Aquí presentamos un protocolo que genera grandes cantidades de monocitos murinos a partir de médula ósea heterogénea para aplicaciones traslacionales. En comparación con otros, este nuevo método ayuda a reducir el número de animales sacrificados y reduce los costos al evitar métodos costosos como la separación de células magnéticas (MACS) de alto gradiente.
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Artículo de método
Aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos
En este artículo
Resumen
Resumen
Como subtipo de leucocitos y progenitores de macrófagos, los monocitos están involucrados en muchos procesos importantes de los organismos y a menudo son objeto de varios campos en la ciencia biomédica. El método que se describe a continuación es una forma sencilla y eficaz de aislar monocitos murinos de médula ósea heterogénea.
La médula ósea del fémur y la tibia de los ratones Balb/c se extrae mediante lavado con solución salina tamponada con fosfato (PBS). La suspensión celular se complementa con el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y se cultiva en superficies de unión ultrabajas para evitar la diferenciación de monocitos provocada por la adhesión. Las propiedades y la diferenciación de los monocitos se caracterizan en varios intervalos. Para el fenotipado se utiliza la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), con marcadores como CD11b, CD115 y F4/80. Al final del cultivo, la suspensión consta de un 45%± un 12% de monocitos. Al eliminar los macrófagos adhesivos, la pureza se puede aumentar hasta un 86%± un 6%. Después del aislamiento, los monocitos se pueden utilizar de varias maneras, y uno de los métodos más efectivos y comunes para la administración in vivo es la inyección intravenosa de la vena de la cola.
Esta técnica de aislamiento y aplicación es importante para los estudios de modelos de ratón, especialmente en los campos de la inflamación o la inmunología. Los monocitos también se pueden utilizar terapéuticamente en modelos de enfermedad en ratones.
Introducción
El aislamiento de monocitos es importante y crítico para muchos estudios in vitro e in vivo. Estas células son dianas de enfermedades como la enfermedad arterial periférica, la enfermedad coronaria u otras enfermedades isquémicas, ya que el crecimiento de los vasos colaterales está fuertemente impulsado por la inflamación local. Las respuestas inflamatorias incluyen la activación endotelial y el reclutamiento local de leucocitos, principalmente monocitos, que luego maduran a macrófagos y crean un entorno altamente arteriogénico mediante la secreción de múltiples factores de crecimiento para inducir la remodelación de una arteriola en una arteria cola....
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Protocolo
Este estudio se realizó con permiso del Estado de Sajonia y Sajonia-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, de acuerdo con el Artículo 8 de la Ley alemana de protección de los animales (24D-9168,11-1 / 2008-24).
Aislamiento 1 celular
1.1 Preparación de fémur y la tibia
- Anestesiar al ratón usando una concentración de isoflurano 5% mediante la vaporización de isoflurano en un contenedor cerrado. Después de que el ratón ha dejado de moverse durante 3 segundos, realice la dislocación cervical.
- Desinfectar las extremidades traseras con etanol (96%). Quite la piel y los músculos y separar los....
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Resultados
La solución de células extraída de la médula ósea murina se compone de diversos tipos de células. Los tipos de células principales son los linfocitos, granulocitos y monocitos. Los tipos de células pueden ser estimados por el tamaño y la granularidad, que se muestra en la Figura 1 para ambas suspensiones nativas y células cosechadas después de 5 días de diferenciación. Tenga en cuenta la composición celular cambiando durante el cultivo. Sin embargo, la clasificación exacta de las poblaciones debe confia.......
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Discusión
Se describe un método simple y rentable para aislar grandes cantidades de monocitos murinos de la médula ósea. En comparación con otros protocolos que utilizan la sangre periférica, que obtienen rendimientos de monocitos 5 de 1,4 x10 6, somos capaces de obtener mayores rendimientos de 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monocitos de un solo ratón donante.
Al considerar los desafíos con este método, es importante mencionar la posibilidad de contaminación cuando se.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Fundación Alemana de Investigación) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, centro de investigación colaborativo).
