Una Perspectiva Técnica en Modern Árbol-anillo de Investigación - Cómo superar dendroecológica y madera anatómicas Desafíos

Resumen

Aquí presentamos un protocolo que describe cómo muestrear especímenes de madera para la evaluación general de sus estructuras de crecimiento. Se describen las técnicas de preparación y visualización macro y microscópica necesarias para generar conjuntos de datos anatómicos y dendroecológicos de madera bien replicados y altamente resueltos.

Resumen

Investigación dendroecológica utiliza la información almacenada en los anillos de árboles para entender cómo los árboles individuales e incluso los ecosistemas forestales enteras respondieron a los cambios ambientales y para finalmente reconstruir dichos cambios. Esto se hace mediante el análisis de las variaciones de crecimiento atrás en el tiempo y correlacionar diversos parámetros específicos de la instalación a (por ejemplo) los registros de temperatura. La integración de la madera parámetros anatómicos en estos análisis reforzaría reconstrucciones, incluso hasta resolución intra-anual. Por lo tanto, presentamos un protocolo sobre cómo muestrear, preparar y analizar muestras de madera para el análisis macroscópico comunes, sino también para los análisis microscópicos posteriores. Además se introduce una solución potencial para el análisis de imágenes digitales generadas a partir de muestras pequeñas y grandes comunes para apoyar el análisis de series de tiempo. El protocolo presenta los pasos básicos, ya que en la actualidad se pueden utilizar. Más allá de esto, hay una necesidad continua para la mejora de las técnicas existentes, y el desarrollo de la nueva techniques, para registrar y cuantificar los procesos ambientales pasados ​​y presentes. Investigación anatómica de madera tradicional necesita ser ampliado para incluir información ecológica para este campo de investigación. Esto apoyaría dendro-científicos que tengan la intención de analizar nuevos parámetros y desarrollar nuevas metodologías para comprender los efectos a corto y largo plazo de los factores ambientales específicos sobre la anatomía de las plantas leñosas.

Introducción

Los árboles, así como arbustos, arbustos enanos, e incluso hierbas, muestran patrones de respuesta múltiple relacionados con los cambios en su entorno. Estos patrones han sido objeto de la botánica y fisiología vegetal desde mediados del ^siglo 19. En aquel entonces, la investigación de plantas leñosas se centró principalmente en los árboles y un análisis descriptivo de la estructura y la variabilidad de los anillos anuales en un contexto ecológico ^1. Cuando Andrew Ellicott Douglass inventó la técnica cruzada de citas para la investigación de los anillos ^2, este contexto ecológico fue más o menos reprimida por la nueva capacidad de la fecha con precisión los resultados de madera en la arqueología. Cruz-citas por primera vez permitió a la datación exacta de los anillos de árboles al año natural y se hasta ahora considerado como la columna vertebral de la investigación de anillos de árboles en todos los campos de su aplicación ^1.

Paralelamente, desde finales del siglo 19, anatomía de la madera se convirtió en una disciplina de investigación importante se relacionad para muchos otros campos de las ciencias naturales y aplicadas ^3. Dos dominios principales se establecen: la anatomía sistemática madera, que es la base para la identificación de la madera en arqueología ^4, y la anatomía de la madera aplicada, relacionados con tecnología de la madera, la fisiología, la patología y la ecología ^3,5.

En la investigación de anillos de árboles, Dendroecología hoy en día se define como un tema que abarca estudios de anillos de árboles relacionados centrados en estudios ambientales, como los procesos geomorfológicos (Dendrogeomorfología), temperatura y reconstrucciones de precipitación (dendroclimatología), cambios de nivel de agua (dendrohydrology) o incluso fluctuaciones de los glaciares ( dendroglaciology) ^6. Como esta definición indica, los análisis de anillos de árboles se han vuelto cada vez más importante en el campo de las citas y la reconstrucción de los procesos ambientales, tales como (i) pasadas condiciones climáticas mediante el análisis de las variaciones anuales en el ring ancho ^7,8, densidad de la madera ⁹ o isótopos ^10, o (ii) tque la recurrencia intervalos de procesos geomorfológicos ^11. Estos estudios muy detallados sobre las variaciones de anillos de ancho y su contenido isotópico demuestran la necesidad de analizar los anillos con más detalle, es decir, el estudio de la estructura anatómica de los anillos. Sin embargo, los estudios detallados de madera características anatómicas dentro de los anillos anuales relacionados con los cambios ambientales son raros ^12,13. Aunque estas características microscópicas se conocen ^14, rara vez se han aplicado a nivel microscópico para la investigación dendroecológica. Además, el momento exacto de estas reacciones de crecimiento en árboles cultivados de forma natural, esenciales para los propósitos exactos de citas, rara vez se ha documentado recientemente ^15.

