Aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos

Resumen

Aquí presentamos un protocolo que genera grandes cantidades de monocitos murinos a partir de médula ósea heterogénea para aplicaciones traslacionales. En comparación con otros, este nuevo método ayuda a reducir el número de animales sacrificados y reduce los costos al evitar métodos costosos como la separación de células magnéticas (MACS) de alto gradiente.

Resumen

Como subtipo de leucocitos y progenitores de macrófagos, los monocitos están involucrados en muchos procesos importantes de los organismos y a menudo son objeto de varios campos en la ciencia biomédica. El método que se describe a continuación es una forma sencilla y eficaz de aislar monocitos murinos de médula ósea heterogénea.

La médula ósea del fémur y la tibia de los ratones Balb/c se extrae mediante lavado con solución salina tamponada con fosfato (PBS). La suspensión celular se complementa con el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y se cultiva en superficies de unión ultrabajas para evitar la diferenciación de monocitos provocada por la adhesión. Las propiedades y la diferenciación de los monocitos se caracterizan en varios intervalos. Para el fenotipado se utiliza la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), con marcadores como CD11b, CD115 y F4/80. Al final del cultivo, la suspensión consta de un 45%± un 12% de monocitos. Al eliminar los macrófagos adhesivos, la pureza se puede aumentar hasta un 86%± un 6%. Después del aislamiento, los monocitos se pueden utilizar de varias maneras, y uno de los métodos más efectivos y comunes para la administración in vivo es la inyección intravenosa de la vena de la cola.

Esta técnica de aislamiento y aplicación es importante para los estudios de modelos de ratón, especialmente en los campos de la inflamación o la inmunología. Los monocitos también se pueden utilizar terapéuticamente en modelos de enfermedad en ratones.

Introducción

El aislamiento de monocitos es importante y crítico para muchos estudios in vitro e in vivo. Estas células son dianas de enfermedades como la enfermedad arterial periférica, la enfermedad coronaria u otras enfermedades isquémicas, ya que el crecimiento de los vasos colaterales está fuertemente impulsado por la inflamación local. Las respuestas inflamatorias incluyen la activación endotelial y el reclutamiento local de leucocitos, principalmente monocitos, que luego maduran a macrófagos y crean un entorno altamente arteriogénico mediante la secreción de múltiples factores de crecimiento para inducir la remodelación de una arteriola en una arteria colateral funcional^1-3. Los monocitos también maduran hasta convertirse en células dendríticas, que se utilizan con frecuencia para estudios inmunológicos^4,5 y para la investigación del cáncer^6,7.

Problemático en el enfoque para el aislamiento de monocitos de sangre periférica⁸ es el alto número de animales donantes necesarios para producir una cantidad suficiente de monocitos para la mayoría de los análisis. Los protocolos anteriores describen métodos como la centrifugación en gradiente de densidad y el agotamiento celular a través de MACS⁹ al aislar monocitos; Sin embargo, estas técnicas pueden alterar las características y la funcionalidad de los monocitos, lo que puede llevar a dificultades en la interpretación^10,11. Además, estos métodos son difíciles y pueden reducir la reproducibilidad experimental.

Nuestro objetivo con este protocolo es proporcionar un método simple y rentable para generar grandes cantidades de monocitos derivados de la médula ósea. Debido al alto rendimiento celular de células 11 x 10⁶ ± 3 x 10⁶ células obtenido por este protocolo, podemos reducir sustancialmente el número de ratones necesarios durante el aislamiento de monocitos derivados de la médula ósea. El procedimiento se puede completar en un tiempo mínimo y sin utilizar técnicas costosas y complicadas como las mencionadas anteriormente. Aquí, extraemos monocitos de la suspensión de médula ósea nativa de ratones donantes, cultivamos la suspensión en placas de fijación ultrabajas y complementamos la solución con 20 ng/ml de M-CFS. En el día 5 de incubación, las células se cosechan y caracterizan para confirmar las propiedades funcionales y fenotípicas.

Para los experimentos en el campo de la arteriogénesis, el trasplante intravenoso de estos monocitos derivados de la médula ósea en ratones es un método eficaz de administración sistémica de fármacos, que puede combinarse con la ligadura de la arteria femoral en modelos comunes de enfermedad arterial periférica.

