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Artículo de método

Culturas organotípicos rebanada de Estudios de Postnatal neurogénesis

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DOI:

10.3791/52353

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4 de marzo de 2015

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Toronto, 2Institute of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, National Yang-Ming University, 3Department of Education and Research, Taipei City Hospital

En este artículo

Resumen

Aquí se describe una técnica para el estudio de la neurogénesis postnatal del hipocampo mediante la técnica de cultivo de cortes organotípicos. Este método permite la manipulación in vitro de la neurogénesis adulta y permite la aplicación directa de agentes farmacológicos para el hipocampo cultivadas.

Resumen

Aquí se describe una técnica para el estudio de la neurogénesis postnatal del hipocampo en el cerebro de roedores mediante la técnica de cultivo de cortes organotípicos. Este método mantiene la morfología característica topográfica del hipocampo al tiempo que permite la aplicación directa de agentes farmacológicos a las desarrollo giro dentado del hipocampo. Además, los cultivos de cortes se pueden mantener durante un máximo de 4 semanas y por lo tanto, permiten a uno a estudiar el proceso de maduración de las neuronas granulares nacidos. Cultivos de cortes permiten la manipulación farmacológica eficaz de los cortes de hipocampo excluyendo variables complejas tales como las incertidumbres relacionadas con la localización anatómica profunda del hipocampo, así como la barrera hematoencefálica. Por estas razones, hemos tratado de optimizar cultivos de cortes organotípicos específicamente para la investigación neurogénesis postnatal.

Introducción

La neurogénesis adulta en el hipocampo de los mamíferos representa un ejemplo notable de la capacidad innata del cerebro para la adaptabilidad y la plasticidad. Las células granulosas dentadas (DGC) se generan a partir de un grupo renovable de células progenitoras neurales en el giro dentado del hipocampo, que es una de las dos regiones neurogénicas actualmente bien caracterizadas en el cerebro de los mamíferos, y se cree que es particularmente importante para el aprendizaje y la memoria. El hipocampo es parte del sistema límbico y tiene una ubicación profunda dentro del cerebro de los mamíferos, lo que lo convierte en un objetivo difícil para la manipulación farmacológica precisa. Además, la neurogénesis aberrante se ha implicado en enfermedades como la epilepsia, la esquizofrenia y la enfermedad de Alzheimer, lo que ha despertado el interés por comprender la influencia de diversos agentes farmacológicos durante la maduración y supervivencia de las neuronas recién nacidas. La distinción entre neurogénesis postnatal y adulta es borrosa y estudios previos han demostrado que muchas características del desarrollo neuronal in vivo en el período postnatal temprano y en la edad adulta son similares25. Aquí enfatizamos la neurogénesis postnatal y sugerimos posibles aplicaciones a la neurogénesis adulta.

Los cultivos organotípicos de cortes proporcionan un método in vitro eficiente para estudiar diversas propiedades fisiológicas del hipocampo de los mamíferos. El valor de los cultivos en rodajas preparados a partir de cerebros de roedores se puede resumir en tres cualidades principales: 1) el protocolo es sencillo y requiere materiales fácilmente disponibles; 2) los cultivos de cortes permiten realizar estudios farmacológicos que eliminan variables complejas como la localización anatómica profunda del hipocampo y eluden la barrera hematoencefálica1; y 3) se conserva la estructura bien caracterizada del hipocampo y del circuito trinináptico2. Investigadores anteriores han utilizado el cultivo organotípico del hipocampo para estudiar el desarrollo sináptico y la fisiología3,4, la gliogénesis5-7, el daño cerebral isquémico8,9, la neuroprotección y neuroreparación10-12, así como la epilepsia13-15. Los cultivos de cortes también podrían proporcionar un sistema modelo útil que permita el seguimiento del desarrollo celular junto con el marcaje de células con proteína verde fluorescente (GFP) u otros marcadores vitales.

Los cultivos en rodajas también se han empleado previamente para estudiar la neurogénesis postnatal del hipocampo16-19, pero un factor importante en la mayoría de estos estudios es la degeneración bien caracterizada que resulta de la explantación de tejido de animales adultos después de aproximadamente 2 semanas in vitro20,21. Por esta razón, los cultivos de cortes se preparan típicamente a partir de ratones o crías de rata postnatales tempranos (P5-P10), lo que utiliza la viabilidad mejorada del tejido cerebral postnatal temprano para el cultivo22. Si bien estudios previos han demostrado que el hipocampo postnatal temprano y adulto difiere con respecto a la fisiología sináptica y la expresión de subtipos neuronales específicos23,24, existe una conservación sustancial del programa de desarrollo coreografiado por el que pasan las células granulosas dentadas del recién nacido durante la maduración25. Además, estudios recientes han sugerido que las características fisiológicas de las DGC recién nacidas en cultivo son muy similares a las neuronas inmaduras en la preparación del corte agudo del hipocampo16.