En cuanto a los efectos del calentamiento global ^16, la mejora de los ya existentes y el desarrollo de nuevas técnicas para registrar y cuantificar pasadas y actuales procesos ambientales se requiere, sobre todo en términos de Investigación del Impacto Climático ^11.Con la ampliación de la investigación anatómica madera tradicional a una anatomía de la madera con base ecológica ^17, dendro-científicos pueden analizar nuevos parámetros y desarrollar nuevas metodologías para entender los efectos a corto y largo plazo los efectos de los factores ambientales específicos sobre la anatomía de las plantas leñosas ^18. El conocimiento detallado acerca de las variaciones en los diferentes parámetros de las células dentro de los anillos individuales relacionados con controladores específicos (por ejemplo, fuerzas mecánicas, las variaciones climáticas) es el requisito básico para la comprensión de la variabilidad en la formación de anillos de árboles. En comparación con las mediciones de anillo ancho comunes, la identificación de las variaciones anatómicas de madera requiere técnicas de preparación más complejas y extensas que requieren mucha mano de obra y tiempo. Los procedimientos detallados de corte de la muestra, las manchas, y la inclusión son múltiples y dependen siempre de que el objetivo del estudio ^19.

Para el análisis macroscópico de ancho de anillos de coníferas o estructuras incluso para el número, tamaño o distribution de naves en maderas duras, la superficie de una muestra se pule comúnmente usando papel de lija fino o rectificadoras especiales ^20. Una desventaja de este procedimiento es el llenado de las celdas individuales con el polvo que impide su posterior análisis microscópico semiautomática ^21. Los mejores resultados para la preparación de muestras macroscópicas se consiguen cuando la superficie de la muestra se cortan con una cuchilla de afeitar u otro cuchillo afilado.

Mientras que para las muestras pequeñas, hojas de afeitar son una herramienta perfecta; muestras más grandes como núcleos requieren el corte de superficies planas en toda la extensión de los núcleos. En contraste con el lijado, las células no se llenan de polvo, que permite además la preparación para el análisis de imágenes sucesivas. Además, el lumen de célula abierta, las paredes celulares adecuadamente cortados, y la superficie plana de la muestra entera permiten la aplicación de la densitometría de alta frecuencia ²² a toda la extensión del núcleo. Para análisis de imágenes, la superficie de las muestras (célulaparedes) se pueden teñir con tinta oscura y el lumen de células abiertas posteriormente se pueden llenar con tiza blanca para mejorar el contraste entre la pared celular y el área del lumen ^19,23. Esta bastante simple técnica permite una evaluación macroscópica básica de las estructuras celulares más grandes para las mediciones de tamaño de los buques.

Estas técnicas para el corte de superficies planas son suficientes para los análisis macroscópicos. Para una detallada anatómica madera (es decir, microscópica) análisis, microscopía de luz transmitida es el método más común aplicada en ciencias dendro. Células del xilema se diferencian a través de procesos complejos que abarcan la determinación del tipo de célula, la división celular, la diferenciación celular, y muerte celular programada ^24. Desde el momento y la velocidad a la que estos procesos ocurren determinar las características anatómicas de células, las condiciones ambientales que afectan a estos procesos pueden generar desviaciones anatómicas en la estructura del anillo. Como una condición importante para ellos analizans, micro secciones tienen que estar preparados con un micrótomo ^19. Cuando la preparación de muestras para seccionar, la visibilidad de la dirección de traqueidas o fibra es crucial. Se recomienda el uso de deslizamiento impulsado micrótomos mano para cortar secciones micro porque esta técnica facilita secciones de alta calidad como sea necesario para una imagen análisis ^19. Dependiendo del objetivo específico de un determinado estudio, micro se cortan secciones perpendicular o paralelo a la extensión longitudinal de las células. Estas secciones se fotografiaron por debajo de un microscopio y dimensiones de la celda medidos utilizando una imagen especializada análisis de software.

Hasta hace poco, la capacidad de preparar micro secciones se restringió a los pequeños tamaños de muestra solamente (aproximadamente 1 cm x 1 cm). Esto es aceptable para analizar los eventos individuales como disturbios en años concretos, pero esta técnica no permite el análisis de series de tiempo prolongado necesario para reconstrucciones ambientales. Este esfuerzo sólo puede darse cuentaD a través del desarrollo de nuevos, eficientes y económicos los procedimientos de preparación y técnicas analíticas. En los últimos años, los miembros del laboratorio de anillos de árboles en el Swiss WSL Instituto Federal de Investigaciones en Suiza han iniciado un intenso trabajo sobre este tema. Como resultado, los nuevos dispositivos y técnicas de análisis han sido desarrollados para apoyar la idea de la integración de características anatómicas de la madera a una amplia gama de temas de investigación ambiental.

