Artículo de método

Evaluación del selectivo ARNm traducción en células de mamífero por polisoma perfiles

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DOI:

10.3791/52295

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28 de octubre de 2014

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1Apoptosis Research Centre, Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute and Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 2Montreal Neurological Institute, 3Apoptosis Research Centre, Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute and Department of Pediatrics, University of Ottawa

En este artículo

Resumen

La capacidad de las células para adaptarse al estrés es crucial para su supervivencia. La regulación de la traducción del ARNm es una de esas estrategias de adaptación, que proporciona una regulación rápida del proteoma. Aquí, proporcionamos un protocolo estandarizado de perfiles de polisomas para identificar ARNm específicos que se traducen selectivamente en condiciones de estrés.

Resumen

Regulación de la síntesis de proteínas representa un punto de control clave en la respuesta celular al estrés. En particular, los elementos reguladores de ARN discreto se muestran para permitir a la traducción selectiva de mRNAs específicos, que típicamente codifican para las proteínas requeridas para una respuesta de estrés particular. La identificación de estos mRNAs, así como la caracterización de los mecanismos reguladores responsables de la traducción selectiva ha estado en la vanguardia de la biología molecular durante algún tiempo. Perfiles de polisomas es un método piedra angular en estos estudios. El objetivo de los perfiles de polisomas es capturar la traducción del ARNm mediante la inmovilización de los ribosomas traducen activamente en diferentes transcripciones y separar los polirribosomas resultantes por ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa, lo que permite una distinción entre las transcripciones altamente traducidos y mal traducido queridos. Estos pueden ser caracterizados adicionalmente por métodos tradicionales bioquímicos y de biología molecular. Es importante destacar que la combinación de polysome perfiles con enfoques genómicos de alto rendimiento permite un análisis a gran escala de la regulación de traducción.

Introducción

Regulación de la síntesis de proteínas (traducción) es un proceso celular clave que está íntimamente ligada a la supervivencia celular. Dado que la traducción consume más del 50% de la energía de la célula, no es sorprendente que la traducción está estrechamente regulada y que las perturbaciones en la traducción no se toleran bien. Por el contrario, muchos procesos celulares aberrantes que requieren maquinaria de traducción y la salida de la traducción (es decir proteoma) tienen que ser modificados. Esto es a menudo el caso en varios estados de respuesta al estrés y la enfermedad, y es, probablemente, el mejor ejemplo en el cáncer. Una ventaja clave de control de la traducción es la capacidad de las células para reprogramar rápidamente la salida de proteínas en respuesta a diversos disparadores externos e internos, por lo tanto mecanismo de ajuste fino que inclina la balanza entre la supervivencia celular y la muerte 1.

Dos aspectos de la traducción de control son particularmente interesantes; comprensión de la naturaleza de la mec reguladorahanism (s) y elementos de control que permiten la traducción específica, y la identificación de mRNAs específicos y sus productos de proteínas que participan en la respuesta celular al gatillo particular que provocó traducción selectiva en el primer lugar. Perfiles de polisomas es una técnica que permite el estudio eficaz de ambos procesos.

El objetivo general de la técnica de perfiles de polisomas es estudiar y cuantificar el estado de la traducción de ARNm específicos bajo diferentes condiciones celulares. El principio de la técnica es captar la traducción del ARNm por '' congelación '' Traducción activamente ribosomas en diferentes transcripciones y separar los polirribosomas resultantes por ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa, permitiendo así una distinción entre las transcripciones altamente traducidas (obligado por varios ribosomas) y los mal traducido (unida por uno o dos ribosomas). En este protocolo particular, el antibiótico cicloheximida que se une a la60S subunidad ribosomal y bloquea la liberación de desacetilada tRNA del sitio E ribosoma 2, se utiliza para inhibir la translocación del ribosoma y estancar los ribosomas ARNm de traducción. Sin embargo, otros agentes de bloqueo tales como emetina que también bloquea la traducción de elongación 3, puede ser utilizado.

A diferencia de la transferencia de western y 35 S-metionina técnicas de etiquetado que miden la salida final del proceso de traducción, polisomas perfilado tiene la ventaja de medir los ribosomas asociación con mRNAs activamente traducidas, permitiendo así un estudio más detallado de los mecanismos de traducción en condiciones diferentes. Por lo tanto, la técnica se puede adaptar fácilmente para estudiar específicamente los diferentes modos de traducción 4-6, proteínas factores involucrados en la regulación de la traducción 7-9, condiciones de estrés que afectan a la síntesis de proteínas 1,10,11 o los efectos de las estructuras de ARNm tales como IRES o aguas arriba marcos de lectura abiertos en sintetizador de proteínasESIS 12-14. Hoy en día, polisoma aplicaciones de perfiles son aún más amplia con el uso de microarrays de DNA 15 o secuenciación de próxima generación 16,17 analizar polisomas asociados-ARNm.

Protocolo

NOTA: Una nota sobre el trabajo con ARN: Tome las precauciones estándar para la protección contra la degradación del ARN por RNasas. Utilice guantes, puntas de pipeta de barrera, plasticware RNasa libre de productos químicos y en todos los pasos del protocolo. Utilice ultrapura o agua tratada con DEPC para todas las soluciones. Descontaminar las superficies sospechosas con solución de inactivación de RNasa siguiendo el protocolo del fabricante.