Gracias a Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Universidad Otto-von-Guericke de Magdeburgo, Magdeburgo, Alemania, por su soporte técnico.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de fijación ultra baja de 6 pocillos | Corning Incorporated, NY, EE. UU | Placa de fijación ultra baja de 6 pocillos, con tapón, estéril | |
| de 8 a 12 semanas de edad, macho, ratones balb/c | Charles River, Sulzfeld, Alemania | ||
| Placa de 96 pocillos | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Alemania | ||
| Tinción azul de células muertas | Life technologies GmbH, Darmstadt, Alemania | ||
| Albúmina sérica bovina | GE Healthcare, Friburgo, Alemania | Fracción V, pH 7.0 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Alemania | 28G, 30G | |
| CD115 | eBioscience, San Diego, EE. UU. | 12-1152 | |
| CD11b | eBioscience, San Diego, EE. UU. | 53-0112 | |
| Placa de cultivo celular | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania | Con tapón, estéril | |
| Centrífuga | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Alemania | Allegra® Centrífuga X-15R | |
| Crema depilatoria | Veet, Mannheim, Alemania | ||
| Agente desinfectante | Schü lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Alemania | Kodan Tinktur forte | |
| Bistur desechable No.10 | Maquinilla de afeitar de seguridad de plumas Co.Ltd, Osaka, Japón | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania | ||
| Etanol 96% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrü cken, Alemania | ||
| Unidad de extracción Pipetus | Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co.KG, Eberstadt, Alemania | ||
| F4/80 | AbD Serotec, Dü sseldorf, Alemania | MCA497APC | |
| tampón FACS | Fabricado por nuestro grupo con un solo componente | PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3 | |
| FACS | dispositivo Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, Nueva Jersey, EE. UU | BD FACS Canto II | |
| FACS tubes | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, Nueva Jersey, EE. UU. | ||
| Falcon® pipeta | Becton Dickenson Labware, NY, EE. UU. | ||
| Suero fetal para terneros | Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania | ||
| Pinzas finas | Rubis, Stabio, Suiza | ||
| Guantes | Rö sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Alemania | ||
| Gr1 | eBioscience, San Diego, EE. UU | 53-5931 | |
| Placa calefactora | Labotect GmbH, Gö ttingen, Alemania | Placa caliente 062 | |
| Incubadora | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Alemania | Incu safe | |
| Isofluran | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleiß heim, Alemania | ||
| Microscopio óptico | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Alemania | Axiovert 40 ° C | |
| Factor estimulante de colonias de macrófagos | Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania | SRP3110 | |
| Agitador mecánico | IKA, Staufen, Alemania | MS2 minishaker | |
| Medium 199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | Warm in 37 ° C baño de agua antes | |
| de usar Microtubos de ensayo | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania | ||
| Banco de trabajo microbiológico | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Alemania | Hera safe | |
| Tampón de lavado de monocitos | Fabricado por nuestro grupo con componentes individuales | PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA | |
| Sujetador de ratón | Varios | ||
| NaCl | Berlin Chemie AG, Berlín, Alemania | ||
| NaN3 (ácido de sodio) | Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania | ||
| Cámara de recuento Neubauer | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö nigshofen, Alemania | ||
| Cellsieve de nylon | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, Nueva Jersey, EE. UU. | Colador de celdas, 70 µ m tamaño de malla | |
| Penicilina/Estreptomicina | Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania | ||
| Solución salina tamponada con fosfato | Life technologies GmbH, Darmstadt, Alemania | pH 7,4, | |
| pipetas estériles | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania | 10µ l/100 y micro; l/200 y micro; l/1.000 y micro; l | |
| Cabezales de pipeteo | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania | ||
| Pipeta serológica | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania | Cellstar 5 ml, 10 ml | |
| Unidad de succión | Integra bioscience, Fernwald, Alemania | Vacusafe comfort | |
| Tijeras quirúrgicas | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, EE. UU | ||
| . | JeringaB. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Alemania | Jeringa de insulina Omnifix® -F de 1 ml | |
| Tubos con tapón | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Alemania | 15 ml/50 ml Tubos Cellstar Baño de | |
| agua caliente | Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Alemania | Julabo SW22 |
Referencias
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15 (1), 1-12 (2004).
- Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C.
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Reimpresiones y permisos