Protocolo

1. Técnicas de muestreo

1. Muestreo Core
   1. Para árbol muestreo tallos, extraer al menos dos núcleos utilizando un descorazonador de incremento de cada tallo para analizar su desarrollo de crecimiento. Variar la posición de toma de muestras en la tarea de investigación, por ejemplo, para reconstrucciones climáticas comunes toman los núcleos paralelo a la pendiente. Cuando se trabaja con especies tropicales, tomar por lo menos tres o más núcleos.
   2. Use un corer incremento afilado (5, 10 o 12 mm de diámetro) y coloque el corer perpendicular al eje mayor de la madre.
      NOTA: Para tener una posición controlada y estable del corer, use un empujador para evitar movimientos del corer aparte de su rotación cuando se perfora en el árbol. El taladro en el tallo hasta el final en ya través de la médula. Para núcleo de madera muy densa (es decir, las especies tropicales), usar cuerpos especiales de motosierra reconfigurados con un adaptador de tacos de crecimiento que permiten centrales incluso bosques densos como Diospyrus ebenum (Ebony).
   3. Utilice un extractor y retirar el núcleo resultante de la árbol. Apaga la corer y sacarlo de la madre.
   4. Añadir un ID específico para el núcleo extraído por medio de un lápiz suave al escribir en una cinta, que luego se coloca directamente sobre el núcleo. Repetir el procedimiento en el lado opuesto del tallo.
   5. Almacenar las dos muestras del árbol en tubos de plástico o de papel o cajas especiales para evitar cualquier daño.
      NOTA: Paja de papel son beneficiosos especialmente en ambientes tropicales, ya que impiden los núcleos de moldeo.
   6. Por último, montar los núcleos (dirección de las fibras verticales) sobre vigas de soporte de madera. Use agua fría pegamento de madera resistente y déjelos secar.
      NOTA: Nunca montar los núcleos en soportes de madera, si el objetivo del estudio incluye además químico, isótopo o análisis de la densidad. A estos efectos, fijar los núcleos en los conductos de cables abiertos o una sola cara de cartón corrugado.
2. Muestreo Micro-core
   1. Utilice un dispositivo de perforación especialo aguja con una abertura de 2 mm. Dependiendo del espesor de la corteza utilizar un cincel para eliminar una parte necesaria de la corteza.
   2. Coloque el dispositivo perpendicular al eje que crecen en el tallo como se describe anteriormente, y utilizar un martillo para penetrar en el xilema de la raíz a aproximadamente 2 cm de profundidad.
   3. Gire la aguja para romper el núcleo micro resultante dentro de la herramienta y retírela del tronco. Guarde los núcleos de micro en viales de microcentrífuga y etiquetarlos.
3. Muestreo Disco
   1. En casos especiales (y especialmente en los trópicos), por ejemplo, cuando se toman muestras tocones y árboles caídos o siempre que sea posible, tome discos (secciones transversales perpendiculares al eje creciente) con una sierra de cadena. Simplemente etiquetar los discos y almacenarlos hasta su posterior análisis.
      NOTA: Este procedimiento se aplica el muestreo más comúnmente para todo el material fósil sub-seca muerto, histórico, arqueológico y, así como las maderas duras muy densas que no permiten el uso de sacatestigos de incremento.