1. Preparación de soluciones.

  1. Preparar 500 ml de solución básica (NaCl 0,3 M;. 15 mM MgCl 2 6H 2 O; 15 mM Tris-HCl, pH 7,4). Mezclar utilizando una barra de agitación hasta que la solución es clara y pasar a través de un filtro de 0,45 micras. Guarde a temperatura ambiente.
  2. Preparar 10 y 50% de soluciones de sacarosa y 60% de solución de Chase como sigue:
    1. Para 10% Solución de sucrosa (w / v), en un tubo de centrífuga de 50 ml, añadir 5 g de sacarosa y rellenar hasta 50 ml con solución básica. Para 50% Solución de sucrosa (w / v), en un tubo de centrífuga de 50 ml add 25 g de sacarosa y rellenar hasta 50 ml con solución básica.
    2. Para 60% (w / v) Solución Chase, en un tubo de centrífuga de 50 ml añadir 30 g de sacarosa y rellenar hasta 50 ml con solución básica. Añadir 100 l de solución de azul de bromofenol saturado (azul de bromofenol al añadir agua hasta que no se disuelva más; centrífuga para sedimentar el polvo no disuelto) a la solución chase 60%. Mezclar utilizando un vórtice y verificar la disolución completa.
    3. Soluciones se almacenan a 4 ° C hasta que se necesite.
  3. Preparar tampón de lisis de ARN. Preparar esta solución tampón fresca en el día del experimento. Preparar 500 l de tampón de lisis de ARN para cada muestra. Para 1 ml de solución básica añadir 10 l de Triton X-100 (1% [v / v] final), 1 l de 100 mg / ml de cicloheximida en DMSO (CHX, 0,1 mg / ml final) y 3,5 l RNasin (140 U / ml). Mezclar utilizando un vórtice. Mantener en hielo.
    NOTA: La cicloheximida es altamente tóxico y puede causar mutaciones. Evite el contacto con la piel y la inhalación. Para evitar la manipulación de la forma de polvo con demasiada frecuencia, de preparaciónson una cantidad mayor de 100 mg / ml en DMSO, alícuota y mantener a -80 ° C para almacenamiento a largo plazo. Mantenga madre de trabajo a -20 ° C.
  4. El día del experimento, se preparan soluciones de sacarosa + CHX mediante la adición de CHX (concentración final de 0,1 mg / ml) para el volumen deseado de 10% y solución de sacarosa al 50% (~ 7 ml de cada solución por gradiente).

2. Preparación de sacarosa gradiente El uso de un Hacedor Automatizado Gradiente

  1. Gire el fabricante de gradiente '' ON '' y nivelar la placa que contendrá el gradientes (criticalstep!) Haga clic en '' Hecho '' cuando se nivela la placa.
  2. Seleccione en el menú del programa de gradiente que se ejecute:
    1. Pulse '' menú 'GRADUADO' y seleccione '' LISTA ''.
    2. Seleccione "SW41".
    3. Desplácese por la lista y seleccionar el ''10 - 50% gradiente - 11 pasos "programa" por la prensación en el botón '' RUN ''.
  3. Coloque un tubo cónico de ultracentrífuga (SW-41 tubo, 14 x 89 mm) en el Bloque marcador y utilice el marcador de tubo de multa prevista para trazar una marca en el tubo a lo largo del paso superior del bloque del marcador. Coloque los tubos en un rack de montaje en una superficie estable.
    NOTA: Esta marca será la guía de llenado para todas las ocasiones las soluciones de sacarosa 10 y 50%.
  4. Fije la cánula dos proporcionado a dos jeringas de 10 ml y lavar por la pipeta hacia arriba y hacia abajo con agua destilada caliente que contiene solución inactivación de RNasa. Asegúrese de retirar todos los restos de agua después.
  5. Llenar una de las jeringas con 10% de sacarosa + CHX e insertar la cánula en la parte inferior del tubo de ultracentrífuga. Dispensar suavemente solución al 10% de sacarosa hasta que se va un poco más allá de la marca hecha en el tubo.
    NOTA: Evite hacer burbujas. Si se forman burbujas, golpee suavemente el tubo para desplazarlos.
  6. Llene la jeringa con otro 50% de sacarosa + CHX, limpie el líquido adicional de descansocon una toallita y suavemente inserte la cánula en la parte inferior del tubo de ultracentrífuga. Dispensar suavemente la solución de sacarosa al 50% hasta alcanzar exactamente la marca. De forma rápida y sin problemas retire la cánula.
    NOTA: El 10% de sacarosa debería aumentar en el tubo y formar un menisco en la parte superior. Si no, añadir más solución de sacarosa al 10% en la superficie.
  7. Inserte la tapa proporcionada por la inclinación del tubo de ultracentrífuga ligeramente y el desplazamiento de todas las burbujas de aire. Retire el exceso de líquido en el depósito de la tapa con una micropipeta.
  8. Limpie el exceso de líquido a lo largo de la pared del tubo y el lugar en la placa de fabricante de gradiente.
  9. Pulse el botón '' RUN ''.
    NOTA: La placa se inclinará en el ángulo especificado, una pausa de 5 segundos y las rotaciones para formar el gradiente comenzará.
  10. Cuando se haya completado la formación del gradiente (unos 2 minutos, el equipo emitirá un pitido), retire suavemente el ultracentrifugadora (s), lugar en el estante y quitar rápidamente la gorra en un movimiento hacia arriba para evitar molestar a la gradient.
  11. Mantenga gradiente (s) en el hielo. No molestar! Como alternativa, los gradientes de mantener durante toda la noche a 4 ° C.
  12. Como alternativa, utilice una máquina de gradiente de dos cámaras para que los gradientes de la siguiente manera:
    1. Tubería de enjuague y el fabricante de gradiente con una solución de RNasa inactivación y agua libre de RNasa.
    2. Añadir 5 ml de 50% de sacarosa + CHX a cámara proximal del fabricante de gradiente y asegurarse de que se elimina todo el aire entre las dos cámaras.
    3. Añadir 5 ml de sacarosa al 10% + CHX a la cámara distal del fabricante de gradiente.
    4. Añadir 0,5 ml de 50% de sacarosa + CHX al fondo de un tubo de centrífuga cónico (SW-41 tubo, 14 x 89 mm) y el lugar en el soporte de tubo.
    5. Encienda el agitador colocado en la cámara proximal, abierto las ventanillas gallos y el gradiente de depósito a la velocidad se ajusta en "3" (alrededor de 1 ml / min).
    6. Lugar gradiente (s) en el hielo. No molestar.
      NOTA: Los degradados se pueden mantener durante toda la noche a 4 ° C.

