Aquí se describe una técnica para el estudio de la neurogénesis postnatal del hipocampo mediante la técnica de cultivo de cortes organotípicos. Este método permite la manipulación in vitro de la neurogénesis adulta y permite la aplicación directa de agentes farmacológicos para el hipocampo cultivadas.
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Artículo de método
Culturas organotípicos rebanada de Estudios de Postnatal neurogénesis
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Resumen
Resumen
Aquí se describe una técnica para el estudio de la neurogénesis postnatal del hipocampo en el cerebro de roedores mediante la técnica de cultivo de cortes organotípicos. Este método mantiene la morfología característica topográfica del hipocampo al tiempo que permite la aplicación directa de agentes farmacológicos a las desarrollo giro dentado del hipocampo. Además, los cultivos de cortes se pueden mantener durante un máximo de 4 semanas y por lo tanto, permiten a uno a estudiar el proceso de maduración de las neuronas granulares nacidos. Cultivos de cortes permiten la manipulación farmacológica eficaz de los cortes de hipocampo excluyendo variables complejas tales como las incertidumbres relacionadas con la localización anatómica profunda del hipocampo, así como la barrera hematoencefálica. Por estas razones, hemos tratado de optimizar cultivos de cortes organotípicos específicamente para la investigación neurogénesis postnatal.
Introducción
La neurogénesis adulta en el hipocampo de los mamíferos representa un ejemplo notable de la capacidad innata del cerebro para la adaptabilidad y la plasticidad. Las células granulosas dentadas (DGC) se generan a partir de un grupo renovable de células progenitoras neurales en el giro dentado del hipocampo, que es una de las dos regiones neurogénicas actualmente bien caracterizadas en el cerebro de los mamíferos, y se cree que es particularmente importante para el aprendizaje y la memoria. El hipocampo es parte del sistema límbico y tiene una ubicación profunda dentro del cerebro de los mamíferos, lo que lo convierte en un objetivo difícil para la manipulación farmacol....
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Protocolo
NOTA: Todos los animales procedimientos se ajustaban a las normas de salud y bienestar de los animales del Departamento de Medicina Comparada en la Universidad de Toronto.
1. Preparación del hipocampo rebanadas
- Esterilizar los siguientes instrumentos utilizando el autoclave seco a 125 ° C: mango de bisturí (# 3) (2), fórceps patrón estándar, grande (1), pequeña tijera de disección (angulado a lado) (1), Micro cuchara (cuchara y plana extremos espátula) (1), Micro-espátulas (redondeadas y redondeados extremos afilados) (2), Cena de pincel (1), Fuego pulido pipeta Pasteur (2), plazas de gasa, 2 x 2 pulgadas (5).
- Cuando ....
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Resultados
Determinar si los cultivos organotípicos serían adecuadas para la investigación neurogénesis adulta requiere que cumplan dos criterios principales: 1) que las rebanadas mantienen rasgos morfológicos característicos de rodajas de hipocampo después de 10 a 21 días in vitro (DIV), y 2) que los PED recién nacidos pueden ser cuantificados mediante técnicas de inmunohistoquímica convencionales empleados habitualmente en la investigación neurogénesis adulta. Con respecto al primer criterio, la Figura 1A
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Discusión
Después de CldU (o BrdU) administración, la línea de tiempo de aplicación de agentes farmacológicos puede ser elegido para dirigir PED recién nacido durante particulares ventanas de desarrollo. Por ejemplo, un agente hipotético se puede aplicar durante la segunda semana post-inyección CldU, que se propone para coincidir con la edad de las neuronas inmaduras que se encuentran en una etapa de desarrollo en que se GABA despolarizante. Futuros estudios que utilizan este protocolo podrían adaptar el agente farmacológico y la.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación MOP 119271 a JMW por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud. Los autores desean dar las gracias a la Sra. Yao Fang Tan por su excelente asistencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5-cloro-2'-desoxiuridina (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Peligroso, cancerígeno |
| Insertos de cultivo celular, 30 mm de diámetro, 0,4 y micro; m tamaño de poro | Thermo scientific | 140660 | El recubrimiento delta de Nuclon en estos insertos proporciona una mejor adhesión del tejido y mejora la calidad de las lonchas. |
| Tubos de centrífuga cónicos (estériles) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| (inclinadas hacia los lados) | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Medio esencial mínimo (MEM) | Gibco | 11095; líquido | Almacenar a 4 & grados; C |
| Microscopio fluorescente Eclipse Ni-U | Nikon | ||
| Glue for tissue | Krazy Glue | KG585 | Utilice una cantidad mínima de pegamento para lograr la adhesión, ya que cualquier tejido expuesto al pegamento será inutilizable para IHC. |
| Hank' s Solución salina equilibrada (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Almacenar en 4 ° C |
| Suero de caballo inactivado por calor (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Haga alícuotas de 50 ml y almacene a -20 ° C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Pipetas de vidrio modificado (se quitó la parte inferior de la pipeta Pasteur y se alisó el borde con llama Bunsen) | |||
| Placa de Petri (100 mm x 15 mm) y (60 mm x 15 mm) | FB0875712 y FB0875713A | marca Fisher | |
| #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Mango de bisturí #3 | Fino Herramientas científicas | 10003-12 | |
| Pipetas serológicas | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Pinza de patrón estándar | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Filtro de vacío estéril | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Tijeras quirúrgicas | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Unidad de filtro accionada por jeringa | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Picadora de tejidos con platina móvil | Stoelting& nbsp; | 51425 | |
| Pincel de punta fina |
Referencias
- Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D.
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Reimpresiones y permisos