Preparación 2. Muestra

1. Discos de lijado
   1. Coloque los discos en una máquina de lijado y moler la superficie usando una secuencia de abrasivos cada vez más finas, comenzando con papel de lija de grano 80, seguido por 120, 220, 300 de grano. Un pulido final con grano 400 es suficiente para la mayoría de las coníferas. Para maderas duras y especialmente las especies tropicales, el uso de lija sémola hasta 1200 para distinguir los límites de crecimiento de anillos.
2. Cortar superficies planas en núcleos
   1. Fijar los tacos de crecimiento en el soporte básico de un micrótomo núcleo de nuevo desarrollo que permite cortar superficies planas en núcleos en toda su extensión.
      NOTA: corregir la orientación del núcleo dentro del soporte para tener la dirección de la fibra de la muestra en posición vertical, que está en un ángulo recto con el cuchillo de la microtomo.
   2. Levante el núcleo hasta que toque ligeramente la cuchilla. Tirar de la cuchilla, que se fija en cojinete de guía peligro en la medida del núcleo a Cut de una primera parte de la parte superior.
   3. Presione de nuevo el cuchillo detrás de la central, levante el soporte de la muestra con el núcleo alrededor del 10 micras y repita el procedimiento de corte. Hacer esto hasta aproximadamente un tercio del diámetro del núcleo es cortado resultando en una superficie plana continua.
3. Preparación micro secciones añadiendo solución de almidón de maíz.
   1. Para el análisis de la imagen detallada de la estructura anatómica, corregir núcleos u otras muestras se separaron de discos en el soporte de un micrótomo. Coloque la cuchilla de microtomo, guiado por una guía de cojinete de bolas de un microtomo trineo de nuevo desarrollo en el borde superior de la muestra y tire del mismo.
   2. Presione de nuevo la pala para levantar la muestra en alrededor de 20 a 30 micras y tire de la cuchilla sobre la muestra de nuevo. Repita este procedimiento hasta que se crea una superficie continua en la parte superior de la muestra.
   3. Cubrir la superficie resultante con una solución de almidón de maíz (10 g de almidón de maíz, 8 ml de agua, y 7 g de 100% glicerol) con un cepillo común.
      NOTA: Los granos de almidón se llenan las celdas abiertas de la muestra para estabilizar la estructura para la posterior corte de las secciones delgadas.
   4. Levantar la muestra por 15 micras, coloque un cepillo sobre la superficie de la muestra y tire de la hoja lentamente hacia la muestra de partida para cortar una sección fina (por debajo del cepillo). Si bien el corte, la sección resultante se desliza sobre la hoja guiada por el cepillo.
   5. Cuando se corta toda la sección, eliminar la sección micro de la cuchilla con un cepillo y agua (para reducir la fricción) y coloque la sección sobre un portaobjetos de vidrio para su posterior elaboración. Para evitar que se sequen, cubrirlas usando una pequeña cantidad de glicerol (33% = una parte de 100% de glicerol y dos partes de agua).

3. Preparación MicroSlide

1. Para la siguiente preparación de láminas permanentes, primero lavar el glicerol lejos de la sección micro con una pipeta y agua.
2. Cubra la húmeda sección con unas pocas gotas de safranina (1 g de polvo de safranina + 100 ml de agua) y Astrablue (0,5 g de polvo de color azul Astra + 2 ml de ácido acético 100% + 100 ml de agua) para distinguir entre lignificados y no lignificadas estructuras, sino también para mejorar el contraste para el análisis de la imagen subsiguiente.
3. Deje que el resto de la sección 5 min cubiertos por el tinte y luego lavarla lejos con una pipeta y el agua de nuevo.
4. Tan pronto como se elimina el tinte excesivo, deshidratar la sección con pipetas lavándolas con una secuencia de 75% diluida, 96% y finalmente etanol al 100%.
5. Use pipetas para enjuagar las muestras en el portaobjetos de vidrio en lugar de colocar las muestras en un baño para reducir el tiempo de procesamiento para alrededor de dos a 3 min para todo el proceso de deshidratación.
   NOTA: La deshidratación con etanol evita muestras frágiles se rompan.
6. A partir de entonces enjuagar la sección con 100% xilol.
   NOTA: El xileno es carcinogénico y la ventilación es obligatoria en el laboratorio cuando se utiliza. Otroproductos existen reemplazando xilol, pero si hay intención de almacenar las muestras durante períodos de tiempo más largos (años, décadas) para un nuevo análisis potencial, bálsamo de Canadá (paso 3.5.2) es el medio sólo incrustación que se mantiene clara sin cambiar de color con el tiempo. Desafortunadamente bálsamo de Canadá necesita ser utilizado en combinación con xilol.
7. Mientras el xilol se vuelve lechoso (blanquecino), repita el proceso de deshidratación, ya que no es suficientemente deshidratado.
8. Tan pronto como el xilol queda claro, cubrir la sección con una caída de 100% bálsamo de Canadá y se cubre con una cubierta de vidrio de al menos el tamaño de la sección.
   NOTA: Tenga en cuenta la eliminación de las burbujas de aire presionando suavemente el cristal cubierta hacia abajo.
9. Colocar el portaobjetos micro resultante entre dos tiras de plásticos resistentes al calor y colocarlo en una placa de metal. Coloque un peso (por ejemplo, un imán) en la parte superior de la diapositiva para presionarlo hacia abajo para mantener la sección plana durante el siguiente proceso de secado.
10. Colocar los portaobjetos en un horno a60 ° C durante aproximadamente 12 horas. Después de 12 horas, tome las diapositivas fuera del horno y coloque en un estante para dejar que se enfríen a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ° C). Cuando esté fría, retire el peso y la tira de plástico y limpiar la diapositiva utilizando hojas de afeitar para quitar el excedente de bálsamo de Canadá.