3. Lisis Celular y ultracentrifugación.

  1. Coloque SW-41 rotor y baldes a 4 ° C y centrifugar ajustado a 4 ° C.
    NOTA: El procedimiento de la lisis celular se optimiza para dos subconfluent 150 mm (~ 70-80% de confluencia) placas de células HEK293 por gradiente y los volúmenes utilizados puede ser necesario ajustar para diferentes líneas celulares.
  2. Células de la placa en la densidad celular apropiada en el medio de crecimiento por lo menos 24 horas antes de la lisis.
  3. Preparar una parte alícuota (20 ml por placa de 150 mm) de medio de crecimiento que contiene 0,1 mg / ml CHX.
  4. Se incuban las células en CHX + medios de comunicación (20 ml por 150 mm de placa) durante 3 min a 37 ° C / 5% de CO 2 para detener y estabilizar polisomas.
  5. Trabajando rápidamente, los medios de aspirado de las placas, placas de lugar en el hielo y lavar las células una vez con 10 ml de hielo frío buffer fosfato salino (PBS: NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4) suplementado con CHX (concentración final de 0,1 mg / ml) con cuidado de la pipeta lentamente por el side de la pared de plato para minimizar la elevación de la monocapa celular.
  6. Aspirar PBS y añadir un adicional de 10 ml de PBS + CHX a cada placa, raspan las células con un levantador de células y transfieren el volumen total de las dos placas a una centrífuga tubo de 50 ml en hielo. Conservar 1 ml de suspensión celular en un tubo de microcentrífuga en hielo durante el análisis de proteínas aguas abajo.
  7. Centrifugar el tubo 50 ml de células a 300 xg a 4 ° C durante 10 min.
  8. Retire todo el PBS y resuspender el sedimento en 500 l de tampón de lisis frío hielo ARN.
  9. Transferir la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
  10. Pipetear arriba y abajo para lisar las células e incubar en hielo durante 10 min con agitación en vórtex ocasional.
  11. Se centrifuga a 2000 × g a 4 ° C durante 5 min para sedimentar los núcleos.
  12. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml.
  13. Centrifugar a 17.000 xg a 4 ° C durante 5 min para sedimentar los restos celulares.
  14. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml y 2 l utilizar para medirdensidad óptica a 260 nm (tampón de lisis uso como blanco).
  15. Retire 50 l (10% del total) de cada muestra para el análisis de RNA total. NOTA lisado se puede almacenar a -80 ° C hasta que se necesite.
  16. Cargar suavemente unidades iguales A260 en cada gradientes de sacarosa (10 min OD, OD óptimas 25, en un volumen máximo de 500 l;. Diluir lisado concentrada con tampón de lisis adicional si es necesario).
  17. Asegurarse de gradientes se encuentran dentro de 0,1 g de uno al otro antes de la ultracentrifugación.
  18. Gradientes de centrifugar a 39.000 rpm (260.343 xg) durante 1,5 horas a 4 ° C.
  19. Durante spindown mantener freno del rotor en y apagarlo durante la deceleración cuando alcanza 1.000 rpm.
    NOTA: Este paso reduce al mínimo cualquier perturbación de los gradientes causados ​​por los cambios bruscos en la aceleración como las cabezas de cepillo en contacto con el rotor durante el frenado.