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Protocolo

NOTA: Todos los animales procedimientos se ajustaban a las normas de salud y bienestar de los animales del Departamento de Medicina Comparada en la Universidad de Toronto.

1. Preparación del hipocampo rebanadas

  1. Esterilizar los siguientes instrumentos utilizando el autoclave seco a 125 ° C: mango de bisturí (# 3) (2), fórceps patrón estándar, grande (1), pequeña tijera de disección (angulado a lado) (1), Micro cuchara (cuchara y plana extremos espátula) (1), Micro-espátulas (redondeadas y redondeados extremos afilados) (2), Cena de pincel (1), Fuego pulido pipeta Pasteur (2), plazas de gasa, 2 x 2 pulgadas (5).
  2. Cuando estéril, poner los instrumentos en un recipiente estéril y mantener cubierto hasta su uso. Inmediatamente antes de la disección, sumergir los instrumentos en una solución de etanol al 70%.
  3. Preparar una placa de cultivo de 6 pocillos con inserto de cultivo antes de comenzar el procedimiento de disección mediante la adición de 1 ml de medio de cultivo / pocillo y el almacenamiento de la placa en la incubadora a 35 ° C unand 5% de CO 2.

2. Organizar herramientas de disección en la campana estéril de Flujo Laminar

  1. Pulverizar la campana de flujo laminar con etanol al 70% y eliminación de instrumentos de disección esterilizadas de alcohol. Permita que los instrumentos se sequen mientras descansa en una placa de Petri estéril para evitar el contacto entre el alcohol y el tejido cerebral diseccionado.
  2. Depósito 5-7 ml de solución de disección helada esterilizado en 2 grandes placas de Petri estériles. Un plato enfriará y limpiar la cabeza (sucio), el otro para la refrigeración y enjuagar el cerebro excavado (limpio). Colocar un papel de filtro esterilizado en una de las tapas de los recipientes de Petri para la disección de cerebro.
  3. Coloque un filtro de papel pequeña, esterilizada en una pequeña tapa de la placa de Petri para disecar el hipocampo. Depósito 3-5 ml de solución de disección helada esterilizado en 2 pequeños platos, Petri estériles. Un plato celebrará el hipocampo excavado, uno se mantenga secciones durante la separación de secciones de hipocampobajo el microscopio de disección.
  4. Preparar el cortador de tejidos con cinta adhesiva un trozo de papel de filtro esterilizado a la etapa de corte y el montaje de una hoja de afeitar estéril. Mojar el papel de filtro con una solución de disección esterilizado.
  5. Rocíe una bio-bolsa limpia con alcohol y lo coloca en el flujo laminar banco limpio.