4. Visualización del contenido de celdas

1. Prepare la solución Nawashin ^25.
   1. Preparar una solución de (A) con 5 g de ácido crómico, 50 ml de ácido acético 96%, y 320 ml de agua desionizada. Preparar otra solución (B) con 200 ml de formalina con 175 ml de agua desionizada.
   2. Mezclar la solución A y la solución B en una proporción de 1: 1 para crear la solución Nawashin.
2. Para visualizar el contenido celular, fijar la muestra con solución Nawashin durante 10 minutos para detener todos los procesos de degradación dentro de la célula.
   NOTA: La fijación conserva núcleos de las células que permiten una estimación de la longevidad celular (longevidad celular = núcleos presentes / ausentes núcleos; o la presenciar ausencia del núcleo indica si la célula está viva o muerta).
3. Después de la fijación, lavar las secciones con agua para eliminar completamente la solución Nawashin antes de la tinción con safranina-Astra azul y delante de ellos, además, la tinción con azul pícrico-anilina (1 parte de saturado anilina soluble en agua azul + 4 partes de ácido pícrico 10%) .
4. Calentar con cuidado la muestra a aproximadamente 80 ° C (en cualquier caso por debajo del punto de ebullición) para acelerar el proceso de tinción. Para la deshidratación y la inclusión de las muestras siguen el protocolo de los pasos 3.4 a 3.8.

5. Preparación de Imágenes Digitales Características anatómicas

1. Crear imágenes digitales de las superficies básicas para el análisis del vaso.
   1. Cortar el plano de la superficie del núcleo utilizando el microtomo núcleo y manchar el negro superficie resultante simplemente usando un marcador de fieltro.
   2. Tan pronto como se seca el colorante, frotar la superficie del núcleo con tiza blanca. Pulse la tiza en las células simplemente frotando la tiza sobre elsuperficie con un dedo. También quite el excedente de la tiza por este procedimiento.
      NOTA: Como resultado de las paredes celulares son de color negro y las partes del lumen de los vasos son de color blanco. Este contraste es una condición previa para un análisis automatizado de imágenes.
   3. Coloque el núcleo preparado por debajo de un microscopio binocular equipado con una cámara digital. Tomar una secuencia de ligeramente superpuestas (aprox. 10%) imágenes a partir de un lado del núcleo hasta que se captura toda la superficie. Coser las imágenes individuales para crear una imagen completa de la superficie del núcleo.
2. Crear imágenes digitales de micro diapositivas
   1. Colocar los portaobjetos micro limpiados bajo un microscopio y tomar la superposición de imágenes de toda la sección.
   2. Definir una amplificación específica dependiendo de las estructuras a analizar, que oscila entre 40X y magnificación 1.000X.
   3. Coser las imágenes individuales para crear una imagen completa de la sección. Para evitar posibles distorsiones durante el proceso de costura, utilice "; Plan de "-tipo lentes del objetivo con el microscopio.

6. Características Cuantificación Anatómicos

1. Para detectar las células y los bordes del anillo utilizando el ROXAS18 imagen herramienta de análisis o software similar, cargar una imagen completa de una sección de la micro y la calibración espacial asociada a la obtención de resultados cuantitativos en unidades métricas. Calcular la calibración espacial midiendo el número de píxeles entre las escalas de un micrómetro de imágenes tomadas de la etapa con la misma ampliación y dividiendo el valor obtenido por el espacio de la escala en unidades métricas (por ejemplo 1000 m).
2. Seleccione de la lista proporcionada (siempre en el software) una configuración adecuada antes de comenzar la parte automática del análisis.
   NOTA: Una configuración es un conjunto previamente optimizada de configuración del programa que, por ejemplo, tiene en cuenta el color de la tinción de la muestra y el tamaño y la forma gama de las células para ser detectado. Configuraciones a la medida por lo tanto,permitir que para producir resultados de reconocimiento óptimas para diferentes especies y calidades de imagen.
   1. Seleccione otras opciones, como el empleo de las regiones en la imagen que van a ser incluidos o excluidos para evitar, por ejemplo, los márgenes de imagen en blanco o grietas en la muestra, si es necesario.
3. Inicie el análisis pulsando el botón Analizar. Si optado, definir regiones en la imagen que se van a incluir o excluir el uso de la herramienta polígono, rectángulo o un círculo. El siguiente análisis automático utiliza algoritmos flexibles para corregir algunas deficiencias imagen (por ejemplo, falta de contraste) y mejorar el contraste basado en la calidad de la imagen.