Protocolo

Este estudio se realizó con permiso del Estado de Sajonia y Sajonia-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, de acuerdo con el Artículo 8 de la Ley alemana de protección de los animales (24D-9168,11-1 / 2008-24).

Aislamiento 1 celular

1.1 Preparación de fémur y la tibia

1. Anestesiar al ratón usando una concentración de isoflurano 5% mediante la vaporización de isoflurano en un contenedor cerrado. Después de que el ratón ha dejado de moverse durante 3 segundos, realice la dislocación cervical.
2. Desinfectar las extremidades traseras con etanol (96%). Quite la piel y los músculos y separar los huesos con un bisturí estéril.
   1. Comience con una incisión en la piel inguinal, y extender la incisión hacia el maléolo interno y realizar una disección circular de la piel alrededor de la pantorrilla. Retire la piel de las piernas completamente por pelarla proximal.
   2. Separe el músculo cuádriceps del fémur con un bisturí afilado, eliminar tanto las peroneo anteriory los grupos de músculos gastrocnemios y desarticular la pierna en la articulación de la cadera mediante la localización y la disección de los ligamentos.
   3. Iniciar anterior y proceder alrededor de la articulación, girando con cuidado la pierna y seccionar los ligamentos, desarticulando con ello la articulación.
3. Lavar fémur y la tibia con etanol al 96% durante un mínimo de 90 segundos para garantizar la preparación de células aséptico. Continuar el proceso de lavado con PBS estéril para enjuagar el etanol restante.
   Nota: Todas las etapas posteriores deben ser estériles para evitar la contaminación.

1.2 La recolección de médula ósea

1. Cortar el extremo proximal y distal de cada hueso con un par de tijeras finas para obtener acceso a los ejes femoral y tibial. Tenga cuidado con este paso, ya que estos huesos se rompen con mucha facilidad.
2. Lavar los huesos con medio caliente (M199 + 10% de suero de ternera fetal (FCS), + 1% de penicilina / estreptomicina). Utilice una aguja estéril 28-G, una jeringa de 1 ml, y entre 10-15 ml por medio dehueso para enjuagar.
3. Sostenga el hueso con pinzas finas y enjuague uno por uno hasta que se vuelva semi-transparente. Cuidado aplique presión al extremo del émbolo de jeringa con el fin de minimizar el estrés celular.
4. Filtrar la médula ósea a través de una web nylon 70 micras y recoger el filtrado. Para extraer la cantidad máxima de médula ósea, enjuagar varias veces desde los extremos distal y proximal.
5. Enjuague el tamiz con PBS y recoger el filtrado. Desalojar cuidadosamente escombros y conglomerados celulares por agitación suave y pipeta.

1.3 Cultivo

1. Centrifugar la suspensión celular a 250 xg durante 10 min a TA. Desechar el sobrenadante y resuspender las células con aproximadamente 25 ml de medio. Repetir una vez.
2. Resuspender las células en 6 ml de medio después de la segunda etapa de lavado. Mezclar 50 l de la solución de células con 50 l de azul de tripano. Contar las células en una cámara de recuento bajo un microscopio de luz. Calcular el número de cells en la solución utilizando esta fórmula:
   
3. Seed las células en placas de superficie ultra-bajo de fijación 6 pocillos para evitar la adhesión permanente a la parte inferior de la placa. Utilice una concentración de 10 ⁶ células por ml con un máximo de 6 ml por pocillo.
4. Suplemento de la suspensión con 20 ng / ml de M-CSF para promover la diferenciación celular.
5. Cultivar las células durante 5 días a 37 ° C y el dióxido de carbono al 5% y observar todos los días.

1.4 La recolección de células

Nota: Estos pasos se deben realizar en hielo. Proceda con cualquiera 1.4.1 o 1.4.2 en consecuencia.

1. En este punto, efectuar toda la cultura, incluyendo macrófagos diferenciados que se adherirá a la cultura placas, incluso si son placas de superficie ultra bajo de apego.
   1. Efectuar toda la cultura por pipeteo suave y separar con una solución de 4 ° C PBS, 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA) y EDTA 2 mM. Repita hasta que las placas son claras de quedarse células adherentes - confirmar con un microscopio si no está seguro.
2. Alternativamente, desechar los macrófagos adherentes al cosechar el sobrenadante con las células en suspensión, que contienen predominantemente monocitos.
   1. Recoger las células no adherentes con una solución de PBS-EDTA libre y 0,5% de BSA. No aplique demasiada fuerza con el fin de evitar que se desprenda macrófagos ligeramente adherentes.