4. Gradiente Sistema Fraccionamiento configuración del instrumento.

  1. Puesta en marcha del instrumento y en blanco los spectrophotometer con agua como sigue:
    1. A su vez en los componentes y deje que la lámpara se caliente durante al menos 15 min.
    2. Asegúrese de colector de fracciones se establece en el método 'polisoma' (icono de la carpeta de prensa dos veces; retorno flecha dos veces para volver a la pantalla principal).
    3. Asegúrese de que la válvula en el colector de fracciones se ajusta a los residuos (flecha que apunta a icono de la papelera). Coloque un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contiene agua destilada bajo el tubo de recogida de residuos.
    4. Seleccione los siguientes ajustes en el registrador gráfico: Conjunto de sensibilidad a marcar 'LÁMPARA Y ÓPTICA SET'; establecer Ruido interruptor de filtro para '1.5'; set de línea de separación de pico en 'OFF'; configurar la marcación rápida para gráficos para '30 cm / hr "(5 cm / 10 min); Ajuste de línea fija de referencia (en la parte superior de la unidad espectrofotómetro) a 'MAX OPEN'.
      NOTA: Opcional: Un software grabador digital se puede utilizar en lugar del registrador de gráficos. En el equipo, haga clic en 'Inicio'. Una ventana se abrirá adquisición: bajo ªmenú Opciones de correos, gráficos Pausa desmarque. En Escala, establezca límites del gráfico a -10 y 100 (se puede cambiar sobre la marcha durante la marcha). Haga clic en el botón Guardar para crear un nuevo archivo y grabar la carrera.
    5. Coloque la jeringa y el barril en la bomba y apretar en su lugar (uso proporcionado tornillos y llave Allen).
      NOTA: No apriete demasiado.
    6. Llene la jeringa con la solución de Chase mediante el uso de la '' REV '' comando en velocidad rápida. Coloque la bomba en posición vertical y perseguir el aire a través del tubo con el comando '' ADELANTE ''. Utilice únicamente RAPID para esta función y lavados.
    7. Instale un tubo de ultracentrífuga lleno de agua libre de RNasa.
    8. Pierce el tubo de ultracentrífuga con la cánula hasta que las dos marcas negras son visibles (el agujero de dispensación está situado entre estas dos marcas) y empezar bomba de jeringa en '' Manual '' a 6,0 ml / min.
    9. A medida que el agua pasa a través de la celda de flujo (cuando csolución hase llena 1/3 del tubo), la velocidad de cambio a variable y ajustado a 1,0 ml / min.
    10. A una velocidad de flujo de 1,0 ml / min, ajuste la línea de base Ajuste de línea en el espectrofotómetro hasta que la tensión en el gráfico está en cero (+/- 0,5 unidades).
      NOTA: Observe la salida de agua desde el tubo de residuos en el matraz Erlenmeyer.
    11. Ajuste la sensibilidad deseada para '0.5' o '1.0' AU.
      NOTA: 1.0 UA funciona mejor para 10 unidades de DO en un gradiente de 10 ml. Si OD es inferior a 10, '0.5' sensibilidad se puede utilizar para mejorar la señal.
    12. Pulse el botón Auto Línea de base y ajustar la configuración de la marca de 10% en el registrador de gráficos de línea de base girando el dial de compensación Grabadora (opcional si se utiliza grabadora digital).
    13. Una vez que se consigue una línea de base estable, ponga el interruptor de la bomba en 'OFF' y el dial de velocidad Gráfico 60 cm / hora si se utiliza registrador gráfico analógico o "OFF" si el uso de la grabadora digital.
    14. Recuperar la solución de la Caza por la conmutación de la bomba para 'REPosición V '(si es necesario se puede aumentar la velocidad de flujo de nuevo a 6,0 ml / min ... NO USE RAPID) hasta que se alcance la primera marca en la cánula de perforación.
    15. Retire el tubo de centrífuga y perseguir las burbujas de aire dentro de la cánula mediante la ejecución de un poco de la solución de Chase a través de él. Limpie el limpio etapa de perforación.
      NOTA: Un poco de agua residual puede escaparse de la celda de flujo.

5. Gradiente Fraccionamiento y Recogida de Muestras.

  1. Instalar y perforar el tubo de centrífuga que contiene el gradiente de sacarosa.
  2. Coloque once 2 ml tubos de microcentrífuga en las posiciones de la bandeja de colector de fracciones 1-11 de tal manera que los tapones no sobresalen hacia arriba. Reemplazar '' tubo # 1 '' por ahora con un '' tubo de residuos '' para recoger el líquido que queda en el tubo colector.
  3. Ajuste el dial de control de la bomba a "Manual" y el caudal de la bomba de jeringa a '6,0 ml / min'
  4. Pulse el icono de 'Play' en el colector de fracciones. Tan pronto como el brazo alcanza el primer tubo, presione el botón '' pausa '' (esto colocará el brazo y abrir la válvula de dispensación de fracción).
  5. Arranque la bomba con el comando '' ADELANTE '' y monitorear Gráfico registrador de pluma. Cuando empieza desviar hacia arriba (lo que indica que la muestra pasa a través de la celda de flujo del espectrofotómetro), reemplazar rápidamente '', tubo de residuos '' con '' tubo # 1 ''.
  6. Cuando se recoge la primera gota, cambiar rápidamente a los comandos 'de arranque / parada a distancia', '' Variable (1,0 ml / min) '' y presione '' Play '' icono.
    NOTA: La bomba está ahora controlado por la interfaz de colector de fracciones y fracciones de 1 ml se recogerá cada min.
  7. A partir de ahora, van a aparecer lecturas A260 en la interfaz de grabador digital (o el recorde gráfico analógicor). Asegúrese de que el '' Record '' se pulsa el botón en el software!
  8. Después de que la solución de Chase azul entra en el tubo de recogida o el último tubo (normalmente tubo 11), pulse el icono 'Stop'.
    NOTA: La válvula de distribución debe cambiar a la válvula de residuos.
  9. Mantenga fracciones en hielo hasta que todos los gradientes se han fraccionado. Al final de las fracciones de día se puede almacenar a -80 ° C antes de la proteína o el aislamiento de ARN. Si se requiere el análisis de proteínas y ARN, dividir cada fracción en un medio (500 l cada uno para análisis de proteínas y ARN).