Resultados

Todos los análisis dendroecológicos dependen de muestras precisas, no importa si se toman discos, de los machos o núcleos de micro. Para ello, los dispositivos deben estar en perfecto estado (afilado con precisión) para evitar microfisuras dentro de la muestra de madera. En la preparación de superficies en tacos de crecimiento, el uso de un micrótomo núcleo es esencial. La capacidad de tener células abiertas, que se pueden tratar más para mejorar el contraste para los análisis de imagen y mediciones del tamaño de recipiente (Figura 1), es un primer paso importante hacia la adaptación de las estructuras anatómicas en tiempo de análisis de series. A veces la densidad de una muestra de madera dura impide el uso de un micrótomo. En ese caso, un pulido adecuado y la posterior eliminación de serrín excesiva de los vasos con un compresor o de vacío es la mejor opción.

Para un análisis más detallado de las estructuras celulares más pequeños como la madera temprana y traqueidas de madera tardía en las coníferas, se necesitan secciones micro de alta calidad. Aquí, potentiAL artefactos tales como paredes celulares secundarias se despojaron de la necesidad de la pared primaria debe ser evitado (Figura 2). Si se producen estos artefactos en las imágenes digitales, un análisis automatizado de las dimensiones de la celda ya no es posible. Los artefactos a continuación, deben ser corregidos manualmente, lo que requiere mucho tiempo y en la mayoría de los casos los resultados en las mediciones incorrectas de dimensiones de la celda. La simple aplicación de un fluido no newtoniano, es decir, una solución de almidón de maíz, a la parte superior de la muestra es compatible con la estabilidad de la estructura, mientras que la reducción de la aparición de artefactos a un mínimo (Figura 2) ^26. Esta aplicación de almidón de maíz, adecuado para todas las muestras de madera incluyendo especies tropicales, hace que la aplicación del procedimiento de incrustación de las muestras antes de cortar redundante.

Secciones Micro permiten una determinación más seguro de los anillos anuales. Este es especialmente el caso para las coníferas que crecen en sus límites naturales, es decir </ Em>, en la línea de árboles en las zonas de alta montaña. Extremadamente anillos estrechos son frecuentes y difíciles de detectar macroscópicamente (Figura 3). En casos extremos, los anillos consisten en una o dos filas de células de la madera temprana y una fila de células de la madera tardía aplanadas, que carecen de (en contraste con las células de la madera tardía comunes) paredes celulares engrosadas. Para esto son mejores o incluso sólo visible cuando se utiliza micro secciones. Además, las fluctuaciones de densidad se pueden diferenciar de Límites de anillos más claramente, lo que simplifica la detección de los anillos anuales, especialmente en el Mediterráneo y en los trópicos (Figura 3).

Cuando el análisis de imágenes con un aumento de 40X o más, las células individuales son visibles y el espesor de sus paredes celulares también es detectable. Software de análisis semi-automática permite la medición de parámetros específicos a lo largo de trayectorias definidas siguiendo la dirección de su desarrollo temporal y espacial (Figura 4). Con esto, Changes de parámetros individuales tales como el lumen de células o espesor de la pared celular se pueden determinar en toda la extensión de un anillo anual (Figura 4). Esto se puede hacer para todos los anillos visibles dentro de la imagen y esto es totalmente compatible con la necesidad de un análisis de series de tiempo prolongado.

Análisis de imagen también se pueden utilizar para determinar las fases de desarrollo de los anillos anuales dentro del período de vegetación (Figura 5). Al analizar la imagen de una sección teñida con safranina y Astra-azul usando luz polarizada, incluso las diferentes etapas de lignificación, a partir de las esquinas más exteriores de las paredes de las células hasta que la lignificación completa de la pared celular secundaria, se hacen visibles. Esto se debe a las paredes lignificadas celulares (maduro) brillan en luz polarizada (Figura 5). La información detallada se puede relacionar con los datos ambientales documentados para el período de vegetación correspondiente para determinar, por ejemplo, una más detallada relati clima-crecimiento onship.