3. Disección del hipocampo

  1. Rocíe la cría de rata P7 Sprague Dawley con etanol al 70% fuera del flujo laminar banco limpio y decapitar rápidamente al animal utilizando grandes tijeras quirúrgicas estériles dentro de la cabina de flujo laminar. Dejó caer la cabeza en la solución de disección enfriado con hielo en una de las placas de Petri.
  2. En la placa de Petri, enjuagar la sangre y rápidamente transferir la cabeza a un papel de filtro esterilizado, lado ventral hacia abajo.
  3. Utilizando el bisturí, corte a lo largo de la superficie dorsal en el plano sagital para exponer el cráneo subyacente. Cortar a través de la piel, pero no el hueso subyacente, que es suave y fácilmente penetrable en ratas de tsu edad. Ponga a un lado este bisturí "sucio" y no utilizar en el tejido cerebral.
  4. Usando las tijeras pequeñas disector (ángulo a lado) y pinzas, corte abierto el cráneo a lo largo de la sutura sagital del cráneo para bregma, el punto anatómico en el cráneo donde la sutura coronal se cruza perpendicularmente por la sutura sagital. El uso de fórceps para tirar de las aletas del cráneo arriba y lejos de la línea media del cráneo.
  5. Coloque la cuchara micro en la parte inferior del cerebro, debajo del tronco cerebral, para levantar suavemente el cerebro fuera del cráneo. Levantar el cerebro para exponer los nervios ópticos y bulbo olfatorio en la superficie basal del cerebro. Cortar estas estructuras con unas tijeras pequeñas para separar completamente el cerebro del cráneo. Retire y transferir el cerebro intacto a la otra placa de Petri grande que contiene solución de disección enfriado con hielo.
  6. El uso de la cuchara micro, transferir el cerebro a una pequeña tapa placa de Petri que contiene papel de filtro estéril. Con una pipeta Pasteur estéril, enjuague el cerebro con unas pocas gotas de dispreo solución para mantener el tejido húmedo.
  7. Usando una hoja de bisturí "limpia" cortar las dos hemisferios separados. Transferir el hemisferio izquierdo de nuevo a gran placa de Petri con micro cuchara y colocar lado pia hemisferio en solución de disección helada para su uso posterior.
  8. Ver la cara medial del hemisferio derecho e identificar el fondo de saco de borde, una banda prominente de la materia blanca a lo largo del borde medial del hipocampo. Con un bisturí estéril, hacer un corte sagital a través del fondo de saco, pero tenga cuidado porque sólo 0,5 cm de la punta de bisturí serán suficientes para reducir el fondo de saco.
  9. Usando 2 micro-espátulas, retire la primera hipocampo del hemisferio derecho, colocando la mano derecha-espátula en el tronco cerebral y el levantamiento de la corteza que recubre con la espátula de la izquierda. Levante suavemente la corteza para revelar el ventrículo lateral y la superficie medial del hipocampo. Una línea curva blanco, la fimbria, ahora debe ser visible.
  10. Alinear la curvatura de la espátula con la curvatura de la fimbria y presionar suavemente la espátula bajo la fimbria. Deslice la espátula a la izquierda y viajar a lo largo del eje rostral-caudal y luego levantar la espátula en dirección dorsal para eliminar hipocampo.
  11. Transferir el hipocampo a un plato pequeño nd 2 Petri con solución de disección enfriado con hielo. Repita el mismo procedimiento en el hemisferio izquierdo para eliminar el hipocampo izquierdo.
  12. Usando una espátula micro, transferir cuidadosamente el hipocampo a la etapa de cortador de tejidos. Arréglelos adyacentes y paralelos entre sí y perpendiculares al eje de la cuchilla de corte. Utilice un pincel para colocar el tejido y añadir unas gotas de la solución de disección en la parte superior de los hipocampos.
  13. Cortar el tejido en 400 micras rodajas sin detenerse para eliminar cortes individuales (por lo general no se unirán a la hoja). Después de todo el hipocampo se ha cortado, utilice el pincel para transferir suavemente las secciones a un nd plato pequeño 2 Petri con solución de disección.
  14. Bajo anuncioissecting microscopio, separar cuidadosamente las rodajas flotantes utilizando amicro-espátula y pincel.
  15. Retire la placa de cultivo previamente preparada con la cultura de inserción de la incubadora y el lugar en una campana de flujo laminar.
  16. Utilizando una pipeta Pasteur pulida al fuego, dibujar 4-5 rebanadas en las rebanadas de pipeta y transferir a la superficie apical de la membrana de inserción del cultivo. A continuación, ajustar la posición con un pincel y dejar espacio entre las secciones individuales y de la frontera de la inserción de la cultura.
  17. Utilizando una pipeta Pasteur estéril, eliminar la solución de disección exceso de la superficie apical de la membrana.
    NOTA: Al retirar solución no llamar la secciones de tejido en la pipeta. Alternativamente, utilice una pipeta regular (P200 o P1000) con puntas de pipeta estériles para eliminar lentamente solución.
  18. Coloque la placa de cultivo con medio de cultivo que contiene suero y las rodajas de hipocampo de nuevo en el incubador a 35 ° C y 5% de CO 2.
    NOTA: Si las llamadas de experimentaciónpara generar culturas de varios animales, limpiar a fondo el flujo laminar banco limpio entre disecciones. Instrumentos Regreso a solución de alcohol y reemplazar todas las placas Petri, filtros de papel y hojas de afeitar estéril antes de la segunda disección.

4. Alimentación y mantenimiento organotípicos rodajas

  1. Culturas de alimentación en un banco limpio de flujo laminar estéril.
  2. Realizar la primera alimentación de las secciones de cultivo 2 días después de la disección. Aspirar medio de cultivo de edad con una pipeta de vidrio esterilizado.
  3. Utilice estériles 5 ml pipeta serológica para añadir 1 ml de medio fresco, estéril, que contiene suero a los pocillos.
  4. Reemplazar suavemente el inserto de cultivo y tener cuidado para eliminar las burbujas de aire que puedan haberse formado debajo de la superficie de la membrana.
  5. Después de la primera alimentación, cambio de medio cada dos días.