6. Lavar

NOTA: (este es un paso opcional que realizarse sólo si múltiples gradientes se recogen).

  1. Sumergir el tubo de residuos en el matraz Erlenmeyer que contiene ~ 50 ml de agua ultrapura y revertir la bomba con un caudal de 6 ml / min.
  2. Pare la bomba cuando la solución de Chase alcance la primera marca on la cánula de perforación.
  3. Quitar el tubo de centrífuga, perseguir el aire fuera de la cánula y limpiar la etapa de perforación.
    NOTA: Un poco de agua residual puede escaparse de la celda de flujo.
  4. Repita el procedimiento de fraccionamiento de partida en el paso 5.1.

7. hasta final limpio.

  1. Desconectar el tubo de la bomba desde la parte inferior del perforador y la bomba de la solución de Chase en un tubo de centrífuga de 50 ml utilizando la configuración de flujo rápido. Guarde la solución de Chase a 4 ° C, ya que se puede reutilizar.
  2. Conectar tubo de la bomba a un sistema de tubos de 3 vías y cerrar la válvula que conduce a la jeringa. Conectar un tubo a una jeringa de 50 ml lleno de agua destilada y el otro tubo a la base del perforador.
  3. Instale el tubo de ultracentrífuga utilizado para la etapa de corte y pasar por lo menos 50 ml de agua destilada a través del espectrofotómetro y tubo de recogida (interruptor de menú recogida en la interfaz haciendo clic en el '' Start / Pausa '' icono).
  4. Retire el tubo, (uso llave Allen para quitar tornillos) jeringa y todos los demás componentes extraíbles y lavar a fondo con agua tibia y luego enjuague con agua ultrapura.
    NOTA: Tenga especial cuidado al lavar el émbolo, barril, tubos y perforación cánula.
    NOTA: Manejar la jeringa barril de vidrio con cuidado! Guarde todos los componentes lejos del polvo.
  5. Limpie el fondo de la celda de flujo con un tejido suave humedecido con agua destilada. Limpie la bandeja del colector de fracciones y cualquier otra área donde la sacarosa puede haber sido derramados.

8. Aislamiento de ARN a partir de sacarosa fracciones.

  1. Preparar 50 l de solución de proteinasa K por cada 1 ml de la fracción de sacarosa (37,5 l 10% de SDS, 7,5 l 0,5 M EDTA, 1 l Glycoblue, 4 l de 20 mg / ml de proteinasa K).
  2. En tubo de fondo plano 2 ml, se incuba 1 ml fracción de sacarosa con 50 l de solución de proteinasa K a 55 ° Cdurante 1 hora (si usa 500 fracciones mu l ajustar el volumen de la solución de proteinasa K en consecuencia).
  3. Añadir un volumen igual de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (125: 24: 1, preferiblemente ácido (pH 4,5) para minimizar la contaminación de ADN) a las fracciones de sacarosa.
    NOTA: Agregar un extra de 200 l de cloroformo para fracciones 7-10, ya que son más pesados ​​y fases podrían quedar invertida.
    NOTA: fenol / cloroformo puede causar quemaduras en contacto y la inhalación. Use bata de laboratorio, gafas de seguridad, y el uso de una campana de humos.
  4. Vortex ~ 30 seg y se centrifuga a velocidad máxima durante 5 min a temperatura ambiente.
  5. Retire ~ 80-90% de fase acuosa (no tocar la interfase que podrían contener ADN genómico) y el lugar en el nuevo tubo.
  6. Añadir un volumen igual de cloroformo y repita el paso 8.4.
  7. Retire fase acuosa teniendo cuidado de evitar la interfase.
  8. Añadir 01:10 volumen de 3 M de acetato de sodio, pH 5,2 (alternativamente, el acetato de amonio 5 M se puede utilizar).
  9. Añadir 1,5 volúmenes de frío, absoluetanol y te vórtice durante 15 segundos.
  10. Precipitar durante la noche a -20 ° C (o 1 hora a -80 ° C, si en un apuro).
    NOTA: Las muestras se pueden dejar a -20 ° C durante más tiempo si es necesario.
  11. Centrifugar a máxima velocidad durante 30 min a 4 ° C.
  12. Lavar el sedimento con 1 ml de etanol al 70% libre de RNasa enfriada.
  13. Deje secar al aire el pellet y resuspender en 20 l de agua libre de RNasa.
  14. Cuantificar el ARN total por espectrofotometría para asegurar rendimiento y la pureza (basado en A260 relación / 280) adecuada y proceder a análisis estándar RT-qPCR 14 usando volúmenes iguales de cada fracción y cebadores de PCR específicos para el ARNm (s) de interés.

9. aislamiento de proteínas a partir de sacarosa fracciones.