Figura 1. Ejemplos de una sección de micro y una superficie plana preparada de un roble incluyendo el anillo de anchura y mediciones del tamaño de los vasos Izquierda:. Ultraperiférica parte de un núcleo mínimo de la subasta de roble. El núcleo de 5 mm de diámetro se cortó usando un microtomo núcleo. La superficie estaba manchada negro con un marcador de fieltro y las células se llena con tiza blanca después de la mancha estaba seco. Derecha: el gráfico se indica mediciones de anillo de anchura y de tamaño de recipiente de hecho en la superficie del núcleo se muestra a la izquierda. No hizo falta ninguna secciones micro para hacer estas mediciones debido a la superficie transparente creado por el microtomo núcleo (modificado después de ^21). Abajo: sección Micro cortaron un núcleo mínimo de la subasta, manchado, deshidratado y fijo en bálsamo de Canadá. Espesor: 20 micras, longitud: 25 cm. g "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Imágenes de micro secciones cortadas sin estabilización frente a un corte sección utilizando la solución de almidón de maíz Izquierda:. Sección Micro mostrando corte artefactos en las traqueidas de la madera temprana de una conífera. La muestra se cortó sin incorporar y como resultado las paredes secundarias en lugar delgadas de las células de la madera temprana se divide fuera de la pared primaria (flechas azules). Derecha: Micro sección sin artefactos en las traqueidas de la madera temprana de una conífera. Esta sección (misma muestra, como se muestra a la izquierda) se cortó después de aplicar la solución de almidón de maíz con un pincel en la parte superior de la superficie de la muestra. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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. Figura 3. Ejemplos de límites de los anillos anuales difícilmente detectable Izquierda: Micro sección de un núcleo de incremento (aquí: Larix decidua) que muestra un límite anillo (flecha negro) se indica por una sola hilera de células de la madera tardía aplanados sin ningún engrosamiento de las paredes celulares. Este anillo no sería visible macroscópicamente. Derecha: fluctuaciones de densidad intra-anuales (flecha blanca) son comunes en especies mediterráneas (micro sección: Quercus ilex). El cambio gradual de la estructura de la célula hacia la madera tardía y de nuevo a la estructura de madera temprana (flecha blanca) permite diferenciar las fluctuaciones de densidad de los límites de los anillos reales (flecha negro). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Ejemplo de área de la luz y de la medición de espesores de pared dentro de un anillo anual de una conífera Top:. Recortables imagen que muestra un resultado de ejemplo de análisis ROXAS en un anillo de árbol de Pinus sylvestris (pino silvestre). Fronteras anillo se muestran en amarillo y se dispone de lumina traqueida en cian. Para un archivo radial (azul lumina traqueida) el espesor de la pared celular de medición está representado por círculos rojos. Barra de escala = 100 micras Negro. Conclusión:. Los cambios intra-anual en el área lumen traqueida y grosor traqueida pared celular para todo el anillo anual Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. example de un anillo anual de formación. La imagen ha sido capturada bajo un microscopio óptico con luz polarizada de una sección micro manchado safranina y Astra-azul obtenido de un micro-núcleo muestreado el ⁷ de julio, 2007 a ​​partir de una Larix decidua creciente en el Lötschental a 1.300 m sobre el nivel del mar. En esta sección micro las células del cambium, las células en la fase de la ampliación, las células en la fase de engrosamiento de la pared y las células maduras son reconocibles. El ancho tangencial de la imagen cubre ~ 1 mm de la sección transversal del xilema. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Los retos de una integración exitosa y sostenible de anatomía de la madera en la investigación dendroecológica son, aparte de problemas analíticos múltiples, sobre todo debido a los aspectos técnicos. Estos desafíos van desde el muestreo principio se acerca a la creación de secciones micro de alta calidad y su posterior análisis ^19.

A primera vista, la toma de muestras de núcleos o incluso discos es un procedimiento simple que se conoce desde hace muchos años. Hay muchas cosas que se pueden hacer mal y una pequeña imprecisión en el muestreo puede resultar en problemas graves durante las fases de preparación y análisis posteriores. Inexactitudes pequeños, tales como extracción de muestras que no es exactamente perpendicular al eje del vástago o el uso de un descorazonador imperfectamente afilado no son un problema si el objetivo del estudio se limita a sonar de ancho mediciones. Sin embargo, cuando el objetivo para el análisis microscópico de las muestras, una dirección de muestreo incorrecto podría resultar en distorsiones ópticas deparedes celulares, mientras que el uso de Corers romos resultados en micro grietas dentro del núcleo. Como resultado, cuando se trata de cortar micro secciones de estos núcleos, las secciones delgadas se derrumbe y una preparación eficiente ya no está garantizada. Lo mismo es cierto para el muestreo micro-núcleo. Una punta roma dará lugar a alta presión cuando la perforadora está clavado en la madera del tronco. En consecuencia, la capa de cambium será comprimido. Las células del cambium (Figura 5) se exprimido y en consecuencia no pueden ser analizados.

Muestreo del disco es sin duda la mejor estrategia en el análisis de las variaciones de crecimiento para relacionarlas con los cambios ambientales. Por desgracia, es simplemente imposible tomar los discos de todos los árboles destinados a muestrear para análisis posteriores. Sin embargo, especialmente en caso de dendrochronology tropical, se necesita una cierta cantidad de discos de tallo en combinación con núcleos de incremento. Los discos se usan como una base para definir los límites de anillo y por esta para apoyar la boundaries definidos basados ​​en el análisis de tacos de crecimiento ^12,27,28.