1.5 FACS-análisis (Opcional)

Nota: Es posible agotar la suspensión celular de células progenitoras stem- y CD117 ⁺ por el uso de MACS. Utilice los protocolos del fabricante para este procedimiento.

1. Recoger las células de acuerdo a cualquiera de los pasos 1.4.1 o 1.4.2.
2. Centrifugar las células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C y repetir este paso de nuevo.
3. Volver a suspender al menos 250.000 células en 300 l de FACS bUffer por sonda.
4. Transferencia de solución de células en un 96 pocillos de la placa (30 l por pocillo).
5. Centrifugar la suspensión celular a 250 xg durante 5 min a 4 ° C.
6. Eliminar el sobrenadante y añadir 25 l de anticuerpo a cada pocillo (dilución de uso del fabricante).
7. Teñir las células con anticuerpos (siguientes protocolos del fabricante para el fenotipado de células después de los pasos 1.5.1-1.5.6. Marcadores comúnmente utilizados para la identificación de monocitos / macrófagos incluyen CD11b, F4 / 80 (Figura 3), CD115 (Figura 2), y Gr- 1.
   Nota: Para obtener una descripción más amplia de soluciones de células, se recomienda el uso de marcadores como CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G y CD192. Características celulares se han descrito anteriormente ^12.
8. Se incuban las sondas para 20 min a 4 ° C.
9. Centrifugar las sondas a 250 xg durante 5 min a 4 ° C y resuspender con 200 l de tampón FACS. Repita ªes el paso dos veces.
10. Transferir las sondas en tubos de FACS y realizar el análisis FACS ^12.
11. Realizar análisis FACS ¹² en el día 0, 3 y 5 para analizar la diferenciación celular.

2. vena de la cola de inyección

2.1 Preparación

1. Calentar los animales en una placa de calentamiento a 37 ° C durante unos 10 minutos. Observar a los animales mientras se calentaba a reconocer los signos de sobrecalentamiento.
2. Resuspender los monocitos, aislados en pasos 1.1- 1.4, en 150 l de NaCl, y cargar las células en una jeringa de 1 ml de insulina con una aguja 30G. Ligeramente agite la solución antes de cargar la jeringa para asegurar que todos los monocitos se inyectan. Siempre manipular células en hielo para evitar la fijación mediada por el calor y la activación de los monocitos.

2.2 Restricción

1. Evitar molestar a otros ratones en la jaula la hora de elegir un ratón para inyección intravenosa.
2. Coloque el ratón en el inmovilizador. Evite el exceso de prEssure y tenga cuidado con las extremidades posteriores. (Figura 4)
   Nota: También puede utilizar anestesia general para garantizar el estrés libre manejo de los animales.
3. Asegúrese de que el ratón dispone de espacio para respirar antes de cerrar el inmovilizador.

2.3 Inyección

1. Desinfectar el lugar de inyección con un agente de desinfección. Rocíe en la cola del ratón y dejar reposar durante al menos 1 min.
2. Detenga el flujo de sangre venosa de la cola mediante la aplicación de una presión suave en la parte lateral de la cola por encima de la zona de inyección, para una mejor visibilidad de las venas.
3. Gire la cola 90 grados, antes de la inyección. (Figura 5)
4. Inyectar en un ángulo de 45 grados. Inyectar lentamente y no más de 5 l por g para evitar dañar a los animales.
5. Si hay una ampolla, que es un signo de una inyección fallado, descontinuar inmediatamente y repetir la inyección más proximal.
6. Detenga el sangrado en el lado de la inyección mediante la aplicación de p suaveresión durante aproximadamente 1 min.
7. Al final del procedimiento, abra el retractor y colocar el ratón en su jaula.
8. Observe el ratón durante 20 minutos para asegurarse de que el animal no se vea perjudicada por la inyección y decúbito esternal se mantiene. Extender el momento de la observación hasta que el ratón recupera la conciencia suficiente. Devuelva el ratón a la compañía de otros animales sólo después de que se ha recuperado totalmente.

