabación simultánea electrofisiológico y micro-inyecciones de agentes inhibitorios en el cerebro de roedores

Resumen

Aquí, creamos una pipeta de vidrio con doble función: inhibición de estructuras cerebrales profundas mediante microinyecciones de fármacos y monitorización en tiempo real de sus efectos mediante registros electrofisiológicos simultáneos.

Resumen

Aquí se describe un método para la construcción de un solo uso "injectrode" utilizando piezas comercialmente accesibles y asequibles. Un sistema de sondeo fue desarrollado que permite la inyección de un medicamento durante la grabación de señales electrofisiológicas de la población neuronal afectada. Este método proporciona una alternativa sencilla y económica a las soluciones comerciales. Una pipeta de vidrio se modificó mediante la combinación con una aguja hipodérmica y un filamento de plata. El injectrode está unido a la bomba microjeringa comercial para la administración de fármacos. Esto resulta en una técnica que proporciona retroalimentación farmacodinámica en tiempo real a través de señales extracelulares de unidades múltiples originarios desde el sitio de administración de fármacos. Como una prueba de concepto, se registró la actividad neuronal del colículo superior provocada por destellos de luz en ratas, concomitantemente con la entrega de medicamentos a través de la injectrode. La capacidad de grabación injectrode permite la caracterización funcional de la injEl sitio de reflexión favoreciendo un control preciso sobre la localización del suministro del fármaco. La aplicación de este método también se extiende mucho más allá de lo que se ha demostrado aquí, como la elección de la sustancia química cargado en el injectrode es vasto, incluyendo rastreo de marcadores para experimentos anatómicos.

Introducción

La inactivación de áreas corticales y núcleos subcorticales es importante en el estudio de las relaciones funcionales entre varias estructuras cerebrales ^2-4. La literatura reciente ha empleado química de pérdida de función o técnicas criogénicas para estudiar el papel de las estructuras cerebrales ^2,5. En lo que se refiere a las microinyecciones farmacológicas, pequeños volúmenes de medicamentos pueden ser administrados en una región del cerebro a una velocidad controlada y reducir al mínimo el daño colateral al tejido circundante ^6,7. Esta técnica se puede utilizar para entregar agonistas específicos, agonistas inversos o antagonistas para estudiar el efecto de diferentes dianas farmacológicas sobre la actividad neuronal. Estos efectos también se pueden estudiar mediante la medición de cambios en las respuestas neuronales desde lugares distantes, lo que permite a los investigadores estudiar las relaciones entre las diferentes estructuras corticales y subcorticales.

Aquí, nos demuestran el montaje de un dispositivo, el injectrode, capaz de boº grabación de señales electrofisiológicas y entregar pequeñas cantidades de drogas en el lugar de destino. Se demuestra las capacidades de este sistema mediante la inyección de GABA, un inhibidor de la actividad neuronal común, en la rata colículo superior. Esta región es sensible a la estimulación visual, que nos permitió utilizar la actividad multiunit evocado visual para confirmar la localización injectrode. La reversibilidad de la inactivación se evaluó por la recuperación de la actividad neuronal normal tras el final de la inyección GABA.

La capacidad de controlar la actividad de varias unidades de la zona de la inyección permite la puesta a punto de las tasas de inyección y los volúmenes necesarios para lograr la respuesta farmacodinámica deseada. Por lo tanto, una ventaja de esta técnica es el potencial de limitar el daño tisular causado por microperfusión, ya que se inyectan los más pequeños volúmenes efectivos. El protocolo propuesto proporciona un método rentable para generar la necessar hardware desechabley para la realización de experimentos donde se desea la administración de fármacos y la grabación de la actividad neuronal local.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense para la Protección de los Animales y de la junta de revisión de Ética de la Universidad de Montreal.