5. La incubación de cortes de tejido con timidina Análogos para etiquetar recién nacido neuronas

  1. Con el fin de estudiarla maduración y la integración de las células granulares dentadas en el hipocampo, se incuban las rebanadas organotípicos con un análogo de timidina, tales como bromodesoxiuridina (BrdU) o Chlorodeoxyuridine (CldU). Aquí, nosotros usamos CldU debido a su mayor solubilidad en solución salina.
  2. Después de 3div, añadir 1 l de 10 mg ml de solución madre / CldU en solución salina a 1 ml de medio de cultivo para una concentración final de 10 mg / ml. Si se utiliza BrdU, corregir la concentración de las diferencias en el peso molecular. Añadir medio con CldU a pocillos de cultivo e incubar el tejido con medio CldU contienen durante 2 horas a 35 ° C.
  3. Después de 2 horas de incubación a 35 ° C, se elimina el medio CldU contienen y reemplazar con medio de alimentación regular para reanudar el horario de alimentación normal (descrito anteriormente).

6. Fijación de tejidos y almacenamiento

  1. Establecer un calendario para la aplicación de los tratamientos y la fijación de las muestras de tejido antes de comenzar los experimentos de cultivo (Figura 2B).
  2. En un post-disección día predeterminado, a preparar el siguiente en un extractor de laboratorio: un vaso de precipitados de 10 a 50 ml que contiene 4% de paraformaldehído (PFA) en tampón fosfato salino (PBS); un vaso de precipitados vacío para medio de cultivo desechado; pequeñas pinzas; y una pipeta 1.000 ml con puntas desechables.
  3. Retire la placa de cultivo (s) de la cámara y la transferencia de incubación a una campana de humos. Incline los accesorios para placas de pozos individuales con fórceps. A continuación, utilice una pipeta para eliminar medio y transferencia cultura a un vaso de precipitados disposición. Incline la placa de cultivo en un ángulo para ayudar a asegurar que haya salido todo medio de cultivo.
  4. Termine de retirar medio de una placa de cultivo a la vez. Al medio se ha eliminado, añadir 1 ml de PFA al 4% a cada pocillo de cultivo y sellar bien la placa con parafilm. Repita para tantas placas de cultivo como las placas necesarias y traslado al refrigerador a 4 ° C durante 24 horas.
  5. Después de 24 horas, prepare la siguiente en una campana de humos: 10-50 vaso ml contiene 0,1% de azida sódica en PBS; un vacíovaso de precipitados de PFA descartado (las medidas de seguridad cuando no funcione sustancias tóxicas); pequeñas pinzas; y 1.000 ml pipeta con puntas desechables.
  6. Siga el procedimiento descrito en 6.4 para añadir PFA, pero añadir 1 ml de PBS con azida de sodio en su lugar. Una vez que las placas así sellar completamente transferido, para uso futuro por envolver bordes en Parafilm y almacenar en el refrigerador a 4 ° C.