Resultados

La solución de células extraída de la médula ósea murina se compone de diversos tipos de células. Los tipos de células principales son los linfocitos, granulocitos y monocitos. Los tipos de células pueden ser estimados por el tamaño y la granularidad, que se muestra en la Figura 1 para ambas suspensiones nativas y células cosechadas después de 5 días de diferenciación. Tenga en cuenta la composición celular cambiando durante el cultivo. Sin embargo, la clasificación exacta de las poblaciones debe confia...

Discusión

Se describe un método simple y rentable para aislar grandes cantidades de monocitos murinos de la médula ósea. En comparación con otros protocolos que utilizan la sangre periférica, que obtienen rendimientos de monocitos ⁵ de 1,4 x10 ^6, somos capaces de obtener mayores rendimientos de 11 x 10 ⁶ ± 3 x 10 ⁶ monocitos de un solo ratón donante.

Al considerar los desafíos con este método, es importante mencionar la posibilidad de contaminación cuando se...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de fijación ultra baja de 6 pocillos	Corning Incorporated, NY, EE. UU		Placa de fijación ultra baja de 6 pocillos, con tapón, estéril
de 8 a 12 semanas de edad, macho, ratones balb/c	Charles River, Sulzfeld, Alemania
Placa de 96 pocillos	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Alemania
Tinción azul de células muertas	Life technologies GmbH, Darmstadt, Alemania
Albúmina sérica bovina	GE Healthcare, Friburgo, Alemania		Fracción V, pH 7.0
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Alemania		28G, 30G
CD115	eBioscience, San Diego, EE. UU.	12-1152
CD11b	eBioscience, San Diego, EE. UU.	53-0112
Placa de cultivo celular	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania		Con tapón, estéril
Centrífuga	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Alemania		Allegra® Centrífuga X-15R
Crema depilatoria	Veet, Mannheim, Alemania
Agente desinfectante	Schü lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Alemania		Kodan Tinktur forte
Bistur desechable No.10	Maquinilla de afeitar de seguridad de plumas Co.Ltd, Osaka, Japón
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania
Etanol 96%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrü cken, Alemania
Unidad de extracción Pipetus	Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co.KG, Eberstadt, Alemania
F4/80	AbD Serotec, Dü sseldorf, Alemania	MCA497APC
tampón FACS	Fabricado por nuestro grupo con un solo componente		PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3
FACS	dispositivo Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, Nueva Jersey, EE. UU		BD FACS Canto II
FACS tubes	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.
Falcon® pipeta	Becton Dickenson Labware, NY, EE. UU.
Suero fetal para terneros	Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania
Pinzas finas	Rubis, Stabio, Suiza
Guantes	Rö sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Alemania
Gr1	eBioscience, San Diego, EE. UU	53-5931
Placa calefactora	Labotect GmbH, Gö ttingen, Alemania		Placa caliente 062
Incubadora	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Alemania		Incu safe
Isofluran	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleiß heim, Alemania
Microscopio óptico	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Alemania		Axiovert 40 ° C
Factor estimulante de colonias de macrófagos	Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania	SRP3110
Agitador mecánico	IKA, Staufen, Alemania		MS2 minishaker
Medium 199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria		Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar Microtubos de ensayo	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania
Banco de trabajo microbiológico	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Alemania		Hera safe
Tampón de lavado de monocitos	Fabricado por nuestro grupo con componentes individuales		PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA
Sujetador de ratón	Varios
NaCl	Berlin Chemie AG, Berlín, Alemania
NaN3 (ácido de sodio)	Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania
Cámara de recuento Neubauer	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö nigshofen, Alemania
Cellsieve de nylon	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.		Colador de celdas, 70 µ m tamaño de malla
Penicilina/Estreptomicina	Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania
Solución salina tamponada con fosfato	Life technologies GmbH, Darmstadt, Alemania		pH 7,4,
pipetas estériles	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania		10µ l/100 y micro; l/200 y micro; l/1.000 y micro; l
Cabezales de pipeteo	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania
Pipeta serológica	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania		Cellstar 5 ml, 10 ml
Unidad de succión	Integra bioscience, Fernwald, Alemania		Vacusafe comfort
Tijeras quirúrgicas	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, EE. UU
.	JeringaB. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Alemania		Jeringa de insulina Omnifix® -F de 1 ml
Tubos con tapón	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Alemania		15 ml/50 ml Tubos Cellstar Baño de
agua caliente	Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Alemania		Julabo SW22