1. Asamblea de la pipeta de grabación por inyección

1. Tire de un capilar de vidrio de aproximadamente 7 cm de largo (1 mm de diámetro exterior) con un extractor pipeta.
2. Romper la punta del capilar y compruebe la abertura con un microscopio óptico. Confirmar que el diámetro interior es de entre 30 micras a 40 micras.
3. Insertar un alambre de plata 7 cm de largo en el capilar de vidrio con aproximadamente 1 cm que sobresale del extremo no ahusada de la pipeta de vidrio.
4. Doble el exceso de filamento ortogonal al capilar de vidrio.
5. Aplicar una gota de adhesivo de plástico flexible en el eje de una aguja hipodérmica 30 G.
6. Inserte una aguja hipodérmica 30 G en la pipeta de vidrio de acuerdo con los esquemas presentados en la Figura 1 .
7. Añadir un segundo recubrimiento de pegamento para asegurar un sellado adecuado de la unión entre la pipeta de vidrio y la aguja hipodérmica.
8. Deja la pipeta para secar con la punta hacia arriba durante aproximadamente 12 horas para asegurar un curado adecuado de la cola. El resultado final se muestra en la Figura 2.

NOTA: Este procedimiento se realiza en experimentos agudos y esterilización de la punta de la pipeta no es necesario.

2. Preparación de los animales

1. Coloque la rata en una caja de la anestesia.
2. Inducir la anestesia utilizando 4% isoflurano por 5 a 10 minutos.
3. Colocar el animal sobre una mesa estereotáxica con el cojín de calefacción y sonda rectal para mantener una temperatura corporal de 37 ° C. Use un cono de la nariz para mantener la anestesia con isoflurano 2%. Asegure la cabeza de la rata utilizando barras de oído y titular de los dientes.
4. Aplicar pomadas o gotas oftálmicas oculares, que incluyen 1% atropina gotas para ayudar en la dilatación de la pupila. Para evitar la sequedad, aplicar lubricante gotas aproximadamente cada 30 min.
5. Afeitarse la cabeza y límpielo con un 10% de povidona-yodo.
6. Para anestesia local, inyectar 0,5 ml de lidocaína al 2% bajo el cuero cabelludo en 2-3 ubicaciones levantando la piel y la inserción de la punta de la aguja.
7. Confirmar nivel adecuado de anestesia mediante la realización de una pizca dedo del pie y la observación de la falta de movimiento. Además, controlar la frecuencia cardíaca para asegurar que está dentro de los valores normales (300 a 400 latidos / min).
8. Incisión en el cuero cabelludo en una línea recta a lo largo de la mediana con una cuchilla de bisturí # 10 para exponer tanto las suturas coronal y sagital.
9. Revela los puntos Lambda y bregma por empujar a un lado el tejido que cubre el cráneo con una espátula quirúrgica.
10. Nivelar el cráneo de modo que las posiciones de bregma y lambda están en el mismo plano.
11. Para establecer el punto de referencia, utilice un dispositivo estereotáxico con un tubo de vidrio montada para configurarlo justo encima Bregma. Este será el "cero" para el antero-posterior y medmediciones ial-laterales coordenadas.
12. Establecer el lugar de interés moviendo el estereotáxica montaje a las coordenadas necesarias, tenga en cuenta las coordenadas estereotáxicas y dibujar un cuadrado alrededor de la zona objetivo que marca donde se realizará la craneotomía.
13. Use un taladro con una broca quirúrgica esterilizada a lo largo del marcado plaza lentamente y sin presión para eliminar lentamente el material óseo. Tenga cuidado de no perforar demasiado tiempo en la misma zona, ya que producirá calor y causar lesiones en la corteza.
14. Cuando el hueso que delimita la craneotomía se ha convertido en lo suficientemente delgada, retire con cuidado la sección craneal con pinzas para exponer la corteza.
15. Irrigar frecuentes la corteza expuesta con líquido cefalorraquídeo artificial para evitar la desecación de los tejidos.
    NOTA: la eliminación mater Dura es innecesario en la rata como la punta de la injectrode es lo suficientemente resistente como para penetrar.