7. seccionar los tejidos para inmunohistoquímica

  1. Realizar el tejido seccionado usando un vibratome. La siguiente serie de pasos ayudan a maximizar el rendimiento de las secciones de tejidos utilizables de cultivos organotípicos.
    NOTA: Inmediatamente después de la disección del hipocampo y de las planchas de las rebanadas, el tejido tiene un espesor de aproximadamente 400 micras. Sin embargo, después de 2-3 semanas en la cámara de incubación, rodajas de tejido comenzarán a aplanar, resultando en un espesor sección final de 150-300 micras.
  2. Prepare los siguientes elementos a la sección tejido cultivado: un bisturí nº 11 blade y manejar, una placa de Petri de vidrio que contiene el hielo frío PBS, una pinza de micro-disección, y una etapa de corte vibratome limpio para montar el tejido.
  3. Utilice un bisturí para cortar cuidadosamente a lo largo del perímetro de la membrana de inserción circular de modo que se puede extraer de la carcasa de inserción de plástico. Deje un amplio espacio entre la rebanada culta y el bisturí.
  4. Transferir la membrana de inserción individual de una placa de Petri que contiene PBS. Después de lavado en PBS, el uso de fórceps para transferir la membrana a la etapa de montaje vibratome.
  5. A continuación, utilice el bisturí para eliminar el exceso de membrana que rodea las rebanadas cultivadas y cortar el exceso de material para crear bordes limpios. Este paso se asegurará de la membrana es plana y se puede adherir fácilmente a la superficie de corte.
  6. Coloque 1-2 gotas de adhesivo en la etapa de corte vibratome y extendido en capa uniforme usando una aguja 22 G. Extender el adhesivo en una forma rectangular con el borde largo paralelo a la cuchilla de corte de la vibratome. Realice este pasorápidamente, para evitar que el adhesivo se seque.
  7. El uso de fórceps para transferir la membrana recortada contiene rodajas de hipocampo a la etapa de corte y con cuidado colocar la membrana en la cola y asegurarse de que no haya burbujas de aire.
  8. A medida que el pegamento se seque, transferir la etapa vibratome con la membrana pegada de nuevo al plato que contiene PBS Petri. Preparar la hoja vibratome y que contiene azida de sodio 48 placa de pocillos para almacenar las secciones de tejido.
  9. Utilice la vibratome para generar 30 micras secciones de tejido de cortes organotípicos y la transferencia a una que contiene azida de sodio 48 placa de pocillos para el almacenamiento y posterior tinción inmunohistoquímica.
  10. Consulte preexistentes protocolos de 26,29 tinción inmunohistoquímica.

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Resultados

Determinar si los cultivos organotípicos serían adecuadas para la investigación neurogénesis adulta requiere que cumplan dos criterios principales: 1) que las rebanadas mantienen rasgos morfológicos característicos de rodajas de hipocampo después de 10 a 21 días in vitro (DIV), y 2) que los PED recién nacidos pueden ser cuantificados mediante técnicas de inmunohistoquímica convencionales empleados habitualmente en la investigación neurogénesis adulta. Con respecto al primer criterio, la Figura 1A

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Discusión

Después de CldU (o BrdU) administración, la línea de tiempo de aplicación de agentes farmacológicos puede ser elegido para dirigir PED recién nacido durante particulares ventanas de desarrollo. Por ejemplo, un agente hipotético se puede aplicar durante la segunda semana post-inyección CldU, que se propone para coincidir con la edad de las neuronas inmaduras que se encuentran en una etapa de desarrollo en que se GABA despolarizante. Futuros estudios que utilizan este protocolo podrían adaptar el agente farmacológico y la...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación MOP 119271 a JMW por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud. Los autores desean dar las gracias a la Sra. Yao Fang Tan por su excelente asistencia técnica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
5-cloro-2'-desoxiuridina (CldU)MP Biomedicals105478Peligroso, cancerígeno
Insertos de cultivo celular, 30 mm de diámetro, 0,4 y micro; m tamaño de poroThermo scientific 140660El recubrimiento delta de Nuclon en estos insertos proporciona una mejor adhesión del tejido y mejora la calidad de las lonchas.
Tubos de centrífuga cónicos (estériles)Fisher Scientific14-432-22
(inclinadas hacia los lados)Fine Science Tools 14082-09
Medio esencial mínimo (MEM)Gibco11095; líquidoAlmacenar a 4 & grados; C
Microscopio fluorescente Eclipse Ni-UNikon
Glue for tissueKrazy GlueKG585Utilice una cantidad mínima de pegamento para lograr la adhesión, ya que cualquier tejido expuesto al pegamento será inutilizable para IHC.
Hank' s Solución salina equilibrada (HBSS) (500 ml)Gibco14025-092Almacenar en 4 ° C
Suero de caballo inactivado por calor (500 ml)Gibco16050-122Haga alícuotas de 50 ml y almacene a -20 ° C
KimwipesKimberly-ClarkeTW 31KYPBX
Pipetas de vidrio modificado (se quitó la parte inferior de la pipeta Pasteur y se alisó el borde con llama Bunsen)
Placa de Petri (100 mm x 15 mm) y (60 mm x 15 mm)FB0875712 y FB0875713Amarca Fisher
#11Fine Science Tools10011-00
Mango de bisturí #3Fino Herramientas científicas10003-12
Pipetas serológicasSorfa Medical Plastic Co.P8050
Pinza de patrón estándarFine Science Tools11000-12
Filtro de vacío estérilThermo-Scientific565-0020
Tijeras quirúrgicasFine Science Tools14054-13
Unidad de filtro accionada por jeringaMillipore-MillexSLGP033RS
Picadora de tejidos con platina móvilStoelting& nbsp;51425
Pincel de punta fina
Tijeras de disector Hojas de bisturí de la

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