El objetivo de esta técnica es permitir a los investigadores realizar la disección, inmunotinción y montaje de discos oculares de pupa de Drosophila melanogaster de cualquier edad.
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Artículo de método
Disección y montaje de
En este artículo
Resumen
Resumen
El disco ocular de Drosophila melanogaster es un poderoso sistema que se puede utilizar para estudiar muchos procesos biológicos diferentes. Contiene aproximadamente 800 unidades oculares separadas, denominadas omatidios1. Cada omatridio contiene ocho fotorreceptores neuronales que se desarrollan a partir de células indiferenciadas tras el paso del surco morfogenético en el tercer estadio larvario2. Tras la diferenciación secuencial de los fotorreceptores, se desarrollan células no neuronales, incluidas las células cónicas y pigmentarias, junto con las células de cerdas mecanosensoriales3. Los procesos finales de diferenciación, que incluyen la disposición estructurada de todos los tipos de células omatidiales, la muerte celular programada de los tipos de células indiferenciadas y la expresión de rodopsina, ocurren a través de la fase de pupa4-7. Esta técnica se centra en la manipulación del disco ocular de la pupa, proporcionando información e instrucciones sobre cómo diseccionar el disco ocular durante la fase de pupa, que es inherentemente más difícil de realizar que el disco ocular del tercer estadio comúnmente diseccionado. Esta técnica también proporciona detalles sobre la inmunotinción para permitir la visualización de varias proteínas y otros componentes celulares.
Introducción
Los campos de la biología celular y del desarrollo se han visto afectados en gran medida por el organismo modelo: Drosophila melanogaster. Dentro de este modelo, los estudios sobre el ojo disco han contribuido en gran medida de los conocimientos relativos a la señalización, la biología celular y otras áreas. El tercer disco ojo estadio larval tarde se ha estudiado ampliamente y es un modelo de gran alcance de utilizar, ya que da una instantánea de una serie de períodos de desarrollo, cada uno con sus propias moléculas y procesos de señalización único, como la morfogénesis surco progresa a través del disco ojo 8. Sin embargo, hay una necesidad de a....
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Protocolo
Este procedimiento es un procedimiento de 2 días.
Día 1 (2 horas + tiempo de disección)
Disección 1. Pupal Disco de ojos
- Seleccione una pupa para la disección.
NOTA: La edad de la pupa para ser diseccionado será determinado por las necesidades experimentales. Sin embargo, si el examen de la morfología celular, esto se hace con frecuencia en 42 horas después de la formación pupario (APF) a 25 ° C, que es la edad de las pupas se muestra en el video. Recoger pupas blanco (considerado APF 0 h) con un pincel mojado y organizar en orden cronológico (basado en el tiempo de recogida) en un nuevo vial de al....
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Resultados
Como un ejemplo de la utilización de este protocolo, los resultados que ilustra midpupal (42 hrs APF a 25 ° C) ojo discos immunostained con diferentes anticuerpos se presentan en la Figura 2. Mediante el uso de un anticuerpo dirigido contra los residuos de fosfotirosina, la membrana de las células puede ser observado (Figura 2A). Esto puede ser usado para identificar la disposición regular de las células ommatidial en el ojo pupal después de los procesos de modelado finales que se producen antes de la e.......
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Discusión
Si bien parece que el proceso es simple y fácil de realizar, en realidad, esta técnica requiere mucha práctica para dominarla. Rutinariamente, comenzamos a los estudiantes aprendiendo a diseccionar y montar discos oculares de tercer estadio12, con los que es mucho más fácil trabajar. Esta práctica ayuda a desarrollar una posición de disección adecuada de los brazos, las manos y los dedos13 para que la manipulación de las pinzas bajo el microscopio de disección sea estable, fácil y experimentada. .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Apreciamos y nos gustaría agradecer al Instituto Médico Howard Hughes por el premio de Profesor del HHMI a la U.B. que hizo posible este proyecto. Agradecemos a la universidad de la Universidad de California, Los Ángeles, por proporcionar instalaciones y apoyo de infraestructura docente para este trabajo. El trabajo también contó con el apoyo financiero de la Universidad Midwestern y una generosa donación del Fondo de Donaciones de Charity Fidelity. Agradecemos a John VandenBrooks por sus comentarios sobre el manuscrito y a Krista Pearman por su asistencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) | 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4, Lleva el volumen a 1 μ l, ajuste el pH a 7.4, esterilize en autoclave o filtre, diluya a 1x PBS con ddH2< / sub>O esterilizado en autoclave antes de usar. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Precaución: ¡Irritante! Usa guantes. |
| 0,3% PBT | 1,5 ml de Triton X-100, 500 ml 1X PBS. | ||
| Solución de formaldehído al 37% | Fisher Scientific | F75P1GAL | Precaución: ¡Tóxico, probable carcinógeno humano! Use guantes. |
| Arreglar solución | (≈ 4% de formaldehído en PBS) 50 μ l de 37% de formaldehído, 450 μ l 1x PBS, hacer fresco antes de usar | ||
| Suero de cabra normal | Rockland anticuerpos y ensayos | B304 | Alícuota en volúmenes de 1 ml y almacenar en -80 ° |
| Solución | 10% NGS en PBT. Esto se puede hacer y almacenar a 4 & grados; C durante unos días antes de su uso. | ||
| Solución madre DAPI | Life Technologies | D3571 | Para núcleos de tinción de coutner. Prepare una solución de 1 mg/ml con ddH2O. |
| VectaShield Medio de montaje | Vector Labs | H-1000 Medio de | montaje |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Para montaje. Preparar dilución al 70% con ddH2O. |
| Equipo | |||
| Mezclador nutante | VWR | 82007-202 | Se utiliza para mecer el tejido en un plato de vidrio de 3 pocillos |
| SylGard 182 Kit de elastómero de silicona | Krayden | NC9897184 | Se utiliza para hacer un plato de disección de silicona |
| Plato | de disección de siliconaMezcle el kit de elastómero Sylgard (arriba) de acuerdo con las instrucciones suavemente (para evitar burbujas). Vierta la mezcla en una placa de Petri (de cualquier tamaño). Permita que SylGard se cure durante la noche en 37 ° Incubadora C. | ||
| Plato de vidrio de 3 pocillos | Corning | 7220-85 | La variedad de 3 pocillos de estos ya no está disponible, este es el producto de 9 pocillos. |
| Minibandeja de micropocillos de 72 pocillos | Nunc | 438733 | |
| Pinzas afiladas (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Micro Tijeras tipo Vannas, rectas, hoja de 5 mm Ted | Pella | 1346 | |
| Capilares de vidrio de borosilicato de 100 mm | World Precision Instruments | 1B100-4 | Tire con un tirador de aguja para hacer una punta fina que permita que fluya un pequeño chorro de PBS. |
| Pipetas de transferencia desechables, punta fina | Samco Scientific | 231 | |
| Las dimensiones del tubo son diámetro interior (ID) x diámetro exterior (OD) x espesor de la pared en pulgadas | |||
| Tubo de PVC (1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | Utilícelos con aguja estirada para ensamblar el tubo del soplador como se muestra en la Figura 2. |
| Tubo de silicona Tygon (3/32 x 5/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00004 | |
| Tubo de silicona Tygon (1/32 x 3/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00001 |
Referencias
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the ....
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Reimpresiones y permisos