  1. Además de ARN, las proteínas pueden ser aislados e identificados en polisomas fracciones individuales. Utilice uno de los muchos excelentes protocolos disponibles para el aislamiento de proteínas, por ejemplo, 18.

Resultados

Recientemente hemos descrito un nuevo papel para el supresor de tumor PDCD4 como un inhibidor de la traducción selectiva de mRNAs que codifican inhibidores apoptóticos XIAP y Bcl-xL IRES-12 que alberga. Perfiles de polisomas era una técnica clave para demostrar la participación específica de PDCD4 en la traducción mediada por IRES-. Células HEK293 se transfectaron transitoriamente para agotar los niveles endógenos de PDCD4 (Figura 1A) y después se sometieron a análisis del perfil de polisomas. Hemos observado que la reducción de los niveles de PDCD4 no afectó la traducción celular global, a juzgar por la falta de cambios en el perfil de polisomas cuando se comparan siCTRL y siPDCD4 células tratadas (Figura 1B). Del mismo modo, polisomas distribución de variante no IRES de XIAP 19 se mantuvo sin cambios entre las células tratadas y no tratadas (Figura 1C). En contraste, polisoma distribución de los ARNm dos IRES-albergan, XIAP y Bcl-XL, se modificó significativamente. En ausencia de PDCD4 la distribución de estas dos mRNAs se desplaza en ribopolysomes pesados ​​(Figura 1D, E). Como esto no se acompaña de cambios en los niveles de estado estacionario de XIAP y Bcl-XL de mRNA (Figura 1F) Estos resultados demuestran una mayor traducción de XIAP y Bcl-XL en células con niveles reducidos PDCD4, que fue confirmado por Western Blot (Figura 1G).

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Figura 1:. Perfiles de polisomas PDCD4 identifica como inhibidor selectivo de la traducción XIAP y Bcl-xL (A) HEK293 células fueron tratadas con PDCD4 siRNA o control (CTRL), no la orientación siRNA, se lisaron y se sometieron a análisis de transferencia de Western con anti-PDCD4 y anticuerpos antinucleolina para verificar el grado de PDCD4 knock-down. (B) PDCD4 fue derribado como en (A) ylisados ​​celulares se sometieron a polisomas perfilado. Polisomas perfil representativo se muestra en el panel superior; distribución de la XIAP no IRES (C), Bcl-XL (D), y XIAP IRES (E) mRNAs relativos a la de GAPDH se muestra como el porcentaje de mRNA total (% ARNm) en cada fracción. (F) Steady los niveles de mRNA -Estado se midieron por RT-qPCR en PDCD4 siRNA o control (CTRL) siRNA células tratadas. (G) Los lisados ​​de (A) también se sometieron a análisis de Western blot con anti-XIAP, anti-Bcl-xL, y anticuerpos anti-nucleolina. (NB. Los datos presentados en la Figura 1 se publicaron originalmente en 12) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Discusión

Perfilado polysomal es una técnica poderosa que permite la cuantificación del estado de la traducción de las transcripciones específicas bajo diferentes condiciones de tratamiento. Es una técnica muy sencilla, en principio, sin embargo, requiere varios pasos de ejecución, algunos de los cuales son críticos para la producción de buenos perfiles de polisomas. Estos pasos clave son: 1) el uso de productos químicos de RNasa libre y utensilios de plástico, 2) la preparación de buenos gradientes de sacarosa (en nuestra experiencia de un 10-50% gradientes de sacarosa funcionan mejor para resolver de manera eficiente 40 / 60S subunidades y los ARNm con los ribosomas unidos), y 3 ) utilizando células que están creciendo de manera exponencial y no más del 80% de confluencia con el fin de capturar las tasas más altas de traducción. Este último paso debe ser tenido en cuenta a la hora de hacer los tratamientos con células largas, como la caída de genes o sobreexpresión, por lo que la cantidad de células a la placa estará en función de cuánto serán las células confluentes en el punto final.

En los resultados presented aquí, polisomas análisis del perfil era un instrumento importante para evaluar el papel PDCD4 en la regulación de la traducción de los IRES-albergan los ARNm de XIAP y Bcl-XL 12. El hecho de que no se observó ningún cambio en los perfiles de polisomas generales sobre PDCD4 knock-down (Figura 1B) permitió concluir que PDCD4 no perjudicó la traducción celular global bajo las condiciones del experimento. A continuación utiliza el análisis de RT-qPCR para determinar la distribución de la XIAP y Bcl-xL mRNAs en células tratadas con siRNAs PDCD4 o de control. qPCR es un método de elección para el análisis de perfiles de polisomas, en contraposición a la norma RT-PCR o transferencia de Northern, ya que permite una cuantitativa en lugar de análisis semi-cuantitativo de la distribución de ARNm y para la detección de cambios sutiles en la eficiencia de traducción entre los tratamientos. Usando esta técnica, hemos sido capaces de demostrar que la distribución de los XIAP y Bcl-XL ARNm (expresado como un porcentaje del total de ARNm diana a través de la gradient) se cambió significativamente en polirribosomas pesados ​​(mRNAs con un gran número de ribosomas asociados con ellos) después PDCD4 ronda hacia abajo (Figura 1D, E), lo que indica un aumento en la traducción de estos mRNAs. Esto se confirmó además por un incremento en XIAP y Bcl-XL niveles de proteína, pero no en sus niveles de ARN de estado estable (Figura 1F, G). Es importante destacar que la distribución de polisomas de la variante no IRES de XIAP permaneció sin cambios entre las células tratadas y no tratadas (Figura 1C). Alternativamente, la eficiencia de traducción podría ser presentado como una relación de contenido de ARNm en polisomas (normalmente fracciones 5 a 10) versus monosomas (normalmente fracciones 2 a 4) 14.