Los pros y los contras de lijado frente de corte se discuten con frecuencia ^1,11,21. Como se ha mencionado anteriormente, el mejor procedimiento depende siempre de la pregunta de investigación y los parámetros a analizar (macroscópica o microscópica). Si los análisis isotópicos o químicos se proyectan en una etapa de trabajo adicional, es de suma importancia que el polvo abrasivo creado por el lijado que puede llenar en lúmenes de las células en toda la muestra, se retira cuidadosamente con una aspiradora o aire a presión.

Cortar micro secciones es para todos microscópica analiza la forma más adecuada de preparación de muestras para análisis adicionales. En primer lugar, la sección se corta la muestra, que luego se puede mantener sin ninguna contaminación potenciales para análisis adicionales. En segundo lugar estas secciones permiten mediciones de alta resolución de los parámetros de una sola célula. Además, evitando la incrustación tiempotécnica mediante el uso de una solución de almidón de maíz ²⁶ para estabilizar las células es una gran ventaja en micro seccionamiento.

Una desventaja de micro seccionamiento sigue siendo el tamaño limitado de la muestra resultante en largos tiempos de preparación. Para los análisis de series de tiempo real que se remonta en el tiempo durante siglos o incluso milenios, hay una necesidad de desarrollar más los dispositivos existentes de corte ^17,19, pero también de procesamiento de imágenes y análisis de ^18. Un primer paso en esta dirección es el desarrollo de la microtomo núcleo ^21, fabricado inicialmente para cortar superficies planas sobre núcleos (Figura 1). Pruebas recientes revelaron la capacidad de cortar micro secciones de núcleos enteras usando este dispositivo (Figura 1).

Secciones micro de alta calidad proporcionan el principio básico para un análisis de imagen eficaz. Tomando las imágenes en el microscopio es un procedimiento común ^19, pero su análisis efectivo sigue siendo una tarea que necesitaun mayor desarrollo ^17. Todos los sistemas de análisis de imagen existentes son semi-automática, es decir, tienen que ser más o menos intensamente controlado por el técnico. En muchos casos, las imágenes deben ser corregidos o incluso imágenes nuevas tienen que hacer para mejorar el contraste para un mejor registro de las estructuras por el software sin necesidad de cambiar el grosor de la pared celular dentro de la imagen.

Herramientas de análisis de imagen especializados, tales como ROXAS ^18, WinCell o secuencias de comandos específicos para ImageJ ²⁹ son capaces de proporcionar datos anatómicos básicos, tales como el número de células, la dimensión célula, espesor de la pared celular y la posición de la celda dentro del anillo anual. Muchos métricas anatómicas adicionales que son relevantes en un contexto dendroecológica se pueden calcular a partir de estas mediciones básicas tales como el tamaño de los conductos más grandes, la distribución del tamaño de los conductos, el tamaño de la madera temprana o de la primera fila de conductos, (óptico) densidad de la madera, intra-anual perfiles de tamaño del conducto y la pared celularde espesor, y patrones de asociación de conductos (solitaria, múltiplos, etc.).

Utilizando el software ROXAS ^18, los contornos de lumina conducto (es decir, células conductor de agua) y las fronteras anuales anillo se reconocen automáticamente y representan visualmente como superposiciones más de la imagen original. Algoritmos de detección de los conductos se basan en el color, el tamaño y la información de la forma, los algoritmos de detección de fronteras de anillo en el contexto local de cada conducto. Una caja de herramientas nos permite mejorar manualmente estos resultados editando directamente las características de superposición, es decir, la supresión, adición y modificación de las fronteras del anillo y el conducto contornos. Después de la edición, la salida de datos final, incluyendo el espesor de la pared celular (coníferas), se genera y se guarda en una hoja de cálculo de forma automática. Sistemas automatizados totalmente Actualmente no disponible, ni siquiera para las coníferas que muestran una estructura relativamente simple, pero esto es un objetivo para futuros desarrollos. Esto apoyaría firmemente la fuintegración ll de parámetros anatómicos de madera en análisis de series temporales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Incremento			http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article & id=57& Itemid=88& lang=en
Microtomo			http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN
Microtomo			http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN
Micro perforador			http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp
Solución			Diez partes 1% de ácido crómico, cuatro partes 4% formaldehído y una parte de ácido acético
		de Picric-Anilin	Una parte de azul de anilina saturada y cuatro partes de Trinitrofenol disuelto en etanol al 95%
Safranina			(notación de Hill) C20H19ClN4
Astra-blue			(notación de colinas) C47H52CuN14O6S3
etanol			CH3CH2OH
Xilol (Xileno)			Fórmula lineal C6H4(CH3)2
Canada Balsam			Solución de incrustación para microscopía
Roxas Software			http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN
ImageJ Software			http://imagej.nih.gov/ij/
WinCell			http://imagej.nih.gov/ij/