3. Llenar y Montaje del Sistema de Inyección

1. Llenar el5-10 l microjeringa por aspiración con aceite mineral.
2. Llene la aguja hipodérmica con la pipeta de vidrio fijo con una solución de 0,5% Chicago Sky Azul (CSB) y 300 M-γ aminobutírico (GABA) o una solución de lidocaína al 2% con 0,5% CSB ^9. Diluir todas las soluciones con solución salina.
   1. En el caso de una sustancia abundante, llenar utilizando una jeringa regular y utilizar las técnicas habituales de precaución para evitar la formación de burbujas de aire.
   2. En el caso de las sustancias más caras, utilice aceite mineral para llenar el injectrode y el agente químico puede ser introducido por aspiración. Como la diferencia de densidad entre el aceite mineral y el agua es relativamente alta, esta sustancia es un buen candidato para la inyección de soluciones acuosas.
      NOTA: Un colorante puede ser añadido a confirmar la separación entre ambos líquidos.
3. Para llenar la pipeta de inyección, llenar una jeringa de 1 ml con la solución por aspiración y luego inyectar lentamente la soluciónen la pipeta de inyección.
4. Prestar especial atención para detectar fugas en las regiones indicadas en la Figura 1 en muestras de secreciones estas áreas limpias y la observación de fugas mediante la inyección aún más la solución lentamente con la jeringa.
5. Retire la jeringa de 1 ml. Al hacerlo, asegúrese de mantener una ligera presión sobre el émbolo para que el vacío no elimina la solución de la pipeta de inyección.
6. Llene el microjeringa con aceite mineral por aspiración y adjuntarlo firmemente a la pipeta de inyección lleno, a continuación, limpie cuidadosamente cualquier exceso de solución de la injectrode montado con una gasa.
7. Verifique que la punta no está bloqueada mediante la inyección de un volumen muy pequeño, lo suficiente para ver una pequeña formación en la punta de la pipeta de vidrio gota.
8. Monte el injectrode en el sistema microbomba y asegurarse de que está bien fijada.
9. Coloque con cuidado la punta injectrode en las coordenadas de destino y de bajar la punta a la superficie de la corteza.
10. Baje lentamente la injectrOda usando el aparato estereotáxico a la estructura objetivo (colículo superior en este caso) utilizando las coordenadas anatómicas apropiadas.
11. Cubra la corteza expuesta con agar caliente para evitar la desecación de los tejidos.

4. Inyección y inactivación reversible

1. Ajuste la bomba de microinyección para inyectar 400 a 800 nl a 40 nl / min y pulse Ejecutar para iniciar la inyección. Tenga en cuenta que la tasa pico mostrará reducción durante la inyección.
   NOTA: En la configuración experimental, la actividad neuronal se recuperó dentro de una hora después del final de la entrega de GABA. Cualquier dispositivo mecánico calibrado se puede utilizar para aplicar presión en la jeringa la microinyección con el fin de llevar a cabo la inyección.
2. Después de la adquisición de los datos electrofisiológicos, la eutanasia utilizando un método aprobado por la Comunidad de Ética Animal local.

Resultados

La construcción de la injectrode se ilustra en la Figura 1. Un alambre de plata (C) se alimenta a una pipeta de vidrio (D) con una porción de la alambre doblado y que sobresale hacia fuera de la abertura. Una aguja de 30 G (B) se une y se sella a la abertura de la pipeta de vidrio con pegamento. Después de la pipeta se ha llenado con la sustancia de la inyección, una jeringa micro de vidrio (A) está unido a la aguja. Es importante que haya un buen cierre hermético, donde la jeringa micro conecta con la ...

Discusión

El protocolo propuesto fue diseñado para resolver los retos derivados de los actuales métodos de inactivación reversible. En concreto, este proyecto destinada a perfeccionar los métodos utilizados para microinyecciones químicas de las sustancias que modulan la actividad neuronal, particularmente en las estructuras profundas del cerebro. Un reto técnico que emerge de este tipo de configuración es la necesidad de ambas sondas a ser colocalized en el mismo espacio restringido in vivo a fin de obtener grabaciones p...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bomba de inyección (UltraMicroPump III)	WPI
Consola de inyección (Micro4 Controller)	WPI	#SYS-MICRO4
Jeringa Hamilton	Hamliton	(80301) 701LT 10 µ L SYR	Jeringas entre 5 y 10 μ l
Adhesivo plástico flexible	usado Lepage	393915	La forma de gel es más fácil de aplicar al eje del 30  G Aguja hipodérmica que forma un sello impermeable cuando está seca.
Pipetas de vidrio	WPI	#TW100F-4	Pared fina, 1  mm OD, 0,75  mm ID con pipetas de filamento utilizadas
720 Tirador de pipetas de aguja	Kopf	720
Alambre de plata	A-M Systems, Inc.	782500	Desnudo 0.010"