El uso de los controles en el protocolo es importante en la validación de perfiles de polisomas cualquier resultado, como picos observados a partir de las lecturas de absorbancia a 254 nm no pueden por sí mismos ser atribuidos a ARN ribosomal (detergentes, tales como Triton X-100 absorben fuertemente en esta región del espectro y puede oscurecer 40 / 60S picos en la parte superior del gradiente). Gradientes blanco sin lisado y / o con tampón de lisado deben ejecutarse para determinar la contribución relativa de los tampones para la absorbancia a 254 nm. Artefactual estructuras de orden superior también pueden dar lugar a interpretaciones erróneas de polisomas en los que hay, de hecho, ninguno (por ejemplo, "pseudo-polisomas" 20). Secuestrantes de magnesio (utilizado durante todo el procedimiento para estabilizar los ribosomas 80S) con el EDTA quelante de cationes divalentes añadidos a los lisados ​​y al tampón de gradiente (20 mM durante 15 min) hará que la separación del ribosoma en sus pequeños componentes (40S) y grandes (60S subunidades). Por lo tanto, si picos de absorbancia registrados a 260 nm son de hecho polisomas, el tratamiento EDTA colapsará el perfil tal que se observó un único máximo cerca de la parte superior del gradiente que corresponde a liberar el ARNm y las unidades ribosómicas (datos no presentados). Coincidentecon el colapso inducido por EDTA-del perfil, todos los objetivos específicos analizados por qPCR ahora debería hallarse en la parte superior del gradiente.

El número de ribosomas asociados con un mRNA no siempre es un indicador de la eficiencia con la que en particular mRNA se está traduciendo. De hecho, hay contextos específicos en los que la traducción activa en polisomas convierte estancó 21,22 que el lector debe tener en cuenta. La determinación de si o no las transcripciones se dedican activamente con la maquinaria de traducción se puede hacer por a) tratar la muestra con puromicina, que a diferencia de EDTA, provoca 'run-off' de los ribosomas que se translocación activamente a través de un ARNm, o b) tratar la muestra con homoharringtonina que inhibe la translocación de sólo el primer ribosoma al codón de inicio, de nuevo causando 'escorrentía' de cualquier ribosomas de translocación aguas abajo.

El uso de las transcripciones de control para el análisis de qPCR también es crítica. La selección de las transcripciones que no se ve afectada por diferentes condiciones de tratamiento tales como algunos genes de limpieza (GAPDH, actina, tubulina, nucleolina), ARNm ribosómicos (18S, Rpl13a) o en este caso la variante no IRES de la XIAP IRES, es importante en verificar si el efecto del tratamiento sobre la traducción es específica o generalizada. Estas transcripciones de control pueden utilizarse para normalizar la distribución de los mRNAs analizados como se ha hecho aquí (XIAP y Bcl-XL ARNm se normalizaron a GAPDH mRNA y se expresó como un porcentaje del contenido total de ARNm representado por la suma de contenido de mRNA en cada fracción ) o, alternativamente, objetivo y de control mRNAs pueden expresarse como valores absolutos y se muestran por separado. análisis qPCR de los lisados ​​de entrada (por lo general el 10% del volumen total) es otro paso que va a controlar la distribución de los ARNm específicos. Idealmente, el contenido de mRNA de una transcripción específica en el lisado de entrada debe ser comparable a la suma de contenido de mRNA en todas las 10 fracciones analizadas. Finalmente, Un paso opcional para controlar el fenol: cloroformo etapa de extracción es a pico cada fracción polisomas con un ARNm reportero transcrito in vitro (tal como el CAT, cloranfenicol acetil transferasa) que será posteriormente cuantificada por qPCR, e incluso se puede utilizar para normalizar la datos 14.

Como con cualquier técnica, la elaboración de perfiles de polisomas presenta algunas limitaciones. El hecho de que por lo general un mínimo de 10 fracciones (cambios más sutiles en la eficiencia de la traducción puede requerir 20 o más) necesitan ser recogidos con el fin de tener distribuciones de polisomas agradables hace que este paso limitativo, en el sentido de que sólo un máximo de 4 muestras puede ser analizada en un momento en que sea capaz de manejar cómodamente la extracción de RNA y análisis qPCR de 40 muestras y controles de entrada 4 a la vez. El tamaño de la muestra se puede añadir fácilmente hasta con el número de transcripciones deben ser analizados y cuántos qPCR replica que hacer, y esto puede ser costoso. Otra de las limitaciones de un polysomal perfilado un qPCR basado ennálisis es que sólo se puede hacer en un enfoque basado en la candidato (donde las transcripciones a ser analizados son conocidos de antemano) y no se pueden aplicar para el análisis de todo el genoma de la traducción. Sin embargo, a principios del siglo 21, los investigadores comenzaron a interrogar a su ARN polysomal a nivel genómico utilizando microarrays de ADN 15 y, más recientemente, con la secuenciación de próxima generación 16,17. En este enfoque de gran alcance, se realiza perfiles polysomal como se describe en este protocolo, salvo que en lugar de realizar un análisis qPCR de fracciones individuales, monosomas fracciones (por lo general de fracciones 2-4) y polisomas fracciones (normalmente fracciones) están agrupados juntos y variaciones en la traducción mundial analizados por microarrays de ADN o secuenciación de todo el genoma de ARN. De ahí que con este enfoque, es posible evaluar todos los ARNm cuya distribución turnos de polisomas a monosomas (disminución de la traducción) o viceversa (aumento en la traducción) a un tratamiento específicoción. Validación y cuantificación de la distribución específica de ARNm de los polisomas se pueden entonces ser realizadas por qPCR. Un uso aún más poderosa del principio de perfiles polysomal es perfilado ribosoma. Además extensión de alto rendimiento de esta técnica se informó recientemente de que permite la monitorización simultánea de cientos de polisomas fracciones 23. Esto proporciona una clara ventaja cuando sondeo eficiencias traduccionales de las colecciones de mutantes o en un RNAi pantallas de gran escala. Perfilado ribosoma es una técnica que se aprovecha de la secuenciación de próxima generación para mapear fragmentos de ARN protegidos por los ribosomas (huellas ribosoma) que participan en la síntesis de proteínas 24,25. En esta técnica, la translocación del ribosoma puede ser inhibida con cicloheximida (reversible) o emetina (irreversible) seguido por la lisis celular y la digestión de RNasa para producir una población de huellas ribosoma. Los ribosomas se enriquecen, el ARN total se aísla, y se elimina la contaminación ribosomal y el ARN ribosomal mitocondrial.Huellas de ARN de aproximadamente 26-28 nucleótidos son aislados, transcripción inversa, convertida en una biblioteca de cDNA y se secuenciaron 26. A diferencia de perfiles de polisomas estándar, este enfoque no sólo identifica mRNAs específicos que son regulados en traslación, sino también produce información ARNm específico a una resolución de codón tales como la ocupación exacta y la densidad de los ribosomas a lo largo de una transcripción específica. Esto es particularmente de interés para los ARNm con modos específicos de traducción, tales como ARNm IRES-albergan, ya que podría dar más información sobre el lugar en la transcripción del ribosoma-reclutamiento que está ocurriendo.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros pasados y presentes del laboratorio, en particular a Urszula Liwak, por la discusión crítica sobre los protocolos de perfilado de polisomas y el intercambio de datos. Este trabajo fue apoyado por subvenciones operativas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, la Sociedad de Investigación del Cáncer y el Consejo Nacional de Investigación en Ciencia e Ingeniería de Canadá para MH. MDF contó con el apoyo del Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award y la Ontario Graduate Scholarship, y este trabajo forma parte de su tesis doctoral.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Gradient Master 108 máquina de gradiente automatizadaBIOCOMP107-201M
Auto Densi-Flow máquina de gradiente de dos cámarasLABCONCO4517000
Beckman Ultracentrífuga Beckman CoulterModelo # L-100-XP
Fraccionador de gradiente de densidadTELEDYNE ISCO69-3873-246Compuesto por: sistema de perforación de tubos, bomba peristáltica, detector UA-6 con filtros de 254 y 280 nm y colector de fracciones Foxy R1
Software de adquisición de datos WINDAQINSTRUMENTSWINDAQ/LITE
http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htmTubos de ultracentrífuga Pollyallomer (para SW41, 14 x 89 mm)Beckman Coulter331372
Tubos de centrífuga de 2 ml sin nucleasas (nariz de delfín)DiaMedPRE1900-N
Tubos de centrífuga de 2 ml sin nucleasas (fondo plano)SafeSeal12000
Sacarosa (sin nucleasas)Calbiochem573113MW = 342,3 g/mol
CicloheximidaSIGMAC7698MW = 281,4 g/mol. Vuelva a suspender en DMSO y manténgalo a -80 °C durante el almacenamiento a largo plazo. Precaución: ¡TÓXICO! Puede causar tracto respiratorio e irritación de la piel. Use mascarilla al pesarse.
Cloruro de sodio (sin nucleasas)OmniPur7710MW = 58,44 g/mol
MgCl2,6H2O (sin nucleasas)OmniPur5980MW = 203,3 g/mol
Tris Base (sin nucleasas)J.T. Baker4109-01MW = 121,14 g/mol
Triton X-100OmniPur9400Atención: ¡TÓXICO! Puede causar tracto respiratorio e irritación de la piel
Inhibidor recombinante de RNasina ribonucleasaPromegaN2515
Solución de inactivación de RNaseZap RnasaAmbion, Life TechnologiesAM9780
GlycoBlue Coprecipitante (15 mg/ml)Invitrogen, Life TechnologiesAM9516
Ácido-fenol:Cloroformo, pH 4.5 (con IAA, 125:24:1)Ambion, Life TechnologiesAM9722Precaución: ¡TÓXICO! Puede causar irritación de las vías respiratorias, así como irritación de la piel y corrosión

Referencias

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